全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 879 - 884
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 04 - 01; 修回日期 : 2008 - 05 - 09
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30370976 ) ; 教育部留学回国人员科研启动基金项目 ; 山东省自然科学基金项目
( Y2002D04)3 E2mail: rwang@ qau1edu1cn
青花菜预冷后乙烯生成特性及受体基因的表达分析
王　然 13 , 王成荣 1 , 秦斐斐 1 , 加藤雅也 2 , 西川芙美惠 2 , 兵藤　宏 2
(1 青岛农业大学园艺学院 , 山东青岛 266109; 2 日本静冈大学农学部 , 日本静冈 836)
摘 　要 : 研究了青花菜采收预冷后置于 20 ℃下早期乙烯生成特性和乙烯受体基因的表达。结果表明 ,
乙烯生成速率在茎切面第一层 0～6 h明显上升 , 在小花中明显下降。ACC合成酶活性与乙烯生成速率的变
化一致。ACC含量在各组织中先上升后下降 , 以小花中最低。MACC含量以花头基部最低 , 小花中较高 ,
变化平稳。各组织中 ACC氧化酶活性在 0～12 h呈增加趋势 , 但小花明显高于茎组织 , 与乙烯生成速率变
化不一致。Northern杂交分析表明 , 茎切面第一层的 BO 2ACS1和 BO 2ACO2的 mRNA水平在 0 h时高于小
花 , 12 h时低于 0 h。小花中 BO 2ACS1 mRNA在 12 h增加不明显 , BO 2ACO2 mRNA增加明显。BO 2ETR1、
BO 2ERS和 BO 2ETR2在茎切面第一层 , BO 2ERS在小花中 , 转录物 12 h时均比 0 h有不同程度的增加 , BO 2
ETR2 mRNA仅在茎组织中检测到。
关键词 : 青花菜 ; 乙烯 ; 乙烯受体 ; 基因表达
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620879206
Character istics of Ethylene Production and Gene Expression of Ethylene
Receptors in Pre2cooled Broccoli ( B rassica ole racea L. var. ita lica )
WANG Ran13 , WANG Cheng2rong1 , Q IN Fei2fei1 , Masaya Kato2 , Fum ie N ishikawa2 , and H iroshi Hyodo2
(1D epartm ent of Horticulture, Q ingdao A gricu ltura l U niversity, Q ingdao, Shandong 266109, Ch ina; 2 Faculty of A griculture,
Shizuoka U niversity, 836 O hya, Sh izuoka 42228529, Japan)
Abstract: The characteristic of ethylene p roduction and gene exp ression of ethylene recep tors were stud2
ied in p re2cooled broccoli which were stored under 20 ℃. The results showed that during 0 - 6 h of storage,
the ethylene p roduction increased in the cross section of stem (0 - 2 mm ) , while decreased markedly in flo2
rets. Changes in the activity of ACC synthase were in agreement with those of the ethylene p roduction rate.
ACC content increased from 0 to 6 h and decreased from 6 to 12 h in all tested tissues. The florets had the
lowest level of ACC content. The MACC level in florets was relatively high and remained stable during the ex2
perimental period. The lowest level of MACC appeared in the basal portion of florets. Though it was signifi2
cantly higher in florets than that in the stem tissues, the activity of ACC oxidase increased from 0 to 12 h in all
tested tissues, which was inconsistent with the ethylene p roduction. Northern blot analysis showed that mRNA
levels of BO 2ACS1 and BO 2ACO2 in stem tissues were higher than that in florets at 0 h; mRNA levels at 12 h
were lower than that at 0 h. In florets, the mRNA level of BO 2ACS1 didnpit increase at 12 h, however mRNA
level of BO 2ACO2 increased significantly. The transcrip ts of BO 2ETR1, BO 2ERS , and BO 2ETR2 in the first
layer of the cross section of stem and the BO 2ERS in the florets were higher at 12 h than that at 0 h. The mR2
NA of BO 2ETR2 could be only detected in the stem tissues.
