全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (5) : 540～544
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 02 - 12 ; 修回日期 : 2003 - 07 - 25
基金项目 : 国家高技术研究发展计划项目 (2001AA241121) ; 农业部“948”引进项目 (201023) ; 农业部蔬菜遗传与生理重点开放
实验室资助项目3 通讯作者 Author for correspondence , E2mail : xieby @mail1caas1net1cn
几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的
分离与比较
易图永1 ,2 　谢丙炎1 3 　张宝玺1 　高必达2
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081 ;　2 湖南农业大学植物保护学院 , 长沙 410128)
摘 　要 : 根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物 , 对 9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因
组 DNA 进行抗病基因同源性序列的特异 PCR 扩增 , 经序列测定和同源性分析发现 14 个抗病基因同源性序
列 (RGAs) 与辣椒抗疫病作用相关 , 其中 B 引物扩增的 8 个 RGAs 与烟草抗花叶病基因 N、拟南芥抗丁香
假单菌基因 RPS2 和亚麻抗锈病基因 L6 的同源性较高 , 属于广谱 (细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序
列 ; C引物扩增的 6 个 RGAs 与番茄抗叶霉病基因 Cf2 和 Cf9 有较高的同源性 , 与抗疫病作用密切相关。研
究还发现 , 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关 RGAs , 这与已报道的辣椒抗疫病微效 QTLs 位点则
来于感病亲本基因组的研究结论一致。
关键词 : 辣椒 ; 辣椒疫病 ; 抗病基因同源序列
中图分类号 : S 641 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0520540205
辣椒疫病是由 Phytophthora capsici L. 引起的毁灭性土传病害。不少研究证明 , 辣椒基因组中对疫
病的抗性是由多基因控制的数量性状 , 其转育难度极大 , 迄今尚未育成抗疫病的辣椒品种〔1〕。通过对
辣椒抗病基因的 QTL 定位发现 , 辣椒对疫病的抗性受 13 个 QTLs 位点控制 , 主效 QTLs 位点的表型效
应为 41 %～55 % , 具有加性作用的中间型QTLs 位点的表型效应为 17 %～28 % , 还有一些微效QTLs 位
点〔2〕。因此 , 研究其抗疫病基因的结构及精确定位 , 是阐明抗疫病作用遗传机理的重要基础。
近 10 年来 , 利用位点克隆和转座子标定技术从玉米、拟南芥、番茄等 10 余种植物中克隆了一系
抗病基因 , 如拟南芥抗霜霉病的 RPP5 基因、拟南芥抗番茄丁香假单胞细菌的基因 RPS2、烟草抗
TMV 的 N 基因、亚麻抗锈病的 L6 基因、番茄抗细菌性斑点病的 Pto 基因、番茄抗叶霉病生理小种 2、
9 的基因 Cf2、Cf9 等。这些抗病基因虽作用的病原种类有别 (真菌、细菌、病毒、线虫) , 但所编码
的蛋白质都存在同源序列 , 即都含有或部分含有核苷酸结合位点 (NBS) 、亮氨酸富集重复序列
(LRR) 、丝氨酸/ 苏氨酸激酶 (STK) 、亮氨酸拉链结构 (LZ) 、跨膜结构域 (TM) 、Toll 白介素 - 1 区域
(TIR) 等 , 这些结构与蛋白质之间的相互作用以及细胞内的信号传导有关〔3〕。这些结果揭示 , 同源序列
可能存在大多数植物抗病基因家族中。在本研究中 , 我们探讨了根据已知抗病基因的保守结构域设计简
并引物的特异 PCR 反应 , 从 9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组 DNA 中扩增出抗疫病相关基因
的同源序列 , 并分析了这些序列间的同源性关系 , 供辣椒抗疫病相关基因克隆与分子标记定位参考。
