全 文 ：园 艺 学 报 2002 , 29 (1) : 25～29
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 03 - 06 ; 修回日期 : 2001 - 06 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39870453、30170643) ; 湖南省自然科学基金资助项目 (00JJ Y20103) ; 农业部蔬菜遗传与
生理重点实验室资助项目3 现工作单位 : 中国农业科学院作物所。
辣椒子叶高效植株再生体系的建立
黎定军1 ,2 张宝玺1 赵开军1 3 谢丙炎1 罗 宽2
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081 ; 2 湖南农业大学植保系 , 长沙 410128)
摘 要 : 以双丰等 17 个辣椒品种为试材 , 探讨了不同基因型、激素组合、有机成分及 AgNO3 等因素对
子叶再生的影响。观察到DJ 添加物 (辣椒幼苗茎叶提取汁液∶卡那霉素 = 500∶1) 对不定芽的分化及伸长有
明显的促进作用 , 比对照分别提高 10. 0 %～11. 1 %和 90. 5 %～133. 3 %。筛选出高效芽分化培养基为 MB
+ IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 5. 0 mg/ L + DJ 5 000. 0 mg/ L + AgNO3 10. 0 mg/ L , 17 个品种平均芽分化率达 92. 3 % ;
高效芽伸长培养基为 MB + IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 5. 0 mg/ L + DJ 5 000. 0 mg/ L + AgNO3 10. 0 mg/ L + GA3 2. 0
mg/ L , 17 个品种平均芽伸长率达 57. 8 % ; 高效生根诱导培养基为 MS + IAA 0. 2 mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L ,
生根率达 90 % , 建立了辣椒子叶高效植株再生体系。
关键词 : 辣椒 ; 子叶 ; 植株再生
中图分类号 : S 643. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2002) 0120025205
近年来 , 辣椒 ( Capsicum annuum L. ) 离体再生培养取得一定进展〔1～5〕, 但与番茄、马铃薯等相
比 , 其再生频率偏低〔6〕, 主要因不定芽伸长能力差 , 有的甚至停留在芽诱导阶段不能进一步伸长〔7〕。
许多研究〔1 ,2 ,8〕表明 , 辣椒幼苗外植体类型中 , 子叶再生能力最强。本研究以辣椒子叶为材料 , 对其
离体培养进行系统探讨 , 建立起一套高效的植株再生体系 , 为辣椒基因转化奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
以 17 个辣椒品种为试材 (表 1) 。其中湘研三号、湘研六号、湘研十号及湘研十五号购自湖南省
农业科学院蔬菜研究所 , 其它均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 培养无菌苗 辣椒种子经 70 %酒精浸 1～2 min , 0. 1 %HgCl2消毒 7～8 min 或 2 %次氯酸钠溶
液消毒 20 min , 再用无菌水洗 3～4 次 , 播于 1/ 2 MS + 蔗糖 15 g/ L (pH 5. 8 ) 的琼脂培养基上。置于
26 ℃, 光照 (2 000 lx) 14 h/ d 下发芽并培养壮苗。
1. 2. 2 不定芽的诱导和分化 剪取幼苗子叶外植体 (去叶尖 , 每叶 2 块) 接种于分化培养基上。基
本培养基为 MS 或 MB (MS无机盐 + B5有机) , 蔗糖 30 g/ L 或 20 g/ L (MB) 、琼脂 6. 5 g/ L (pH 5. 8 ) , 附
加 IAA 0～1. 0 mg/ L、62BA 0～5. 0 mg/ L、ZT 0～2. 0 mg/ L、GA3 0～2. 0 mg/ L、DJ (取辣椒幼苗茎叶
提取其汁液后 , 加入卡那霉素至终浓度为 1/ 500 , 经过滤灭菌即得的新配有机成分) 0～5. 0 g/ L、Ag2
NO3 0～10. 0 mg/ L。培养条件同无菌苗培养 , 14 d 继代 1 次。以筛选出的高效芽分化培养基上分化的
不定芽进行芽伸长试验。