Key words: broccoli; ethylene; ethylene recep tor; gene exp ression
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
青花菜是由生长在肉质茎上的许多小花蕾组成 , 小花蕾被富含叶绿素的萼片所包被。收获后由于
萼片叶绿素的降解 , 使得花蕾很快衰老黄化。
研究表明 , 叶绿素的降解与小花的乙烯跃变相吻合 ( Kasai et al. , 1998)。外源乙烯和丙烯处理
加速了小花的黄化 ( King & Morris, 1994; Tian et al. , 1994)。用乙烯合成抑制剂 AVG或乙烯作用抑
制剂 Ag+ 、降冰片二烯、1 -甲基环丙烯等处理 , 则延缓了叶绿素的损失 (W ang, 1977; Ku & W ills,
1999)。外源乙烯能够刺激内源乙烯的生成 (Makhlouf et al. , 1989 ) , 增加组织对乙烯的敏感性
( Tian et al. , 1994)。早期的研究结果表明 , 小花的乙烯产生主要与 ACC氧化酶转录水平的提高和酶
活性的增加有关 ( Pogson et al. , 1995a; Kato et al. , 2002)。目前已从青花菜中克隆了两个 ACC合成
酶 (ACS) 基因 , 分别为 BO 2ACS1和 BO 2ACS2 ( Pogson et al. , 1995b; Kato et al. , 2002) , 3个 ACC
氧化酶 (ACO ) 基因 , 分别为 BO 2ACO1、BO 2ACO2和 BO 2ACO3 ( Pogson et al. , 1995a; Yang et al. ,
2003) , 这些基因的表达呈现出明显的组织和发育阶段特异性。
在许多高等植物上已经证明 , 乙烯的作用是通过乙烯合成和乙烯信号转导调控的。然而 , 大多数
有关乙烯信号转导的资料主要来自对拟南芥的分子生物学和遗传学研究。拟南芥的乙烯受体蛋白是一
个小的基因家族 , 包括 ETR1、ERS1、ERS2、ETR2和 E IN 4。对乙烯受体功能缺失体研究表明 , 这些
蛋白对乙烯反应是负调控。在拟南芥上诱导乙烯反应不是通过激活这些蛋白 , 而是使这些蛋白失活。
其中 ETR2、ERS1、ERS2是受乙烯调控 (Hua & Meyerowitz, 1998; Hua et al. , 1998)。目前已经从青
花菜中分离出 3个乙烯受体 cDNA, 分别为 BO 2ETR1、BO 2ETR2和 BO 2ERS ( Chen et al. , 1998a,
1998b; W ang et al. , 2002)。
青花菜采后预冷能有效地延长其货架期。有关青花菜采后乙烯生成及相关基因表达已有报道
( Kato et al. , 2002)。本研究主要探讨青花菜预冷后置 20 ℃条件下乙烯生成及受体基因表达的特性 ,
为进一步揭示青花菜采后衰老黄化的机理提供参考。
1　材料与方法
111　材料
试验于 2004—2006年在青岛农业大学园艺实验室进行。青花菜 (B rassica oleracea L. var. ita lica)
‘优秀 ’采自山东莱西基地。收获后装箱覆冰预冷运回实验室。将花头主茎重新切割后 , 放入 20 ℃、
相对湿度 90% ～95%的薄膜帐中 , 每 6 h取材 1次。
取茎切面第一层 (切伤面 0～2 mm)、茎切面第二层 (紧相邻的 2～4 mm) 和花头基部绿色部分
以及花头顶部中间部位的小花蕾 (图 1) 用于测定。除了用于测定乙烯的样品外 , 所有样品取后立即
用液氮速冻 , 置 - 80 ℃贮存备用。
112　测定方法
乙烯生成速率的测定 : 取 015 g材料放于 17 mL小瓶中 , 在 20 ℃下密闭 30 m in。由瓶顶部取气
1 mL注入气相色谱 (H itachi 163) 测定乙烯含量。每个样品 3次重复。
ACC合成酶活性的测定参考 Kato等 (2002) 的方法。每个样品重复 3次。
ACC含量分析采用 L izada和 Yang (1979) 的方法。2 mol·L - 1 HCl 100 ℃水解 ACC 3 h, NaOH