1 　材料与方法
用于扩增抗疫病相关基因同源序列的不同抗感疫病辣椒种质材料共 9 个 (图 1) , 均由中国农业
科学院蔬菜花卉研究所提供。其中 1、2、3、4 和 9 号是疫病 ( Phytophthora capsici L. ) 的部分抗性材
料 , 5、6、7、8 为疫病高感材料。
将新鲜辣椒叶片用液氮快速研磨成粉状后 , 用 CATB 法抽提和纯化总 DNA〔4〕; 采用 4 对引物通过
PCR 反应从总 DNA 中扩增抗病相关基因同源序列片段。其中所用引物是根据已知抗病基因拟南芥抗
霜霉病 RPP5 基因与 RPP8 (引物A) 、烟草抗 TMV 的 N 基因、亚麻抗锈病 L6 基因和拟南芥抗番茄丁
香假单胞细菌 RPS2 基因 (引物 B) 、番茄抗叶霉病菌 2、9 生理小种 Cf2/ Cf9 基因 (引物 C) 、番茄抗
细菌性斑点病的 Pto 基因 (引物 D) 同源序列两侧的序列设计而成的简并引物 , 均由上海 Sangon 生物
工程公司合成 (表 1) 。PCR 反应体系 (25μL) 中包括 : 1 ×PCR Buffer , 2 mmol/ L MgCl2 , 012 mmol/ L
dNTP , 25 pmol Primer , 1 U Taq 酶 , 50 ng DNA , 在 MJ 公司生产的热循环仪上进行 , 反应条件为 :
95 ℃3 min , 94 ℃1 min , 52 ℃1 min , 72 ℃1 min , 39 个循环 , 最后 72 ℃延伸 8 min。不同引物扩增的
DNA 片段大小不同 , 其变化范围为 400～1 000 bp。PCR 扩增产物用 Promega 公司生产的 Wizard PCR
Preps kits 进行回收纯化后 , 直接克隆到 pGEM2T (Promega) 载体中 , 再转化到大肠杆菌 ( E. coli) JM109
菌株的感受态细胞中 , 在含 X2gal、IPTG和氨苄青霉素的LB 培养基上筛选重组的克隆子。用碱裂解法提
取重组质粒 , 再用识别 4 个碱基的限制性内切酶 Hae Ⅲ在 37 ℃消化 4 h 以上 , 其产物在 2 %琼脂糖凝胶上
电泳 , 根据酶切电泳图谱将每引物/ 材料组合中的质粒分类 , 从每类中挑取 1 个代表菌株进行测序。
表 1 　PCR反应的引物序列和配对
Table 1 　Sequences of primer used in PCR
引物 Primer
名称 Name 大小 Size (bp) 序列
3 Sequence 参考文献Reference
A 正向 Sense 25 5’GGI CAR GGI GGI ATH GGI AAR ACI A 3’ 〔5〕
　反向 Antisense 20 3’CCI CCI RAI GGI RAI GGI RA 5’
B 正向 Sense 27 5’GGI ATG GGI GGI GTI GGI AAR ACN CAN 3’ 〔6〕
　反向 Antisense 20 3’CCW RAI GGI RAI CGI RAI TTY CAI GAI CCI 5’
C 正向 Sense 23 5’WSI AAY AAR YTI CAY GGI CCI AT 3’ 〔7〕
　反向 Antisense 23 3’CCI CTY TAI GGI KCT GTY RAI CG 5’
D 正向 Sense 20 5’ATG GGA AGC AAG TAT TCC AA 3’ 〔8〕
　反向 Antisense 20 3’AGT TTC CAC AGC ACA TCA CC 5’
　　3 R = A/ G, S = G/ C , K= T/ G, Y= T/ C , W = A/ T , H = A/ T/ C , N = A/ T/ C/ G, I = inosine。
序列测定由上海 Sangon 生物工程公司在 ABI3700 型测序仪上进行。将测序的结果去除 p GEM2T载
体的序列 , 用 DNAtools (610) 软件 (Carlsberg Research Center 软件产品) 分析这些序列的 ORF , 然后
通过互联网用 BLAST软件 (网址 : http : / / www. ncbi . nlm. nih. gov ) 对 GenBank 中登记的序列进行同源
性比较 , 从而推断这些扩增产物是否与已知的抗病基因相关。同时用 DNAMAN (410) 软件 (Nynnon
Biosoft 软件产品) 分析各序列间的同源性及其与已知抗病基因的关系。