1. 2. 3 不定芽的伸长 将分化出的芽丛分割转移到伸长培养基。培养基为 MB , 蔗糖20 g/ L、琼脂
6. 5 g/ L (pH 5. 8 ) , 附加 IAA 1. 0 mg/ L、62BA 5. 0 mg/ L、GA3 0～4. 0 mg/ L、DJ 0～5. 0 g/ L、CH (水
解酪蛋白) 0～500. 0 mg/ L、AgNO3 0～10. 0 mg/ L。培养条件同上 , 14 d 继代 1 次。
1. 2. 4 生根与移栽 不定芽伸长至 1. 5 ～2. 0 cm 时自基部切下 , 移至生根培养基。培养基为 MS ,
蔗糖 30 g/ L、琼脂7. 0 g/ L (pH 5. 8 ) , 附加 IAA 0～1. 0 mg/ L、NAA 0～0. 1 mg/ L、IBA 0～0. 1 mg/ L。
培养条件同上。带根小植株开瓶炼苗 48 h 后移植于蛭石中 , 保湿培养 , 10～15 d 后移栽到营养土中
并于温室内正常栽培管理 , 直至开花结果。
2 结果与分析
2. 1 不定芽的诱导和分化
2. 1. 1 基因型的影响 将 17 个供试材料的子叶
外植体接种于分化培养基 1 (MS + IAA 1. 0 mg/ L
+ 62BA 5. 0 mg/ L) , 7 d 左右外植体伤口出现淡黄
色愈伤组织 , 10 d 左右可见绿色芽点 (见插页 1
图版 , 1) , 14 d 后芽已分化 (见插页 1 图版 , 2) 。
20 d 后 17 个品种的芽分化率为 65 %～98 % , 品种
之间存在较显著差异 (表 1) 。保加利亚尖椒平均
每个外植体分化的不定芽最少 , 为 16. 3 个 , 双丰
甜椒最多 , 达 23. 9 个 , 长势均一般。
2. 1. 2 苗龄的影响 先后选苗龄为 12、14、16、
20、24 及 30 d 的 3 个辣椒品种湘研六号、中椒 2
号和特大牛角椒的子叶 , 剪取外植体接种于分化
培养基 1 , 培养 20 d 后调查表明 , 3 个辣椒品种
的子叶外植体的分化能力均以苗龄 12～16 d 的最
强 , 随苗龄的增加 , 子叶分化不定芽能力下降。
表 1 辣椒不同基因型子叶不定芽分化的比较
Table 1 Differentiated comparison in genotypes of pepper
品种
Varieties
接种外
植体数
No. of
explants
分化外
植体数
No. of
explants
with buds
分化频率
Rate of
differenti2
ation ( %)
每外植体
平均芽数
Average No.
of buds of
each explant
with buds
双丰 Shangfeng 40 35 88 23. 9
中椒 2 号 Zhongjiao 2 40 39 98 17. 1
中椒 3 号 Zhongjiao 3 40 32 80 17. 5
中椒 4 号 Zhongjiao 4 40 30 75 20. 5
中椒 5 号 Zhongjiao 5 40 38 95 16. 8
中椒 6 号 Zhongjiao 6 40 38 95 17. 0
中椒 7 号 Zhongjiao 7 40 31 78 18. 5
中椒 8 号 Zhongjiao 8 40 33 82 19. 1
CV298 40 27 68 19. 0
21 号牛角椒 Niujiao 21 40 31 78 17. 5
伏地尖辣椒 Fudijian chili 40 26 65 18. 2
保加利亚尖椒 Bulgaria chili 40 30 75 16. 3
特大牛角椒 Tedaniujiao 40 26 65 18. 2
湘研三号 Xiangyan 3 40 32 80 22. 8
湘研六号 Xiangyan 6 40 33 83 21. 7
湘研十号 Xiangyan 10 40 37 93 16. 5
湘研十五号 Xiangyan 15 40 35 88 19. 7
2. 1. 3 激素及其配比的影响 6 个辣椒品种的子叶外植体分别接种于附加不同激素及其配比的分
化培养基进行芽诱导 , 每处理 40 个外植体 (下同) 。20 d 后观察芽分化 (表 2) , 在 62BA 为 5. 0 mg/
L , IAA 为 1. 0 mg/ L 时 , 子叶不定芽分化频率最高 , 每外植体平均芽数最多。随 IAA 水平降低 , 不定
芽分化频率及每外植体平均芽数均下降。IAA 为 1. 0 mg/ L , 而 62BA 由 5. 0 mg/ L 降至 3. 0 mg/ L 时 ,
不定芽分化率及每外植体平均芽数明显降低。培养基中添加不同浓度的 GA3 , 对芽分化存在一定程度