平衡后测定水解产物中 ACC含量 , 水解前后 ACC含量的差值为 MACC含量。每个样品重复 3次。
ACC氧化酶的提取参考 Kato等 ( 2002 ) 的方法。ACC 氧化酶活性测定参考 Kato 和 Hyodo
(1999) 的方法。每样品重复 3次。
113　RNA提取和 Northern杂交
总 RNA提取按照 Kato等 (2002) 方法。ACC合成酶、ACC氧化酶和乙烯受体的 cDNA片段扩增
及探针合成按照 Kato等 (2002) 和 W ang等 (2002) 的方法。
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2　结果与分析
211　乙烯生成速率的变化
如图 1和图 2所示 , 青花菜的乙烯生成速率 , 茎切面第一层从 0～6 h增加较快 , 之后增加缓慢 ;
第二层在 0～12 h增加缓慢 , 明显低于第一层 ; 花头基部最低 , 且增加不明显 ; 小花在 0～6 h下降较
快 , 之后变化不明显。
212　ACC合成酶活性变化及其基因表达
ACC合成酶活性变化与组织中乙烯释放速率变化曲线相吻合 (图 3) , 茎切面第一层 0～6 h内活
性增加较快 , 之后平缓 ; 第二层显著低于第一层 , 但高于花头基部 , 变化不明显 ; 小花在 0～6 h下
降较快 , 之后变化不明显。
Northern杂交分析表明 : 茎切面第一层 BO 2ACS1 mRNA水平 , 在 0 h时高于花头基部和小花 ; 12
h时明显降低 , 成为所检测的组织部位中最低的。花头基部 BO 2ACS1 mRNA水平 12 h时比 0 h有所增
加 , 小花组织中增加不明显 (图 4)。
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213　ACC和 M ACC含量变化
所测组织部位的 ACC含量在 6 h时均比 0 h有不同程度的增加 , 增加幅度从茎切伤面第一层到小
花依次降低 , 6 h后下降。其中 ACC水平较高的茎切面第一层和第二层下降幅度较大 (图 5)。
茎切面第一层 MACC含量在 0～6 h增加缓慢 , 随后加快 , 这与 ACC含量急剧下降相吻合。花头
基部 MACC含量低 , 增加幅度小 (图 5)。
图 5　青花菜预冷后在室温条件下 ACC和 M ACC含量变化
F ig. 5　T im e courses of ACC syn tha se activ ity ACC and M ACC levels
214　ACC氧化酶活性变化及基因表达分析
各组织中 ACC氧化酶活性均呈上升趋势 , 茎各部位明显低于小花。小花中 ACC氧化酶活性在
0～6 h快速增加 , 随后变平缓 (图 6) , 但与小花乙烯生成速率变化 (图 2) 不一致。
Northern杂交分析表明 (图 7) , BO 2ACO2 mRNA在茎切面第一层 0 h的累积明显高于所测定的其
他部位 , 12 h时累积减弱 , 而小花中的累积明显增强。
215　乙烯受体的基因表达分析
对已知的 3个乙烯受体 Northern杂交分析结果 (图 8) 表明 , 在茎切面第一层和第二层 BO 2ETR1
mRNA在 12 h的累积均比 0 h高 , 花头基部和小花变化不明显。
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　　BO 2ETR2 mRNA仅能在茎组织检测到 , 0～12 h其累积在第一层和第二层呈增强趋势 , 花头基部
变化不明显。
BO 2ERS2 mRNA除花头基部累积变化不明显外 , 在茎切面第一、二层和小花呈增加趋势 , 以小
花中的最低。
图 8　乙烯受体 BO 2ETR1、BO 2ETR2和 BO 2ERS Northern杂交分析
F ig. 8　Northern blot ana lysis for ethylene receptor tran scr ipts of
BO 2ETR1, BO 2ETR2 and BO 2ERS
3　讨论
