全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 1023 - 1028
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 28; 修回日期 : 2007 - 04 - 223 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: shiyf2002@ vip1sina1com)
土壤中分泌嗜铁素细菌的筛选及影响其分泌因素的
研究
梁建根 , 竺利红 , 吴吉安 , 李孝辉 , 桑金隆 , 姚杭丽 , 施跃峰 3
(浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所 , 杭州 310021)
摘 　要 : 对土壤中分泌嗜铁素的细菌进行了筛选并初步研究了影响其分泌的因素。结果表明 , 采用经
典的铬奥醇 CAS ( chrome azurol S) 选择性培养基法 , 并结合培养液在紫外灯下有无黄绿色的荧光产生法 ,
这两种筛选方法的结果是相吻合的。从嗜铁素产生光吸收峰的数量与强度可以断定 , 不同的 pH值会产生
不同分子结构的嗜铁素 , pH 813最适合试验菌 HZX225产生嗜铁素。SM是最适合富产嗜铁素的培养基。C /
N比 10∶1最适合菌株 HZX225分泌嗜铁素。不同外源氨基酸对嗜铁素产生有着不同作用。嗜铁素上清液都
显著地抑制了 5种植物病原菌的菌丝生长 ( P = 0105)。
关键词 : 细菌 ; 嗜铁素 ; 筛选 ; 分泌因素
中图分类号 : S 63; S 606; Q 935　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0421023206
Stud ies on Screen ing of S iderophore Produc ing Bacter ia in the So il and Fac2
tors Influenc ing Its Secretion
L IANG J ian2gen, ZHU L i2hong, WU J i2an, L I Xiao2hui, SANG J in2long, YAO Hang2li, and
SH I Yue2feng3
( Institu te of P lant Protection and M icrobiology, Zhejiang A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Hangzhou 310021, China)
Abstract: Screening of siderophore p roducing bacteria in the soil and factors influencing its secretion
were studied. Results of two methods using selected2medium CAS ( chrome azurol S) and fluorescence obser2
vation under violet light to screen siderophore p roducing bacteria were consistent. By the virtue of quantity and
intensity of siderophore absorbance apex, it is concluded that different molecular structures of siderophore ap2
peared under different pH values. In addition, pH 813, SM medium and C∶N ratio of 10∶1 rep resented the
op timum to p roduce siderophore, respectively. D ifferent exogenous am ino acids had different effects on p ro2
duction of siderophore. Supernatant of siderophore had a significantly inhibitory effect on five different phyto2
pathogenic moulds growth.
Key words: Bacterium; Siderophore; Screening; Secreting factors
嗜铁素 ( Siderophore) 一般是指由微生物在低铁条件下合成的一类小分子量、能特异螯合 Fe3 +的
螯合物。关于嗜铁素的研究 , 国外起步较早。就其功能来讲 , 它不但是依赖受体的高亲和性的铁转运
系统 , 还是生长因子或萌发因子 , 也可以是抗生素或毒力因子。嗜铁素可以分为由细菌产生的和由真
菌产生的两大类。
在能产生嗜铁素的细菌中以假单胞杆菌居多 , 而分泌嗜铁素是其控制真菌病害的一种主要机制。
近年来嗜铁素除了在生物防治方面的应用越来越多外 , 还广泛应用于医药等领域 (Roosenberg et al. ,
2000)。由此可见 , 嗜铁素是一种很有开发和利用价值的新型微生物药物。
作者对土壤中分泌嗜铁素的细菌进行了筛选 , 并对影响其分泌嗜铁素的因素进行了初步研究 , 为
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其开发利用提供理论依据与技术支持。
1　材料与方法
111　材料
选取浙江省农业科学院农场、杭州市蔬菜研究所、下沙乔司农场等菜田表层土 ( 5～15 cm ) 随
机取样 , 将样品放在牛皮袋中 , 带回试验室备用。
112　嗜铁素产生细菌的筛选与鉴定