抑制作用 , 随 GA3 水平升高 , 抑制作用增强。添加 1. 0 mg/ L 的 GA3及 5. 0 g/ L 的 DJ 后 , 不定芽分化
率未下降 , 因为 DJ 添加物能提高芽分化率。用 ZT代替 62BA + IAA , 也能诱导出高频率的芽分化 , 但
每外植体平均芽数有所减少。
表 2 不同激素及其配比对辣椒子叶不定芽分化的影响
Table 2 Effect of combinations of hormone on differentiation of pepper
激素 Hormone
(mg/ L)
IAA 62BA ZT GA3 DJ(g/ L) 湘研三号Xiangyan 3A B 湘研十号Xiangyan 10A B 双丰ShuangfengA B 中椒 2 号Zhongjiao 2A B 中椒 5 号Zhongjiao 5A B 保加利亚尖椒Bulgaria chiliA B
1. 0 5. 0 0. 0 0. 0 0. 0 82 22. 0 90 16. 7 90 23. 5 90 17. 0 92 16. 0 75 17. 0
0. 5 5. 0 0. 0 0. 0 0. 0 75 16. 5 88 14. 5 83 18. 0 90 12. 5 90 14. 0 75 13. 5
0. 0 5. 0 0. 0 0. 0 0. 0 50 11. 5 68 11. 5 67 12. 0 71 12. 5 52 11. 5 55 12. 0
1. 0 5. 0 0. 0 1. 0 5. 0 78 20. 5 90 16. 0 88 21. 5 91 15. 5 90 15. 5 78 14. 5
1. 0 3. 0 0. 0 1. 0 5. 0 45 11. 0 60 12. 5 45 15. 5 60 9. 0 40 11. 5 42 11. 5
0. 0 0. 0 2. 0 0. 0 5. 0 85 15. 0 90 13. 7 88 16. 0 100 16. 0 90 14. 0 80 15. 0
0. 0 0. 0 2. 0 1. 0 5. 0 75 16. 0 90 13. 5 85 17. 0 90 15. 7 88 14. 5 70 14. 5
0. 0 0. 0 2. 0 2. 0 5. 0 70 13. 5 80 13. 0 80 15. 5 80 14. 5 78 13. 0 60 12. 8
注 : 表中 A 代表分化频率 ( %) , B 代表各分化外植体平均芽数。
Note : A , Rate of differentiation ( %) ; B , The average number of buds per explant differentiated.
62 园 艺 学 报 29 卷
2. 1. 4 DJ 添加物与 AgNO3 的影响 将湘研六号、中椒 2 号、特大牛角椒 3 个品种的子叶外植体分别
接种于添加不同量 DJ 和 AgNO3 的分化培养基上 , 不定芽分化情况见表 3。DJ 添加物能不同程度提高
3 个品种的不定芽分化频率 , 提高幅度为 10. 0 %～11. 1 %。虽使每外植体不定芽数有所减少 , 但通
过进一步培养 (28 d) , 观察到 DJ 能明显抑制外植体后期愈伤组织徒长 , 且不定芽长势很好。分化培
养基中添加 10. 0 mg/ L 的 AgNO3 , 不但能很好地抑制外植体褐化 , 而且能促进芽分化 , 使 3 个品种芽
分化频率明显提高。
表 3 DJ 添加剂与 AgNO3对子叶不定芽分化的影响
Table 3 Effect of DJ and AgNO3 on differentiation
DJ
(g/ L)
AgNO3
(mg/ L)
湘研六号 Xiangyan 6
A B C
中椒 2 号 Zhongjiao 2
A B C
特大牛角椒 Tedaniujiao
A B C
0. 0 0. 0 80 21. 5 + + 90 17. 5 + 68 18. 7 + +
5. 0 0. 0 88 18. 7 + + 100 15. 7 + 75 16. 0 + +
5. 0 10. 0 95 19. 0 - 100 16. 5 - 85 16. 5 -
注 : 表中 A、B 同表 2 , C代表外植体褐化情况 , ( + ) 一般褐化 , ( + + ) 严重褐化 , ( - ) 无褐化现象。
Note : A and B in the table are the same as that in table 2 , C indicates the browning severity of explants : ( + ) mild browning , ( + + ) severe
browning , ( - ) no browning.
