全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 02-0126-04
柠条锦鸡儿 DNA提取及 AFLP反应体系的建立
王　赞1, 2,高洪文2* ,韩建国1
( 1.中国农业大学草地所 ,北京　100094; 2.中国农业科学院畜牧所, 北京　100094)
摘要: 以柠条锦鸡儿( Caragana kor shinskii)种子为材料,利用改进的酚一氯仿法, 提取到高质量的 DNA, 建立柠条锦鸡
儿 AFLP 银染反应体系。结果表明:首次在柠条锦鸡儿 DNA 提取、酶切连接、预扩增和选择性扩增等实验过程取得成
功; 得到清晰的柠条锦鸡儿 AFLP 指纹图谱;为建立柠条锦鸡儿基因库、品种选育以及亲缘关系的研究提供参考。
关键词: 柠条锦鸡儿; DNA 提取; AFLP
中图分类号: Q943　　　文献标识码: A
DNA Extraction Method and Profile of AFLP Fingerprint
of Caragana korshinskii
WANG Zan
1, 2
, GAO Hong-w en
2
, HAN Jian-guo
1
( 1. Inst itute of Grassland S cien ce, Ch ina Agricultural University, Beijing 100094, China;
2. Inst itute of Anim al Scien ce, Chin es e Academy of Agricultural Science , Beijing 100094, China)
Abstract: T he ext ract ion o f DNA w ith phenol-choloro for e method from Car agana korshinskii seed and AFLP
fingerprint prof ile of C. kor shinskii were studied. T he high r esolution AFLP fingerprints w ere clear, show ing
the success in the DNA ex tract ion, r est rict ion-l ig ase r eaction, pre-amplif icat ion and silver staining techniques.
The resul ts could supply references to the gene poo l establishment , select ion and breeding of cult ivars and
genet ic relationships in C. korshinski i.
Key words : Caragana korshinsk ii; DNA ex tract ion; A FLP
　　AFLP(扩增的限制性片段长度多态性)被认为是
目前最有效的一种分子标记方法 [ 1] , 广泛用于遗传多
样性检测、天然居群的遗传结构、保护生物学研究、构
建遗传图谱和定位克隆基因等诸多研究领域 [ 2～4]。但
是关于柠条锦鸡儿( Caragana korshinski i)分子标记的
研究不多。魏伟等 [ 5]利用 RAPD方法进行了探讨, 而
AFLP 的研究还未见报道。由于柠条锦鸡儿叶片内多
酚及多糖等次生代谢物质含量高, DNA 提取比较困
难。为此,作者通过研究柠条锦鸡儿种子内 DNA 的提
取, 并建立和优化柠条锦鸡儿的 AFLP 银染反应体
系,以期为 A FLP 技术用于锦鸡儿属植物遗传多样性
及亲缘关系研究提供参考。
1　材料与方法
1. 1　材料
2003年 7—8月, 分别在山西、陕西、内蒙古、宁夏
等省区采集 12个柠条锦鸡儿自然居群,每个居群取
15个个体。
1. 2　DNA提取
采用 McDonald [ 6]改进的 SDS 方法(略加改动)。
具体方法如下: ( 1)每份材料取 3粒种子,除去种皮, 用
种子粉碎机磨成粉末, 放入经 65℃的水浴预热的含
700 Ll“S”缓冲液的离心管中, 保温 1～2 h (每隔 20
min 轻摇 1次) ; ( 2)加等体积的酚/氯仿溶液,轻摇 30
min, 使之充分混匀, 10 000 rpm 离心15 min; ( 3)取上
清,重复步骤( 2) ; ( 4)取上清加 2/ 3 体积的异丙醇( -20
℃预冷) ,上下混匀, -20℃放置 1 h; ( 5)用牙签挑出絮状
DNA 沉淀,加 150 Ll 70%乙醇洗2～3次, 10 000 rpm
收稿日期: 2005-03-29;修回日期: 2005-05-23
基金项目:国家“863”项目( 2002AA241091)
作者简介:王　赞( 1974-) ,男,内蒙古磴口人,博士研究生,主要从事牧草及草坪草种质资源研究; * 通讯作者 Author for correspondence