Kato等 (2002) 对采后一直置于室温条件下的青花菜乙烯生成研究表明 , 茎切面 0～2 mm在采
后 12 h乙烯生成达到高峰 , 2～4 mm和花头基部的乙烯释放速率明显低于 0～2 mm , 变化曲线相似。
小花蕾乙烯释放高峰低于茎切面 , 时间滞后 12 h。本试验中采后经覆冰预冷的青花菜 , 放回到 20 ℃
条件下后 , 茎的乙烯释放变化与 Kato等 (2002) 的研究结果相似 , 前期呈增加趋势 , 特别是乙烯释
放速率在回到 20 ℃后 0～6 h增加尤为明显 ; 而小花在这个时期的乙烯释放与未预冷的不同 , 呈急剧
下降 , 6～12 h变化不明显。
经过预冷的青花菜回到 20 ℃条件下后 , ACC合成酶活性变化与乙烯生成表现了完全的一致性。
茎组织在转到常温时就已经累积了较高水平 ACC合成酶 (BO 2ASC1) mRNA , 12 h时 BO 2ASC1 mRNA
在茎切伤面第一层的累积已减弱 , 而在第二层和花头基部仍很高 , 此时花头基部和小花中 BO 2ASC1
mRNA水平比 0 h有所提高 , 但小花是所测组织中最低的 , 这说明第一层 ACC合成酶活性增加可能与
低温下累积较高的 BO 2ASC1转录产物有关。未经预冷的青花菜在采后初期 BO 2ASC1 mRNA水平较后
期低 ( Kato et al. , 2002)。Kato等 (2002) 的研究表明 , 采后 12 h BO 2ASC1 mRNA水平在茎组织中
均有明显增加 , BO 2ASC2 mRNA在切面第一层也有明显的增加 , 认为收获伤害快速诱导切面第一层
(0～2 mm) 和花头基部 ACS mRNA水平和酶活性的增加 , 从而导致了 ACC的累积。未经预冷的青花
菜其小花中 ACS活性和 BO 2ACS1 mRNA在整个衰老过程中无明显变化 , 但 ACO活性与 ACO转录物
水平的提高和乙烯释放量的增加相一致。认为小花中 ACO活性增强和 ACO转录物水平提高可能与茎
组织中伤害反应产生的 ACC和乙烯有关。经预冷的青花菜回到 20 ℃条件下 6 h后 , 从茎切伤面第一
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层到小花 ACC含量依次降低。小花中 ACC水平低 , 这除了与小花中 ACC合成酶活性低有关外 , 高水
平的 MACC可能也是原因之一。低水平的 ACC可能制约了乙烯释放 , 因为小花中 ACC氧化酶活性非
常高。0 h时 BO 2ACO2在茎切伤面第一层就有较高水平的 mRNA累积 , 而在小花中 mRNA累积较弱 ,
但 12 h显著增加 , 且明显高于所检测的其他部位。因此 , 小花中高 ACC氧化酶活性与 ACC氧化酶基
因转录物的增加是一致的。
目前已经从青花菜中克隆了 3个 ACC氧化酶 cDNA, BO 2ACO1可能在采前基础乙烯生成和营养组
织衰老中起作用 , 萼片黄化也与此有关。BO 2ACO2主要在青花菜采后繁殖器官中表达 , 采后 2 h即可
检测到 BO 2ACO2的转录物。Pogson等 (1995a) 认为由于 BO 2ACO2大量增加导致的乙烯生成是影响
萼片黄化的主要信号之一。BO 2ACO3仅在衰老后期的小花中可以检测到 ( Yang et al. , 2003)。North2
ern杂交分析结果表明乙烯受体蛋白基因表达有组织特异性 , 并在采后可能有蛋白的从头合成。预冷
的青花菜回到 20 ℃条件下 12 h时 BO 2ETR1、BO 2ERS、BO 2ETR2在茎切面第一层和 BO 2ERS在小花中
均比 0 h有不同程度的增强。组织对乙烯敏感性变化可能与这种增加有关。BO 2ETR1、BO 2ERS和 BO 2
ETR2在花头基部 mRNA累积变化不大 , 这与未经预冷的青花菜 (W ang et al. , 2002) 不同。研究表
明预冷可能在一定程度上改变了青花菜组织中乙烯生成和乙烯感受模式 , 推迟花蕾乙烯跃变峰的出现
可能是延缓青花菜衰老的原因之一。
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