2. 1. 5 维生素的影响 湘研三号、湘研十号、双丰、中椒 2 号、中椒 5 号和保加利亚尖椒等 6 个品
种的子叶外植体分别接种于含不同维生素成分及添加或不加 DJ 的分化培养基 , 20 d 后调查结果。分
化培养基中的 MS 维生素改为 B5 维生素后 , 子叶的芽分化频率并未明显提高 , 但长势大多变好 , 外
植体膨大程度加大。在 B5 有机成分的基础上再添加 DJ , 不仅分化率显著提高 , 而且不定芽长势最
好 , 愈伤组织变少。
以上试验结果分析表明 , 最优芽分化培养基为 MB + IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 5. 0 mg/ L + DJ 5. 0 g / L
+ AgNO3 10. 0 mg/ L + 蔗糖 2. 0 % + 琼脂粉 0. 65 %。进一步将 17 个供试品种在该芽分化培养基上进
行芽分化 , 17 个品种平均芽分化率为 92 % , 其中最高的为湘研十号、中椒 2 号、中椒 5 号和中椒 6
号 , 均达 100 % , 最低的伏地尖辣椒也达 80 %。
2. 2 不定芽的伸长
2. 2. 1 芽分化培养基的影响 以上试验所有分化培养基上分化的不定芽在调查后继代于相应的分化
培养基继续培养。结果发现仅附加 IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 3. 0 mg/ L + GA3 1. 0 mg/ L 或 ZT 2. 0 mg/ L +
GA3 1. 0 ～2. 0 mg/ L 的芽分化培养基上有少数不定芽伸长。两种培养基中以附加 ZT 2. 0 mg/ L +
GA3 2. 0 mg/ L 的不定芽伸长率较高 , 6 个品种平均达 28. 5 % ; 6 个品种中以湘研十号、中椒 2 号和中
椒 5 号不定芽伸长率最高 , 在两种培养基上平均芽伸长率分别为 32. 3 %、30. 3 %、29. 3 %。其余培
养基均不能诱导不定芽伸长 , 不定芽呈叶状体。这说明 , 62BA 水平的降低及添加 GA3 为不定芽伸长
的两个不可或缺的因子。
2. 2. 2 GA3、有机成分及 AgNO3 的影响 表 4 表明 , 62BA 水平从芽分化培养基的 5. 0 mg/ L 降至 3. 0
mg/ L , 6 个辣椒品种的不定芽伸长率均为 0 , 说明 62BA 水平降低还不足以导致不定芽伸长。在添加
GA3后不定芽有不同程度的伸长 , 且随 GA3 水平提高 , 芽伸长率增加 , 当 GA3水平高于 2. 0 mg/ L 后 ,
增加幅度不明显。添加有机成分 DJ 能大幅度 (90. 5 %～133. 3 %) 提高不定芽伸长率 , 而 CH的促进
作用不显著 (不定芽伸长提幅为 6. 0 %～23. 3 %) 。AgNO3 对不定芽伸长也有促进作用 , 建议与 DJ 配
合使用。最佳不定芽伸长培养基为 : MB + DJ 5. 0 g/ L + AgNO3 10. 0 mg/ L + IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 3. 0
mg/ L + GA3 2. 0 mg/ L + 蔗糖 3. 0 % + 琼脂粉 0. 65 %。
2. 2. 3 基因型的影响 17 个品种分化的芽丛转移至最佳伸长培养基上培养 (见插页 1 图版 , 3) , 不
定芽伸长率平均达 57. 8 % , 品种之间存在极显著差异 , 其中伸长率最高的为湘研十号 (78. 9 %) ,
其次为中椒 2 号 (73. 6 %) 、中椒 5 号 (71. 8 %) 及中椒 6 号 (66. 7 %) 等 ; 最低的为双丰 , 仅 28. 9
721 期 黎定军等 : 辣椒子叶高效植株再生体系的建立
%。结合 17 个品种的不定芽分化情况分析 , 发现芽分化能力强的 , 其不定芽伸长能力不一定强 , 如
‘双丰’品种芽分化频率达 90 %左右 , 但芽伸长率为最低。芽分化力不强的品种则伸长能力普遍较
差。
表 4 GA3、有机成分及 AgNO3 对辣椒子叶外植体不定芽伸长的作用
Table 4 Effect of GA3 , organic nutrient component and AgNO3 on the elongation of shoots of pepper cotyledon expiants