E-mail: gaohongw en@ 263. net; w angzan99@ sohu . com
第 13卷　第 2期
　Vo l. 13　　No. 2
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　2005年　 6 月
　June 　　2005
离心 15 m in; ( 6)弃上清,通风橱内干燥 DNA 沉淀, 直
至无乙醇味; ( 7)加入 600 Ll 1×TE 缓冲液和 10 Ll
RNaesA , 37 ℃过夜; ( 8)重复步骤( 2) ; ( 9)加入 1/ 10
体积的 NaAc( 3 mol/ l , pH 5. 2)和 2倍体积的无水乙
醇, -20 ℃放置 30 min; ( 10) 10 000 rpm 离心 15 min,
弃上清; ( 11) 70%乙醇洗 2～3次, 10 000 rpm 离心 15
min; ( 12)弃上清,通风橱内干燥 DNA 沉淀,直至无乙
醇味; ( 13)用适量的 1×TE 溶解 DNA 沉淀, -20 ℃保
存备用。
1. 3　DNA浓度及纯度检测
提取的 DNA 分别进行 0. 8%琼脂糖凝胶电泳, 紫
外分光光度仪检测其浓度和纯度, 并调整 DNA 浓度
至 200 ng/ Ll, 以 200 ng /Ll的 KDNA 为对照。
1. 4　AFLP反应体系的建立
1. 4. 1　酶切连接　采用M seI和EcoRI 2种限制性内切
酶进行双酶切。反应体系包括: T emple DNA ( 200 ng /
Ll) 5 Ll、M se I ( 10 U /Ll) 0. 3 Ll、EcoR I ( 20 U /Ll )
0. 15 Ll、M-adapter ( 50 pmo l/ l ) 1 Ll、E-adapter ( 50
pmol/ l) 1 Ll、T 4 ligase ( 1 U /Ll) 0. 5 Ll、T 4 Buf fer
2. 5 Ll、ATP ( 10 mM ) 2 Ll、ddH20 12. 55 Ll、总体积
25 Ll。混合液离心混匀, 37 ℃过夜, -20℃保存。EcoRI 接
头序列: 5-CTCGTAGACTGGAGT ACC-3, 3-CTG-
ACGCAT GGT TAA -5。M seI接头序列: 5-GACGAT -
GAGT CCT GAG-3, 3-T ACT CAGGGACTCAT -5。
1. 4. 2　预扩增反应　取 2 Ll酶切连接产物, 然后加
入 18 Ll 下列混合液: EcoR I 预扩增引物( 50 ng /Ll )
0. 6 Ll, MseI 预扩增引物( 50 ng /Ll) 0. 6 Ll、10 x PCR
Buf fer 2 Ll、MgCl2 ( 25 mM ) 1. 2 Ll、dNT P( 2. 5 mM )
0. 16 Ll、T aq酶( 5 U/Ll) 0. 12 Ll、ddH20 13. 32 Ll、总
体积 20 Ll。混匀后, 按照下列扩增程序进行预扩增:
94℃ 5 min; 94℃ 35s、56℃ 35 s、72℃ 60 s; 29 cycles:
72℃ 5 min。反应在 MJ research 公司的 PTC-225型
Gradient PCR仪上进行。反应结束后,取 5 Ll产物和 5
Ll loading buf fer 混合后在1%琼脂糖凝胶上检测扩增
效果。然后将预扩增产物用0. 1×T E稀释 20倍, -20℃
保存。预扩增引物序列: EcoRI + A 5-GACTGCGT -
ACCAATT CA-3 , MseI + C 5-GATGAGTCCTGA-
GTAAC-3
1. 4. 3　选择性扩增反应 　设计 8种选择性扩增反应
体系(表 1) , 按照下列扩增程序进行选择性扩增: 94℃
5 m in; 94℃ 35 s、65℃ 35 s ( touchdown 0. 7 ℃/
cy cles)、72℃ 60 s、12 cycles; 94℃ 35 s、56℃ 35s、72℃
60 s、35 cycles。反应在M J research 公司的PTC-225
型 Gradient PCR仪上进行。
1. 4. 4　聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物　用 6%
聚丙烯酰胺凝胶 60 ml 加入 10%的过硫酸铵 120～
200 Ll和T MEDA 60～100 Ll做板。采用北京市六一
仪器厂生产 DYY—12型电脑三恒多用电泳仪在80 w
功率下电泳约 2 h, 点样前在选扩产物内加入 6 Ll
loading buf fer ( 98%去离子甲酰胺, l0 mM EDT A,
0. 25%溴酚蓝, 0. 25% 二甲苯青) , 混合后, 95℃变性
5 min,取出后立即放入 0℃的冰盒内以防复性。电泳
后利用冰醋酸固定、硝酸银染色、无水碳酸钠加上甲醛
以及硫代硫酸钠显影。干胶后拍照。
表 1　AFLP 反应体系稳定性评价
Table 1　Evaluation of the AFLP reaction system stabilit y