2 　结果与分析
211 　抗病基因同源序列的克隆
以 9 个不同抗感疫病的辣椒种质材料的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增 , 结果 (图 1) 表明 ,
除引物 A 外 , 其余 3 对引物均扩增出了目标 DNA 片段。引物 B 在所有材料中均扩增出与预期一致的
大于 500 bp 的强带 ; 引物 C在抗疫病 2、3、4 号材料中扩增出一条约为 450 bp 的强带 , 在感病的 5、
6、8 号材料中则一条约为 450 bp 的弱带 , 在 1 号抗疫病材料中未扩增出目标 DNA 片段 ; 引物 D 在抗
疫病 1、3、4 号材料和 6 号感病材料中扩增出大于 500 bp 的强带 , 在 2 号抗疫病材料和 7 号感病材料
中扩增出大于 500 bp 的弱带 , 比预期小 400 bp , 这表明虽然番茄与辣椒同属茄科 , 但在 Pto 基因结构
上有较大的差异 , 其原因有待进一步研究。
将特异扩增目的DNA 片段连接到 pGEM2T载体上 , 转化到大肠杆菌感受态JM109 , 转化效率约115×107/
μg DNA , 重组质粒经蓝白斑筛选、HaeⅢ酶切鉴定证实 , 克隆的目的DNA 片段已连接到 pGEM2T载体上。
1455 期 　　　　　　　易图永等 : 几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较 　　　　　　　
图 1 　9 个辣椒材料基因组抗病相关基因同源序的 PCR扩增
1 : 9321002172120 (辣椒) ; 2 : 9321002121 (辣椒) ; 3 : Perennial (野生辣椒) ; 4 : SCM334 (野生辣椒) ; 5 : 茄门甜椒 ;
6 : 伏地尖辣椒 ; 7 : 灯笼甜椒 ; 8 : ‘Yolo Wonder’甜椒 ; 9 : CV98 辣椒。
Fig. 1 　PCR amplifications with degenerate primers designed from conserved motifs found
in a number of plant resistance genes on 9 different pepper varieties
1 : 9321002172120 (hot pepper) ; 2 : 9321002121 (hot pepper) ; 3 : Perennial (wild hot pepper) ; 4 : SCM334 (wild hot pepper) ;
5 : Jiemen sweet pepper ; 6 : Fudijian hot pepper ; 7 : Bell sweet pepper ; 8 : ‘Yollo Wonder’sweet pepper ; 9 : CV98 hot pepper.
212 　抗病基因同源序列分析与推导 ORF 结构特
征
共对 26 个重组质粒进行测序分析 , 结果有
1 个没有插入连接片段 , 还有 1 个虽然有连接插
入片段 , 且可以找到所用的引物序列 , 但大小只
有 78 bp。余下的 24 个质粒去除 p GEM2T 载体
后 , 经 CARDNAtools (610) 分析发现 5 个序列
(B41、B43、B54、B61、B93) 的最长 ORF 为 150
个氨基酸以上 , 4 个序列 (B510、C39、C51、
D11) 的最长 ORF 为 100 个氨基酸以上 , 10 个序
列 ( B56、B62、B72、B92、C82、D66、D61、
D42、D41、D12) 的最长 ORF 为 80～100 个之
间 , 5 个序列 (B513、B64、C22、C36、C41) 的
最长 ORF 在 80 个氨基酸以下。将所有的序列发
送到 GenBank , 均被收录 , 结果见表 2。
213 　抗病基因同源序列与已知抗病基因的同源
性比较
为确定分离的辣椒抗病基因同源序列与已知
序列的关系 , 对上述具有完整 ORF 的克隆 , 通
过互联网进行了 BLAST 分析 , 结果发现 14 个克
隆为抗病基因同源序列 , 其中 B 引物扩增的克
隆 B56、B510、B513、B61、B62、B64、B72、
B92 与马铃薯部分抗病基因同源序列 ( Solanum
tuberosum U60069、U60070、U0080、U0081 ; S .