GA3
(mg/ L)
DJ
(g/ L)
CH
(mg/ L)
AgNO3
(mg/ L)
不定芽伸长率 Rate of shoots elongation ( %)
湘研三号
Xiangyan 3
湘研十号
Xiangyan
双丰
Shuangfeng
中椒 2 号
Zhongjiao 2
中椒 5 号
Zhongjiao 5
保加利亚尖椒
Bulgaria chili
0. 0 0. 0 0. 0 0. 0 0 0 0 0 0 0
1. 0 0. 0 0. 0 0. 0 15 22 0 25 20 10
2. 0 0. 0 0. 0 0. 0 27 31 7 30 34 20
4. 0 0. 0 0. 0 0. 0 25 33 10 29 31 19
2. 0 5. 0 0. 0 0. 0 50 70 25 65 60 40
2. 0 0. 0 500. 0 0. 0 27 35 12 37 35 22
2. 0 5. 0 0. 0 10. 0 52 75 25 72 68 45
2. 3 生根及移栽成苗
切取湘研十号、中椒 2 号、中椒 5 号的伸长不定芽移至生根培养基培养 , 10 d 左右芽不定根开始
形成 , 20 d 后形成发达根系 (见插页 1 图版 , 4) 。未加激素的生根培养基 MS 和 1/ 2MS 均能诱导不定
根形成 , MS 产生不定根的时间 (约 12 d) 虽比 1/ 2MS 的 (约 9 d) 迟 , 但不定根后期长势更好。添
加激素能促进生根率的显著提高 , 但 IAA 水平达 0. 2 mg/ L 以上时 , 生根率不再显著增加。不同激素
及配比对生根影响存在差异。IAA 0. 2 mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L 组合使 3 个品种的生根率均达 90 %以上 ,
且不定根长势好 , 根系发达 , 平均每株不定根数达 8～9 条。因此 , 最佳生根培养基为 : MS + IAA 0. 2
mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L + 蔗糖 3. 0 % + 琼脂粉 0. 7 %。小苗根系生长发达后 , 及时炼苗移栽蛭石 (见
插页 1 图版 , 5) , 15 d 后植营养钵中 , 于温室正常栽培管理 , 直至开花结果 (见插页 1 图版 , 6) , 成
活率达 100 %。
3 讨论
周钟信等〔3〕和余小林等〔8〕报道 , 在辣椒子叶芽分化及伸长培养基中附加新配有机成分 Zh 和 LY,
能提高芽分化及芽伸长频率。本研究所附加的 DJ 添加物系辣椒幼苗茎叶提取汁液与卡那霉素两种成
分按 500∶1 的比例混合而成。从试验结果看 , DJ 添加物显著提高了不同基因型辣椒子叶外植体的芽
分化率及芽伸长率 , 17 个供试辣椒品种平均芽分化率达 92 % , 最高达 100 % , 最低也有 80 % ; 平均芽
伸长率达 57. 8 % , 最高达 78. 9 % , 基本符合遗传转化对受体再生体系的要求。DJ 添加物对子叶外
植体所分化的不定芽数量有一定的抑制作用 , 但更主要是抑制了外植体愈伤组织徒长 , 从而有利于不
定芽分化和生长。试验中曾对不定芽进行解剖观察 , 发现添加 DJ 的培养基上分化的不定芽大多能够
分化完全 , 而未添加 DJ 的培养基上分化的不定芽分化不完全。DJ 添加物促进不定芽分化及伸长的机
制有待进一步探讨。
有关辣椒子叶离体再生培养中不同阶段激素组合及配比的研究很多〔7 ,9 ,10〕, 结论也不尽一致。本
试验发现芽分化中 62BA (5. 0 mg/ L) 比 ZT (2. 0 mg/ L) 效果好 , 而 IAA 与 62BA 配合使用比单用 62BA
能明显提高芽分化率。辣椒离体培养的主要困难在于芽难以伸长 , 在芽伸长培养基中添加 GA3 可诱
导芽伸长〔9～11〕。本试验进一步证实了 GA3 对芽伸长的关键作用 , GA3 含量超过 2. 0 mg/ L 后增效不明
显。郝峥嵘等〔10〕认为低浓度的 GA3 对芽诱导有促进作用 , 但本试验在芽分化培养基中添加 1. 0 mg/ L
的 GA3 , 不仅不能促进芽的分化 , 反而存在一定程度的抑制作用 , 这与王玉文等〔7〕结论相似。一些研