体系 1
Sys 1
体系 2
Sys 2
体系 3
Sys 3
体系 4
S ys 4
体系 5
Sys 5
体系 6
Sys 6
体系 7
S ys 7
体系 8
S ys 8
DNA 2 2 2 2 4 4 4 4
EcoRI 引物( 50 ng/ Ll )
EcoRI primer( 50 n g/ Ll)
0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8
MseI 引物( 50 ng/ Ll)
MseI pr imer( 50 ng/ Ll )
0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8
10 x PCR Buf fer 2 2 2 2 2 2 2 2
MgCl 2( 25mM) 1. 2 1. 2 1. 3 1. 3 1. 2 1. 2 1. 3 1. 3
dNT P( 2. 5 mM ) 0. 18 0. 18 0. 18 0. 18 0. 18 0. 18 0. 18 0. 18
T aq酶( 5 U / Ll)
T aq enzym e( 5 U/ Ll )
0. 2 0. 3 0. 2 0. 3 0. 2 0. 3 0. 2 0. 3
ddH20 12. 82 12. 72 12. 72 12. 62 10. 82 10. 72 10. 72 10. 62
2　结果与分析
2. 1　柠条锦鸡儿种子 DNA提取
实验优化了从柠条锦鸡儿种子中提取 DNA 的方
法, 在提取过程中未出现多酚类物质的褐化现象,
DNA 溶液无色透明。经过 Agaro se 凝胶电泳检测(图
1) ,所提 DNA主带完整, 没有降解,无 RNA 污染。紫
127第 2期 王赞等:柠条锦鸡儿 DNA 提取及AFLP 反应体系的建立
外分光光度计检验结果显示, OD260 / OD 280比值 1. 7～
1. 9, DNA 纯度较高。将 DNA 浓度调整至 200 ng/Ll
左右,完全符合柠条锦鸡儿 AFLP 分析的要求。
图 1　柠条锦鸡儿种子基因组 DNA 在 0. 8%
琼脂糖上的检测结果
Fig. 1　T he profile o f C . kor shinskii seed DNA
in 0. 8% of agaro se gel
2. 2　酶切连接
实验采用酶切连接同时进行,节约了时间和药品
用量。研究比较柠条锦鸡儿基因组 DNA 不同用量的
酶切效果, 结果表明, 400 ng /Ll、500 ng /Ll 基因组
DNA 酶切后, 最终得到的谱带少,且谱带多集中于测
序胶的上部;以 100 ng/Ll基因组 DNA 用于酶切时,
预扩增后得到的模板浓度低;取 200 ng/Ll、300 ng/Ll
进行酶切,则既可酶切完全,又能在预扩增后得到合适
浓度的模板。因此, 确定在 25 Ll酶切连接体系中以
200 ng/ Ll基因组 DNA 为宜(图 2)。
图 2　酶切连接产物检测
F ig . 2　The pro file of C . korshinsk ii DNA in
rest rict ion lig ase r eaction
2. 3　预扩增
预扩增的目的是为选择性扩增提供大量的模板,
同时对模板起到选择性纯化的作用, 因此预扩增引物
一般只含有一个选择性碱基或不含选择性碱基(本研
究采用含一个选择性碱基的引物) , 选择性能较差, 因
此大量的扩增产物在琼脂糖凝胶中往往形成连续的一
片,即通常所说的“smear”状: 理论上预扩增产物的分
子量的大小应在 1500 bp以下, 大部分产物集中在400
bp左右。在研究中 200 ng /Ll基因组 DNA 经预扩增
后的电泳图片中可以看出, 弥散带分散均匀且连续成
一片,结果符合 AFLP 分析的要求(图 3)。
2. 4　选择性扩增
选择好的扩增体系是保证结果可靠性和可比性的
前提。本实验参考了其它植物 AFLP 程序[ 7～11] , 设计
了 8个选扩体系,考虑影响反应的主要因素 DNA 模
板、Mg2+ 、Taq酶等。结果表明,在 8个选择扩增体系
中,以体系 1和体系 5最稳定,变异系数最小,平均扩
增谱带最多, 其它几个体系均不太稳定。说明体系 1和
体系 5扩增效率高,对预扩增产物反应不敏感, 是较好
的选扩体系。利用体系 1对引物组合M71/ E72扩增结
果显示, AFLP 带纹相当丰富,在不同的材料间表现出
丰富的多态性(图 4)。
图 3　预扩增检测结果
F ig . 3　The pro file of C . korshinsk ii DNA
by pre-amplification
图 4　柠条锦鸡儿种子 AFLP 指纹图谱
(引物组合M71/E72)
Fig. 4　The AFLP fingerprint pr ofile o f C . kor shinskii
seed ( pr imer M71/ E72)
3　讨论与结论
3. 1　对于植物基因组 DNA 的提取, 大多数人采用成
熟的幼叶为材料。主要是由于幼叶中次生物质如多酚、