参照 Schwyn和 Neilands ( 1997) 的方法 , 将已分离保存的细菌接于铬奥醇 CAS ( chrome azurol
S) 培养基上 , 以大肠杆菌 ( E. coli) 作为对照 , 28℃培养 48～72 h, 观察菌落周围的颜色变化。再
参照杨合同等 (1994) 的方法对筛选到的嗜铁素产生菌进一步验证 , 于紫外灯下观察培养液 , 看有
无黄绿色荧光产生。
细菌鉴定依据 《伯杰氏细菌鉴定手册 》进行 (Holt et al. , 1994)。
113　影响嗜铁素分泌的各因素的研究
以在 CAS培养基上产生橘黄色晕圈最大 , 并且在紫外灯下有强的荧光产生的菌株 HZX225为样
本 , 分别对其吸收光谱特征 , pH值、不同培养基、C /N比、外源氨基酸对其分泌嗜铁素的影响及嗜
铁素抗菌谱和抗菌活性进行初步研究 , 具体操作如下。
将嗜铁素产生菌 HZX225分别接种在 pH值为 310、712、813和 1310的琥珀酸钠培养基中 , 摇床
(200 r/m in, 28℃) 培养 24～36 h后 , 将培养液于冷冻离心机 (10 000 r/m in, 4℃) 中离心 10 m in,
用岛津 UV22450紫外可见分光光度计 200～800 nm间作光谱扫描 , 观察其吸收光谱特征。
将嗜铁素产生菌 HZX225分别在 pH值为 2、4、6、7、8、813、9、11和 13的琥珀酸钠培养基中
培养 (培养前后操作同前 ) , 最后于岛津 UV22450紫外可见分光光度计 400 nm处测其上清液吸光度
值。
将供试菌株 HZX225等量接种于相同体积的 SM (琥珀酸钠培养基 ) (杨合同 等 , 1994)、修改的
SM ( Sayyed & Chincholkar, 2006)、NB (牛肉膏蛋白胨液体培养基 )、KMB (金氏培养基 )、LB、CM
(柠檬酸培养基 ) 和 PDB (马铃薯葡萄糖液培养基 ) (李海涛 等 , 2005) 7种培养基中 (培养与吸光
度测定的操作同前 )。
配置不同 C /N比的琥珀酸钠培养基 (pH 813) , 使 C /N比分别为 3∶1、5∶1、8∶1、10∶1、13∶1和
15∶1, 分别接种等量的嗜铁素产生菌 HZX225 (培养与吸光度测定的操作同前 )。
在琥珀酸钠培养基 (pH 813) 中分别加入不同质量的谷氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨
酸、甲硫氨酸、苏氨酸、白氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和叶酸 , 配制成氨基酸浓度都为 10μmol·L - 1
的培养液 50 mL, 分别接种等量菌株 HZX225 (培养与吸光度测定的操作同前 )。
在装有 40 mL PDB培养基的三角瓶中分别加入 5个直径为 6 mm的植物病原菌菌块作为对照 , 分
别是刺腐霉 ( Pyth ium ultim um ) , 禾谷镰刀菌 ( Fusa rium gram inearum ) , 黄瓜灰霉病菌 (B otry tis cine2
rea) , 黄瓜枯萎病菌 ( Fusarium oxysporium Schl. f. sp. cucum erinum ) 和辣椒枯萎病菌 ( Fusarium ox2
ysporum Schl. f. sp. vasinfectum )。处理为在装有 30 mL PDB + 10 mL嗜铁素上清液的三角瓶中加入等
量植物病原菌菌块。于摇床 (90 r/m in, 25℃) 中培养 5 d后 , 滤纸过滤 , 置于 105℃烘干 , 称质量
后作统计分析。
所有试验每处理 3次重复。
114　数据分析
测定数据用 DPS软件进行处理与分析 , 方差分析采用 Duncanpis新复极差法检测 (唐启义和冯明
光 , 1997)。
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2　结果与分析
211　嗜铁素分泌菌的定性分析
CAS琼脂培养基中因含有 CAS、十六烷基铵 (HDTMA ) 及 Fe3 +的三元复合物而呈蓝色。当更强
的螯合剂将铁从该复合物中移出时 , 颜色会由蓝色转为橘黄色 (D riane et al. , 1999)。
在 KMB培养基上分离到的细菌在 CAS琼脂培养基上长势良好 , 培养 2 d后观察到在 9株菌落周
围有明显的橘黄色的透明晕圈生成 (图 1) , 加长培养时间 , 该晕圈变化不大。作为对照的 E1coli菌
图 1　嗜铁素分泌菌在 CAS培养基上产生的橘黄色透明晕圈
F ig. 1　The orange teliospores on CAS m ed ium
在该培养基上 , 菌落周围无明显的晕圈生成。因此可断定产生橘黄色晕圈的细菌在生长过程中分泌了
对铁有较高亲和力的嗜铁类物质 , 即嗜铁素。
试验中能产生嗜铁素的菌株及产生的晕圈大小情况见表 1。
此外 , 各个产生晕圈的菌株培养液在紫外灯下观察 , 都有黄绿色的荧光产生 , 这进一步证实了菌
株产生嗜铁素的可能性。
表 1　嗜铁素产生菌及产生的晕圈大小情况
Table 1　The siderophore produc ing bacter ia and size of the ir ha los
菌株编号
Code
晕圈的大小
Size of halo
菌株编号
Code
晕圈的大小
Size of halo
菌株编号
Code
晕圈的大小
Size of halo
HZX225 + + + HZD28 + + HZS23 +
HZX221 + + QZY23 + HZX235 +
HZW 25 + + HZB22 + E. coli -
HZM22 + +
　　注 : - 无晕圈 ; +晕圈小 ; + +晕圈中等大 ; + + +晕圈很大。
Note: - , No halo; + , Small halo; + + , Large halo; + + + , Fairly large halo.