究者〔13 ,15〕认为 AgNO3 能促进芽分化 , 本研究发现10. 0 mg/ L 的 AgNO3 不仅解决了外植体切口褐化问
82 园 艺 学 报 29 卷
题 , 促进芽的分化 , 而且有利于芽的伸长。生根培养基中加入适量的 IAA、NAA 或 IBA , 均能促进不
定根的诱导 , IAA 与 NAA 配合使用的效果更佳。
本试验中发现芽分化率高的品种不一定芽伸长率高 , 但芽分化率低的品种芽伸长率都较低。这说
明在选择辣椒材料进行离体再生或遗传转化时 , 不但要看其芽分化率 , 而且要考虑其芽伸长率。有研
究〔5〕认为 , 甜椒的离体再生难于辣椒 , 从本试验的结果看 , 9 个甜椒品种与 8 个辣椒品种之间的芽分
化率、芽伸长率没有规律性差异。董春枝等〔13〕及曹冬孙等〔9〕所进行的辣椒子叶组培试验中 , 芽分化
和芽伸长均为一种培养基 , 且成功培养出再生苗 , 这样比较简便 , 也更为理想。作者对此也做了探
讨 , 但芽分化率和芽伸长率均不高 , 且后期愈伤组织过多 , 可能是由于 GA3 抑制了芽分化所致。
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High Efficient System Establishment of Plant Regengation from Cotyledon
Explants of Pepper ( Capsicum annuum L. )
Li Dingjun1 ,2 , Zhang Baoxi1 , Zhao Kaijun1 , Xie Bingyan1 , and Luo Kuan2
(1 Institute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing 100081 ; 2 Department of Plant Protection , Hu2
nan Agricultural University , Changsha 410128)
Abstract : The report describes the development of a high efficient in vitro regeneration procedure from cotyle2
don explants of 17 sweet/ chilli pepper cultivars (Shuangfeng et al) . The effect of genotype , hormone , organic nu2
trient component and AgNO3 et al on the tissue culture from pepper cotyledon explants was investigated. Adding DJ
(juice of peppr stem and leaf + kanamycin = 500∶1) organic nutrient component can improved the shoot buds differ2
entiation and elongation rate. The best media for in vitro regeneration from cotyledon explants of pepper were discov2
ered : the shoot buds induction medium : MB + IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 5. 0 mg/ L + DJ 5. 0 g/ L + AgNO3 10. 0
mg/ L ; the shoot buds elongation medium : MB + IAA 1. 0 mg/ L + 62BA 5. 0 mg/ L + DJ 5. 0 g/ L + AgNO3 10. 0
mg/ L + GA3 2. 0 mg/ L ; the rooting medium : MS + IAA 1. 0 mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L.
Key words : Pepper ; Cotyledon ; Plant regeneration
921 期 黎定军等 : 辣椒子叶高效植株再生体系的建立