全 文 ：园 艺 学 报 2007, 34 (4) : 985 - 990
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 02 - 13; 修回日期 : 2007 - 05 - 28
基金项目 : 西南大学博士启动基金项目 (2004博 04)3 同为第一作者 Contributed equally to this work3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: limy@ swau1cq1cn)
GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的
影响
郑亚东 13 , 郭余龙 13 , 陈 旭 2 , 李艳冬 1 , 欧建龙 3 , 李名扬 13 3
(1西南大学园艺园林学院 , 重庆 400715; 2 重庆市农作物生物工程中心 , 重庆 400055; 3 重庆市农业技术推广总站 ,
重庆 400020)
摘 要 : 利用农杆菌介导法将 GhMADS3基因转入矮牵牛。对 14株转基因植株进行分析鉴定 , GUS染
色表明外源基因在转基因植株中表达 , PCR检测显示 GhMADS3整合到矮牵牛的基因组中 , RT2PCR分析表
明 GhMADS3在转基因植株中表达。转基因植株花器官普遍较野生型小 , 花萼膨大、顶尖向内弯翘 , 花冠深
裂且边缘伴有不规则褶皱 , 柱头裸露在外 , 花器官颜色较野生型变淡甚至完全白化。测定花瓣、花萼中花
色素苷和花萼中叶绿素含量 , 结果表明转基因植株均较对照偏低。说明 GhMADS3的导入使得矮牵牛花形、
花色发生改变。
关键词 : 矮牵牛 ; 花色 ; 花形 ; MADS2box; GhMADS3
中图分类号 : S 68116 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2007) 0420985206
Effects of G hM ADS3 Gene Con stitutive Expression on Flower Shape and
Color of Petun ia
ZHENG Ya2dong13 , GUO Yu2long13 , CHEN Xu2 , L I Yan2dong1 , OU J ian2long3 , and L IM ing2yang13 3
(1 College of Horticulture and Landscape, Southw est U niversity, Chongqing 400715, Ch ina; 2 Chongqing Center of B io2engineer2
ing for C rops, Chongqing 400055, China; 3 Chongqing A cadem y of A gricultural Technology Prom otion, Chongqing 400020,
China)
Abstract: An AGAMOUS homologue (GhMADS3) was introduced into petunia via Ag robacterium tum e2
faciens mediated method. Forteen independent kanamycin2resistant petunia p lantswere alive. GUS staining re2
vealed that ectop ic gene was exp ressed in transgenic p lants. PCR detection showed that the GhMADS3 was in2
tegrated into their genomes. The exp ression of the GhMADS3 was detected by RT2PCR. Constitutive exp ression
of GhMADS3 resulted in visible phenotyp ic alterations in floral organ. In transgenic petunia p lants, GhMADS3
resulted in the sepals swelling, corolla smaller and corolla deep sp liting. It was noteworthy that the color of
transgenic floral organ became weaker or entirely pale. The measuration of anthocyanin and chlorophyll showed
that the content in transgenic p lants were greatly lower than wild2type. It also indicated that GhMADS3 in
p lants has some relationship with the formation of flower color.