多糖、乳汁、树脂等含量少, 对于提取高质量 DNA 来
说易于成功。但是以叶片为材料需要种子萌发、光照培
养及液氮研磨等过程, 对于大量实验材料来说, 费时、
费力。而以种子为材料则可克服这一不足。本实验在
McDonald
[ 6]提取方法的基础上作了如下改进: ( 1)尽
可能去除种皮, 减少种皮中所含杂质如色素对 DNA
质量的影响,去掉种皮提取的 DNA 无色透明,而不去
种皮提取的 DNA 呈红褐色; ( 2)提高 SDS 提取液的浓
度,由 1%～2%提高到 4%, 以尽可能破碎细胞壁、细
胞膜, 使核酸与蛋白质完全解离,并有利于增加 DNA
的产量; ( 3) 加入高浓度的盐离子 ( 3M NaAc, pH
128 草　地　学　报 第 13卷
5. 2) ,以去除多糖类及色素等杂质,同时可沉淀更多的
蛋白质; ( 4)由于实验材料为野生种, 加入 PVP-40 和
巯基乙醇,以防止酚类、醌类物质对 DNA 的降解; ( 5)
增加酚/氯仿抽提次数, 以去除杂质和多余的酚, 可能
会损失一些 DNA ,但是从长远看还是值得的; ( 6)第一
次异丙醇沉淀后,用牙签调处沉淀, 反复清洗,而不是
离心, 不仅能够使 DNA 沉淀和其他杂质分开, 而且
DNA 沉淀在松弛状态下漂洗,可以洗去粘附在上面的
大部分色素; ( 7)将已充分溶解过的 DNA 溶液高速离
心,弃沉淀,从而能除去附着在 DNA 上的不溶物。
3. 2　柠条锦鸡儿 AFLP 指纹图谱构建过程, 除对模
板 DNA 的质量要求高外,酶切链接、预扩增、选择性
扩增以及扩增产物的检测每一步都很关键。任何一步
出错,都会导致整个实验的失败,因此必须对反应的每
一步进行优化。本实验在参照其它植物 AFLP 分析的
基础上[ 7～11] , 经过反复优化, 探索出适合柠条锦鸡儿
AFLP 分析的整个程序, 用 M seI和 EcoRI 对 200 ng /
Ll的模板 DNA 进行双酶切; 在总体积 20 Ll的条件
下,预扩增体系包括 E coR I 引物 ( 50 ng/Ll ) 0. 6 Ll、
MseI 引物( 50 ng/Ll ) 0. 6 Ll、10 x PCR Buf fer 2 Ll、
MgCl2 ( 25 mM ) 1. 2 Ll、dN TP( 2. 5 mM ) 0. 16 Ll、T aq
酶( 5 U /Ll) 0. 12 Ll; 选扩体系包括 EcoRI 引物 ( 50
ng/Ll) 0. 8Ll、M seI引物( 50 ng /Ll) 0. 8 Ll、10 x PCR
Buf fer 2 Ll、MgCl2 ( 25 mM ) 1. 2 Ll、dNT P( 2. 5 mM )
0. 18 Ll、T aq酶( 5 U /Ll) 0. 2 Ll。
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(上接 120页)
表 7　品质指标分析
Table 7　Quality index analy sis
月份
Month
品种
Varieties
干物质
Dry mat ter( % )
适口性
Palatabi lit y
消化率
Dig est ible rate( % )
营养价值
Nutrit ive value
饲用价值
Feedin g value
叶茎比
( l eaf / s tem)
11- 2 闽牧 42 Minmu 42 17. 1 5A 53. 09 14. 26 17. 12 7. 16
象草 P ennisetum p urp ureum 20. 8 3C 43. 74 12. 42 14. 16 5. 92
闽糖 86-05 Mintong 86-05 18. 8 5A 38. 61 13. 79 14. 79 5. 31
3- 5 闽牧 42 Minmu 42 16. 3 5A 50. 42 12. 86 15. 94 5. 24
象草 P ennisetum p urp ureum 20. 55 3C 51. 92 12. 11 15. 15 5. 92
闽糖 86-05 Mintong 86-05 17. 2 5A 46. 70 13. 93 16. 02 7. 30
6- 8 闽牧 42 Minmu 42 18. 72 5A 45. 11 14. 72 16. 25 1. 17
象草 P ennisetum p urp ureum 16. 7 5C 66. 30 17. 24 20. 69 0. 43
闽糖 86-05 Mintong 86-05 23. 5 5C / / / 1. 65
9- 10 闽牧 42 Minmu 42 16. 3 5A 41. 23 13. 87 15. 21 3. 34
象草 P ennisetum p urp ureum 16. 9 5C 38. 55 14. 27 15. 06 1. 14
闽糖 86-05 Mintong 86-05 22. 9 5A / / / 2. 25
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