表 2 　辣椒抗病基因同源片段的基因库注册号和最长的开放读码框
Table 2 　The accession number of RGAs of pepper in GenBank
and the longest ORF
克隆/ 抗病基
因同源片段
Clone/ RGA
片段大小
Length of
fragment (bp)
最大的开放读框
AA
The longest ORF
基因库注册号
Accession
number
B41 522 173 AY125911
B43 525 174 AF513548
B54 522 173 AF525136
B56 529 98 AF525137
B510 585 119 AF525134
B513 528 32 AF525135
B61 528 175 AF525138
B62 529 98 AF525139
B64 559 54 AF525140
B72 529 98 AF525141
B92 531 81 AF525142
B93 663 153 AF525143
C22 425 58 AF525144
C36 380 77 AF525145
C39 455 111 AF525146
C41 381 77 AF525147
C51 464 111 AF525148
C82 410 93 AF525149
D11 369 111 AF513549
D12 545 82 AF525150
D41 624 90 AF525151
D42 545 82 AF492473
D61 545 82 AF525152
D66 546 82 AF525153
phureja ×S . stenotomun AY059428) 的同源性为 85 %以上、与番茄部分 NBS 结合位点的抗病基因同源
序列 (Lycopersicon esculentum AF404416、AF404438、AF404459、AF404459) 的同源性为 81 %～87 %、与
可可含 NBS/ LRR 结构域的抗病基因同源序列 ( Theobroma cacao AF402752) 同源性为 96 %以上 ; C 引
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物扩增的克隆 C22、C36、C39、C41、C51、C82 与番茄抗叶霉病基因 ( L . esculentum Hcr220A
AF053994、AF053995 , Her9 AF119040、AF119041 , Cf4/ 9 AF002237 , Cf9 AF002236 , Cf4 AF002235 ;
L . pimpinellifolium Hcr222A AF053996 , Cf211 U4244 , Cf212 U42445 , L . hirsutum Cf4 AJ002275) 的同源
性较高 , 为 83 %～97 % , 其中 C82 与番茄抗叶霉病的抗病基因簇中的 Hcr9 的同源性最高。Hcr9 为番
茄抗叶霉病基因簇中类似于 Cf9 的同源区域 , 在 L . pimpinellifolium 的 Cf9 基因家族中 , 含有 Cf9 及其
4 个同族体 Hcr9 s 均与抗病性状有关 ; 其余的克隆未显示出与已知抗病基因同源 , 其原因尚待研究。
用 DNAMAN 软件的 sequence alignment 功能对上述 14 个辣椒候选抗病基因同源序列之间 , 以及与
5 个已知抗病基因序列 (B 引物 : 拟南芥抗番茄丁香假单胞细菌的基因 RPS2、烟草抗 TMV 的 N 基
因、亚麻抗锈病的 L6 基因、C引物 : 番茄抗叶霉病生理小种 2、9 的基因 Cf2、Cf9) 的分子进化进行
了分析 , 结果表明 , 基于引物 B、C分成两大类 , 其中 B 引物扩增的抗病基因同源序列的同源关系更
接近于 L6 , C引物扩增的抗病基因同源序列的同源关系更接近于 Cf2、Cf9 (结果未显示) 。对照 14
个辣椒候选抗病基因同源序列与不同抗、感疫病辣椒材料的关系 , 发现B 引物扩增的 8 个辣椒候选抗
病基因同源序列中仅 B92 是来源于高抗疫病的 CV98 辣椒 (9 号) , 其余均来源于感病材料 ; C 引物扩
增的 6 个辣椒候选抗病基因同源序列中 , 4 个 (C22、C36、C39、C41) 分别来源于抗疫病材料 9321002
121 (2 号) 、Perennial (3 号) 和 SCM334 (4 号) , C51 和 C82 则来源于感病材料茄门甜椒 (5 号) 和
‘Yolo Wonder’甜椒 (8 号) 。辣椒抗疫病性状是一个由主基因 + 多基因控制的数量遗传体系 , Lefebver
等研究发现 , 辣椒对疫病的抗性受 13 个 QTLs 位点控制 , 主效 QTLs 位点来源于抗病亲本基因组 , 部
分微效 QTLs 位点则来于感病亲本基因组 , 并且主效与微效 QTLs 位点上位互作效应在其抗疫病作用表
达中具有主导作用〔1〕。因此本研究从感病辣椒材料中扩增出抗病基因同源序列 , 进一步证明了上述结
论。亚麻抗锈病的 L6 基因 , 番茄抗叶霉病生理小种 2、9 的基因 Cf2、Cf9 是抗真菌病害基因 , 辣椒
疫霉是一种卵菌病害 , 寄主对其侵染的抵抗机制与真菌类似。综合上述分析 , 推测分离获得的 14 个
辣椒候选抗病基因同源序列可能与辣椒抗疫病作用有关。图版 (见插页 3) 进一步显示了上述 C 引物
的 C22、C36、C39、C41、C51、C82 所推测的多肽序列与番茄抗病基因 Cf2、Cf9 编码多肽序列之间的
关系 , 从图版可知 , 引物 C扩增出的抗病基因同源序列所推导的蛋白与 Cf2、Cf9 编码蛋白在一级结
构上具有较高的同源性 , 特别是在某些结构域上完全一致。因此 , 本研究获得的辣椒抗病基因同源序
列 , 作为分子标记可进一步分析与已定位的辣椒抗疫病基因的关系。
3 　讨论
近 10 年以来 , 植物抗病基因及其家族含有同源序列这一特点在国内外已引起高度重视。Yu 等利