Key words: Petunia; Flower color; Flower shape; MADS 2box; GhMADS3
花形和花色是观赏植物重要的质量指标 , 也是花卉基因工程改良的重点内容。近年来 , 一些与植
物花形、花色形成相关的基因相继被分离和克隆 , 并进入花卉改良的研究 (黄春琼 等 , 2006; 吴江
等 , 2006; 张晶晶 等 , 2006)。在花发育过程中 , MADS 2box基因扮演着十分重要的角色。MADS 2box
基因是指含有保守的 DNA结合域 MADS盒的转录调控因子 , 它们广泛存在于真核生物界。MADS是
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由几个最初发现的成员酵母 M CM 1、拟南芥 AGAMOUS、金鱼草 D IF IC IEN S和人类 SR F的首字母组合
而来 ( Theiβen et al. , 2000)。根据对序列分析的结果 , MADS 2box基因分为 TYPEⅠ型和 TYPEⅡ型。
TYPEⅡ型除含有高度保守的 MADS区以外 , 还含有一个较为保守的 K区 , 和多变的 I区和 C区 , 故
又称为 M IKC型 (Nam et al. , 2004)。迄今所发现的与植物发育相关的 MADS 2box基因绝大多数为
M IKC型。TYPEⅠ型在植物中的功能所知较少。GhMADS3是典型的 M IKC型 MADS 2box基因 , 属 AG
亚家族 ( Guo et al. , 2007)。基因组研究显示拟南芥中 AG亚家族有 4个不同的基因 , 分别为 : AG,
S EEDSTICK (STK) , SHA TTERPROO F1 (SHP1) 和 SHP2。AG是最先克隆的 C类同源异型基因 , 负责
雄蕊和心皮的特化 ; SHP1和 SHP2编码两个功能冗余蛋白 , 负责果实离区的发育 ; STK决定胚珠的
特性。AG亚家族在种子植物中广泛存在 (Becker & Theiβen, 2003)。前人对 AG类基因的研究多集中
在其同源异型作用上 , 对其在花色形成中的作用未予重视。在前期研究中我们发现 GhMADS3在烟草
中异源表达不仅引起其花萼成柱头状、花器官成子房状等类似于 AG的花形改变 , 也使花萼和花冠白
化。作者认为在影响花形的同时其对花色形成是否存在影响值得进一步研究。
矮牵牛不仅是一种重要的观赏花卉 , 同时也是研究植物花发育及花色形成机制的重要模式植物
( Tom & M ichiel, 2005)。本研究将 GhMADS3转入矮牵牛 , 研究其组成型表达对其花形、花色的影
响 , 评价该基因在改变花形、花色方面的相关功能。
1 材料与方法
111 材料
矮牵牛 ( Petun ia hybrida) 株系 A01 (紫色 )、A04 (红色 ) , 根癌农杆菌 (A grobacterium tum efa2
ciens) LBA4404均由本实验室保存。GhMADS3由本实验室克隆 , 表达载体 pCMGM3由本实验室构建
(图 1)。
图 1 pCM GM 3质粒图谱
F ig. 1 Pla sm id map of pCM GM 3
112 矮牵牛的遗传转化
取无菌苗叶片 , 切成 015 cm2 , 将预培养至 OD600 = 110左右的农杆菌菌液离心 , 用 MS + AS 100
μmol·L∃ 1 +MES 011% (pH 710) 重悬至 OD600 = 012～015。侵染叶片 3～5 m in, 吸干外植体表面多
余的菌液 , 置于 MS1 (MS +BA 210 mg·L∃ 1 +NAA 011 mg·L∃ 1 ) 培养基上 23℃暗培养 3 d后 , 用
液体 MS + Cef 500 mg·L∃ 1脱菌 2 h, 用无菌水清洗 3次 , 吸干表面水分后接种到 MS2 (MS + BA 210
mg·L∃ 1 +NAA 011 mg·L∃ 1 + Kan 50 mg·L∃ 1 + Cef 200 mg·L∃ 1 ) 培养基上筛选分化芽 , 3周后继
代 , 待不定芽长至 1 cm以上时切下接入 MS3 (1 /2MS + Kan 10 mg·L∃ 1 + Cef 200 mg·L∃ 1 ) 培养基
进行生根培养 , 观察生根情况。
113 转基因检测
取抗性和对照植株的叶片浸于 X2Glu染色液中 , 37℃保温 3～12 h, 乙醇脱色 , 观察染色情况。
CTAB法提取转化植株总 DNA (王关林和方宏筠 , 2002)。PCR引物 Pa1: 5′2TCA AGT TAG GAA GCA
TGG TG23′, Pa2: 5′2CCC ATA ACA TTA GAC TAG TGA23′。预期扩增片段大小为 763 bp, 以 pBLGM3质