212　嗜铁素分泌菌的鉴定结果
筛选出的 9株嗜铁素分泌菌的染色、形态和培养特征 : 均为革兰氏阴性杆菌 , 大小在 015～018
μm ×115～310μm间 , 1～4根极生鞭毛 , 有荚膜 , 无芽孢 , 在 NA平板上菌落呈乳白色、圆形、有
突起 , 透明或半透明 , 菌落直径为 015～1 mm; 在 KMB培养基上产生黄绿色的荧光。
生理生化测定结果 (表 2) 表明 , 氧化酶和接触酶反应呈阳性 , 能还原硝酸盐 , 对葡萄糖不发酵
及在 pH 415的肉汤培养基上不生长。
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　　依据 《伯杰氏细菌鉴定手册 》, 可确认筛选出的 9株嗜铁素分泌菌为假单胞菌属细菌 ( Pseudo2
m onas spp. )。
表 2　筛选的植物生长促生细菌 ( PGPR) 的生理生化特性
Table 2　Physiolog ica l and b iochem ica l character istics of selected plan t growth2prom oting bacter ia
试验项目
Test item s
供试菌株特征
Characteritics of used strains
试验项目
Test item s
供试菌株特征
Characteritics of used strains
氧化酶 Oxidase + 碳源利用 Carbon utilization
接触酶 Peroxidase + 葡萄糖发酵 Glucose fermentation -
硝酸盐还原 N itrate reduction + 葡萄糖氧化 Glucose oxidation +
淀粉水解 Starch hydrolysis - 乳糖 Lactose +
明胶水解 Gelatin hydrolysis - D - 半乳糖 D2galactose -
精氨酸双水解 A rginine dihydrolysis - 麦芽糖 Maltose +
V2P实验 V2P reaction + 木糖 Xylose -
柠檬酸盐利用 Citrate utilization + 肌醇 Inositol -
几丁质水解 Chitin hydrolysis + 甘露醇 Mannitol +
纤维素水解 Cellulose hydrolysis - 山梨醇 Sorbitol +
丙二酸盐利用 Malonate utilization + pH 415生长 Growth at pH 415 -
耐 215%NaCl Growth in 215% NaCl - 41℃生长 Growth at 41℃ +
　　注 : + , 阳性 ; - , 阴性。
Note: + , Positive; - , Negative.