用抗病基因同源序列 , 从大豆中获得 11 类含 NBS 序列的克隆 , 其中 5 类克隆的定位与已知的 3 个大
豆抗病基因在染色体上的位置有很好的对应关系〔9〕。在马铃薯〔10〕、柑橘〔11〕、水稻〔12～13〕莴苣〔14〕和小
麦〔15〕等作物研究中也获得类似结果。
有研究证明抗病 R 类基因的表达与QTLs 效应密切相关 , 并已在数量抗病性QTLs 定位得到了成功
的应用。Pflieger 等利用已知抗病基因的保守区域设计 6 对引物 , 以野生辣椒 Perennial 的基因组 DNA
为模板进行 PCR 扩增 , 发现与烟草抗 TMV N 基因同源、包含NBS 序列的辣椒 RGAs 与抗 CMV 的QTLs
密切相关 , 尚未发现与抗疫病密切相关的 RGAs〔2〕。为筛选出与辣椒抗疫病性状相关的分子标记 , 根
据拟南芥抗霜霉病基因 RPP5 (U97106)〔5〕, 烟草抗花叶病基因 N (序列号 U15605) 、拟南芥抗丁香假
单菌基因 RPS2 (序列号 U12860) 、亚麻抗锈病基因 L6 (序列号 U27081)〔6〕, 番茄抗叶霉病基因 Cf2
(U42445) 和 Cf9 (U15936)〔7〕, 番茄抗假单胞菌基因 Pto (U02271)〔8〕等已知抗病基因的保守结构域设
计简并引物 , 对 9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组 DNA 进行抗病基因同源性序列的特异
PCR 扩增 , 经序列测定和同源性分析 , 发现 14 个 RGAs 与辣椒抗疫相关作用相关 , 其中B 引物扩增的
8 个 RGAs 与烟草抗花叶病基因 N 、拟南芥抗丁香假单菌基因 RPS2 和亚麻抗锈病基因 L6 的同源性较高 ,
3455 期 　　　　　　　易图永等 : 几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较 　　　　　　　
属于广谱 (细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序列 ; C 引物扩增的 6 个 RGAs 与番茄抗叶霉病基因 Cf2
和 Cf9 的同源性较高 , 与抗疫病作用密切相关。研究还发现 , 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相
关 RGAs , 这与Lefebver 等发现部分辣椒抗疫病微效 QTLs 位点来自感病亲本基因组的结论〔1〕一致。因此
本研究获得的辣椒抗疫病相关同源序列可作为辣椒抗疫病相关基因克隆与分子标记定位的依据。
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Amplif ied Resistance Phytophthora Blight Gene Analogs from Capsicum annuum
Genomic DNA
Yi Tuyong1 ,2 , Xie Bingyan1 , Zhang Baoxi1 , and Gao Bida2
(1 Institute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China ;　2 College of Plant Protec2
tion , Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract : Numerous fragments were cloned from 9 different resistant/ susceptible pepper ( Capsicum annuum)
varieties to Phytophthora blight , using a PCR approach with degenerate primers designed from conserved motifs
found in a number of plant resistance genes. After sequencing and homology analysis , 8 RGAs amplified by primer
B were high identified with N , RPS2 , L6 and belonged to broad2spectrum RGA , 6 RGAs amplified by primer C
were high identified with Cf2 , Cf9. 14 RGAs amplified by both primer B and primer C were relative to function of
resistancee to Phytophthora blight . RGAs derived from susceptible lines were also associated with function of resis2
tant to Phytophthora blight , which was accorded with reported viewpoint that resistant minor QTLs derived from sus2
ceptible parents. These pepper RGAs could be regarded as candidate sequences of disease resistance genes in Cap2
sicum annuum using cloning resistant genes and molecular markers.
Key words : Capsicum annuum ; Phytophthora blight ; Resistance gene analogs
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