粒为阳性对照。扩增体积 25μL, 10 ×PCR缓冲液 215μL, Mg2 + 115 mmol·L∃ 1 , dNTPs 012 mmol·
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4期 郑亚东等 : GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响
L∃ 1 , 引物终浓度 1μmol·L∃ 1 , 模板 DNA 20 ng, Taq DNA聚合酶 2 U。扩增条件为 : 预变性 95℃,
5 m in; 95℃, 45 s; 56℃, 45 s; 72℃, 45 s, 30个循环 ; 72℃, 10 m in。
RNA提取用上海华舜生物工程有限公司小量植物 (叶 ) 总 RNA快速抽提纯化试剂盒 , 反转录用
Fermentas公司 RevertA idTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。取 115μL cDNA为模板 , 进行 PCR
反应 , 引物、反应体系及条件均同前。
114 花器官发育的阶段划分及花器官变异分析
参考孟祥春等 (2001) 的方法将花发育划分为 5个阶段 (表 1)。测量第 V阶段对照及转基因各
株系花冠的直径、花瓣的长度 , 两次重复。
用 DPS v3101统计软件对其变化作方差分析。
表 1 花器官 (花筒 ) 发育的阶段划分
Table 1 The flora l developm en ta l cla ssif ica tion
植物材料
Material
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
转基因植株 < 115 cm 115～215 cm 215～315 cm 花筒上部裂开 花药开裂前
Transgenic p lant Beginning of bloom ing Before anther dehiscing
对照 210～310 cm 310～410 cm 410～515 cm 花筒上部裂开 花药开裂前
W ild type (W T) Beginning of bloom ing Before anther dehiscing
115 花色素苷和叶绿素含量的测定
花色素苷含量测定参照孟祥春等 (2001) 的方法略有改动。称取盛开期的花朵花冠 /花萼 011 g
左右 , 剪碎置于 5 mL 1%盐酸甲醇提取液中暗光常温过夜 , 测定 530 nm处吸光值 (A )。设 A = 1为
1个花色素苷单位。对包括对照在内的共 16份材料进行测定 , 每个样品重复 3次。
叶绿素含量测定采用 A rnon法 (A rnon, 1949) , 共 16份样 , 每个样品重复两次。
用 DPS v3101统计软件对测量数据作方差分析。
2 结果与分析
211 矮牵牛的遗传转化及转基因检测
对转化后已生根的矮牵牛转化植株进行 GUS染色检验 (图 2)。
将 16株 GUS染色呈阳性的植株移栽到温室中 , 最终存活开花 14株 , 其中 A01 7株 , A04 7株
(表 2)。
表 2 GhMAD S3基因对花器官大小的影响
Table 2 Effect of GhMAD S3 gene on size of flora l ( cm)
矮牵牛
P1 hybrida 株系L ine 花冠直径D iameter of corolla 花瓣长度Length of petals 矮牵牛P1 hybrida 株系L ine 花冠直径D iameter of corolla 花瓣长度Length of petals
A01 7105 3100dD 3140bcAB A04 7401 0160dC 1160deD
7106 3180cC 3140bcAB 7402 5120abAB 4130abA
7108 3190cC 3190abAB 7404 4150bB 3160bcAB
7110 4180bB 3150abcAB 7408 1120cdC 3120cBC
7111 4110cBC 3110cB 7410 1160cC 2120dCD
7114 4120cBC 3160abcAB 7411 0180dC 1130eD
7116 2120eE 4120aA 7413 5140aAB 4140aA
W T 5182aA 4120aA W T 5189aA 4109abAB
注 : a, b, c, d表示 P = 0105水平下的差异显著性 ; A, B, C, D表示 P = 0101水平下的差异显著性。下同。
Note: a, b, c, d indicate significance of difference under P = 0105 level and A, B , C, D under P = 0101 level. The same below.