213　pH值对嗜铁素分泌的影响
　　菌株 HZX225嗜铁素上清液 ( pH 813) 的光
吸收特征曲线见图 2, 分别在 22410、 26410 和
40010 nm附近有 3个吸收峰 , 这与相关报道 (杨
合同 等 , 1994; Sayyed & Chincholkar, 2006) 基
本吻合。
在 pH 310的溶液中 , 在 22410 nm附近有一
个吸收峰。在 pH 712的溶液中 , 分别在 22410、
26410和 40010 nm附近有 3个峰。在 pH 1310的
溶液中 , 在 22410 nm附近有一个吸收峰值。这表
明不同的 pH值条件下 , 产生了不同分子结构的
嗜铁素。
图 2　嗜铁素光吸收特征
F ig. 2　Absorbance character istic of siderophore
　　pH值对光吸收峰影响的总趋势是 , pH值由小到大变化 , 光吸收峰由短波长向长波长再向短波长
方向变化。
目测不同 pH值的离心上清液 , pH为 2、4、11和 13的为浅黄色 , pH为 6、7、8、813和 9的为
深黄绿色 , 并且 pH 813的颜色最深。在 400 nm处嗜铁素吸光度值随着 pH的的增加而变化 , 总的趋
势为先上升后降低 , 于 pH 813时达到最大值 0189, 并与其它 pH下的吸光度值 (0172、0166、0160、
0151、0105、0104、0103、0102) 呈显著性差异。
这表明 pH 813在试验的所有 pH值中最适合菌株 HZX225分泌嗜铁素。
214　培养基种类对嗜铁素分泌的影响
试验结果表明 : 在 400 nm 处嗜铁素上清液吸光度值在各种培养基中由大到小的顺序为 , SM
(0171) >修改的 SM ( 0154) > CM ( 0141 ) > NB ( 0137) > KMB ( 0133) > LB ( 0113) > PDB
(0109) , 相互间差异均达显著水平。
由此说明 , SM在所试的 7种培养基中是最适合菌株 HZX225分泌嗜铁素的培养基。
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215　C /N比对嗜铁素分泌的影响
不同 C /N比对嗜铁素分泌的影响 , 400 nm处嗜铁素上清液吸光度值先随着 C /N比的增加而增
大 , 于 C /N比 10∶1时达到最大值 2135, 随后又降低 , 并与其它 C /N比下的吸光度值 (2126、2105、
1136、0191、0154、0122) 呈显著性差异。这说明 C /N比 10∶1最适合菌株 HZX225分泌嗜铁素。
216　外源氨基酸对嗜铁素分泌的影响
试验结果表明 , 胱氨酸 (1128)、苏氨酸 (1111)、白氨酸 (1104) 和赖氨酸 (0195) 能促进该
细菌分泌更多的嗜铁素 , 并与对照 (0186) 差异达显著水平。与对照相比 , 其增加量分别为 4817%、
2911%、2019%和 1014%。而其他氨基酸反而抑制其分泌嗜铁素。说明 , 不同外源氨基酸对嗜铁素
分泌有着不同作用。
217　嗜铁素的抗菌活性
嗜铁素抗菌活性的研究结果 (表 3) 表明 , 含有嗜铁素上清液的培养基对应吸光度值 ( 3175、
4125、4175、3150、3125) , 与各自的对照吸光度值相比 ( 8125、 10100、 6150、 4175、 4125 ) ,
显然都显著地抑制了 5种植物病原菌 (刺腐霉、禾谷镰刀菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌和辣
椒枯萎病菌 ) 菌丝的生长 ( P = 0105 ) , 其抑制率分别为 5415%、 5715%、 2710%、 2613%和
2315%。其中对刺腐霉和禾谷镰刀菌抑制效果最好 , 抑制率达到半数以上 , 这与先前平板对峙试
验结果一致。
表 3　嗜铁素上清液的抗菌活性研究
Table 3　An tifunga l activ ity of siderophore2con ta in ing superna tan t
植物病原菌 Phytopathogenic mould
菌丝生长量 Mycelial growth ( g/L)
有嗜铁素存在
The p resence of siderophore
无嗜铁素存在
The absence of siderophore
刺腐霉 Pyth ium ultim um 3175 ±01023 8125 ±0102
禾谷镰刀菌 Fusarium gram inearum 4125 ±01023 10100 ±0102
黄瓜灰霉病菌 B otrytis cinerea 3175 ±01013 6150 ±0103
黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporium Schl1f1 sp1cucum erinum 3150 ±01013 4175 ±0
辣椒枯萎病菌 Fusarium oxysporum Schl1f1 sp1vasinfectum 3125 ±01013 4125 ±0
　　3 用嗜铁素处理的与对照差异显著 ( P = 0105) , n = 3。3 Test results are significantly different from control ( P = 0105) , n = 3.
从上述各项研究结果可看出 , 分泌嗜铁素细菌的筛选采用晕圈的大小与黄绿色的颜色深浅的肉眼
观察 , 结果往往与嗜铁素的实际含量有偏差 , 所以定性观察要结合定量方法 , 这样才能准确地评价菌
株分泌嗜铁素的能力。嗜铁素的理化性质研究结果对于优化菌株发酵条件 , 提高嗜铁素产量以及对植
物病害的有效防治等深入研究 , 提供了科学依据和技术支持。
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