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PCR结果显示 14株矮牵牛中均可扩增出与
pBLGM3质粒的 PCR产物大小一致的片段 (图 3,
A) , 约为 750 bp (预期 763 bp ) , 阴性对照及水
没有出现该条带 , 表明目的基因 GhMADS3已转入
植株中。RT2PCR结果显示 , 14株转化株扩增片
段与 pBLGM3质粒的扩增产物大小一致 , 阴性对照
没有出现该条带 (图 3, B ) , 表明 GhMADS3在矮
牵牛中表达。 图 2 转基因植株叶片 GUS染色
F ig. 2 The GUS detection of tran sgen ic plan t
图 3 转化植株的 GhMADS3扩增检测 ( A) 和 RT2PCR检测 ( B)
CK + : 阳性对照 ; CK - : 阴性对照 ; H: 水对照 ; M : DNA ladder marker (DL2000) ; 1～14: 不同株系的转基因植株。
F ig. 3 The PCR ( A) and RT2PCR ( B) detection of tran sgen ic plan ts of GhMADS3
CK + : Positive control; CK - : Negative control; H: H2O; M: DNA ladder marker (DL2000) ; 1 - 14: Putative transgenic p lants.
212 转基因矮牵牛花形花色变异
与对照 (图 4, A、D) 相比 , 转基因矮牵牛花器官变化主要有 : 花萼膨大 (图 4, C) , 花萼顶
图 4 转基因植株的表型变异
A: A01对照 ; B、C: A01转 GhMADS3植株 ; D: A04对照 ; E、F: A04转 GhMADS3植株。
F ig. 4 The phenotypes of tran sgen ic plan ts of G hMADS3
A: The flower of wild type petunia (A01) ; B, C: The phenotypes of transgenic petunia (A01) of GhMADS3;
D: The flower of wild type petunia (A04) ; E, F: The phenotypes of transgenic petunia (A04) of GhMADS3.
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4期 郑亚东等 : GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响
尖向内弯翘 (图 4, F) ; 花冠变小 (图 4, C、F) , 花冠深裂 , 且边缘有不规则褶皱 (图 4, B ) ; 花
冠白化 (图 4, B、C、F) ; 柱头裸露在外 (图 4, C) 等。表 2结果显示 , 对照与转化株在成熟花的
花冠直径与花瓣长度上存在差异 , 转化株较对照偏低。转基因花冠直径最小仅为野生型的 10% , 花
瓣长度最小仅为野生型的 32%。说明 GhMADS3基因对矮牵牛花形产生影响。
213 G hM AD S3基因对矮牵牛花器官花色素苷和叶绿素含量的影响
表 3显示 , 转化植株花器官完全开放时的花瓣、花萼中花色素苷含量均较对照偏低 , A01、A04
两株系各转化植株花冠花色素苷含量 , 7110、7114、7402、7404、7408、7410、7413等转化植株花萼
花色素苷含量 , 较对照达到极显著水平。各转化植株花萼的叶绿素含量较对照偏低 (表 4) , 7108、
7110、7111、7114、7402等转化植株花萼中叶绿素 a含量 , 7110、7111、7114、7402等转化植株花
萼中叶绿素 b含量 , 较对照达到极显著水平。
表 3 G hMADS3基因对矮牵牛花器官花色素苷含量的影响
Table 3 Effects of GhMADS3 gene on an thocyan in s con ten t of petun ia flora l (Unit·g - 1 )
矮牵牛
P1 hybrida 株系L ine 花冠Corolla 花萼Calyx 矮牵牛P1 hybrida 株系L ine 花冠Corolla 花萼Calyx
A01 7105 46113bB 2119abAB A04 7401 16150bB 2104aAB
7106 45190bB 2109abAB 7402 1170cC 1137bC
7108 39137bB 2106abAB 7404 2117cC 1137bC
7110 3150cC 1104cC 7408 4173cC 1147bBC
7111 12157cC 2102abAB 7410 2130cC 1140bC
7114 4160cC 1175bB 7411 16143bB 1182abABC
7116 48147bB 2126aAB 7413 1100cC 1136bC
W T 66187aA 2137aA W T 23157aA 2123aA
表 4 GhMADS3基因对矮牵牛花萼叶绿素含量的影响
Table 4 Effects of GhMADS3 gene on chlorophyll con ten t of petun ia flora l (mg·g - 1 )
矮牵牛
P1 hybrida 株系L ine 叶绿素 aChlorophyll a 叶绿素 bChlorophyll b 矮牵牛P1 hybrida 株系L ine 叶绿素 aChlorophyll a 叶绿素 bChlorophyll b
A01 7105 0145abAB 0181abAB A04 7401 0143abA 0178aA
7106 0143bABC 0175bcAB 7402 0123cB 0142bB
7108 0141bcBC 0175bcAB 7404 0133abcAB 0162abAB
7110 0130dD 0154dD 7408 0136abcAB 0165abAB
7111 0141bcBC 0174bcBC 7410 0128bcAB 0157abAB
7114 0136cCD 0165cCD 7411 0137abcAB 0166abAB
7116 0147abAB 0184abAB 7413 0131abcAB 0159abAB
W T 0150aA 0191aA W T 0145aA 0181aA
3 讨论
花发育的 ‘ABC’模型最初把花器官决定的基因分成 A、B、C 3类 , 后来的研究将该模型发展为
‘ABCDE’模型。该模型认为 : A、B、C、D、E 5类基因在花发育过程中起着 5种 ‘同源异型功
能 ’, A决定萼片 , A +B + E决定花瓣 , B + C + E决定雄蕊 , C + E决定心皮 , D决定胚珠。除一些
A类基因 (如拟南芥中 AP2) 外 , 目前已报道的花器官特性基因均属于 MADS 2box家族 (Becker &
Theiβen, 2003)。本研究利用农杆菌介导法将 AG亚家族的 MADS 2box基因 GhMADS3转入矮牵牛。转
基因植株的花器官普遍较野生型小 ; 另外花萼有膨大、顶尖向内弯翘等变异 , 花冠有变小、深裂等变
异。表明 GhMADS3基因的异位表达对矮牵牛花形产生了影响。
值得注意的是 , 转基因植株的花冠均有白化现象 , 说明 GhMADS3基因的表达对矮牵牛花色也有
影响。花色主要由类黄酮、类胡萝卜素和生物碱 3类物质决定 (赵昶灵 等 , 2005)。类黄酮的次生
代谢物花色素苷是影响花着色的主要色素 (吴江 等 , 2006)。本试验结果表明 , 同等条件下转基因
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植株花朵中花色素苷含量明显低于对照植株 , 花冠花色素苷含量最低 , 仅为野生型含量的 4% , 花萼
花色素苷含量最低 , 为野生型的 44%。已有的研究表明 : 影响植物花色素苷含量的基因可分为结构
基因和调节基因 , 结构基因直接编码花色素苷代谢生物合成的酶类 ; 调节基因调节生物合成酶活性、
色素积累基因时空表达 (吴江 等 , 2006)。我们推测 AG亚家族基因的表达可能通过影响调节基因的
表达或其他途径 , 影响到花色素苷生物合成中编码某些酶的基因的表达 , 使花色素苷合成受到影响 ,
使得转基因植株中花色素苷含量较对照降低 , 从而使花冠出现白化。至于详细的控制通路尚待进一步
研究分析。
本试验结果还显示 , 转基因植株花萼中叶绿素 a和叶绿素 b含量均低于野生型。根据 Geothe等的理
论 , 花器官是变态的叶 (W eigel &Meyerowitz, 1994)。要使绿色的叶变成五颜六色的花 , 必然存在一些
调节基因抑制叶绿素合成的结构基因的表达、激活花色素合成的结构基因。目前 , 对花器官如何由绿色
的叶变化成彩色这一过程的研究报道还很少。我们推测在植物花色形成过程中 , AG类 MADS 2box基因发
挥了作用 , 其可能通过某些途径影响到叶绿素的生物合成 , 又进一步影响了花色的形成。
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