全 文 ：第 17 卷
第 1 期

Vol. 17
No . 1
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
1 月

Jan.

2009
结缕草属植物 ISSR-PCR反应体系研究
王志勇1, 2 ,袁学军2 , 郭海林2 , 刘建秀2* , 程晓丽2 , 周志芳2
( 1. 南京农业大学园艺学院,中国 南京
210095; 2. 江苏省中国科学院植物所(南京中山植物园) , 中国 南京
210014)
摘要:以 SDS 法提取的结缕草( Zoy sia spp. )叶片 DNA 为模板, 应用正交试验设计, 从 M g2+ 、dNT P、引物和 DNA
聚合酶并通过比较不同浓度的模板 DNA 对 PCR 扩增的影响,确立结缕草属植物 I SSR- PCR反应的最佳体系。结
果表明:各因素不同浓度对 PCR反应结果有显著影响, 正交设计可以用于 ISSR反应体系建立, 该方法建立的结缕
草属植物 ISSR-PCR优化反应体系为 10X Buffer、70 ng 模板 DNA、Mg2+ 2. 0 mmol
L - 1、dNTP 150
mo l
L - 1、
Pr imer 0. 3
mol
L- 1、Taq DNA 聚合酶 1. 0 U ,总体积 20
L; 经对 11 份结缕草属植物进行检验, 证明该体系稳定
可靠。该体系的建立可为今后利用 ISSR标记技术进行结缕草属遗传多样性研究、种质资源鉴定和亲缘关系分析
等提供依据。
关键词:结缕草; ISSR-PCR; 正交试验; 体系优化
中图分类号: Q943. 2




文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2009) 01-0048-04
Optimization of ISSR-PCR System on Zoysia spp.
WANG Zh-i yong 1, 2 , YUAN Xue-jun2 , GU O Ha-i lin2 , L IU Jian-x iu2*
CHENG Xiao- li2 , ZHOU Zh-i fang2
( 1. Department of H ort icul tu re, Nan jing Agricultu ral Univeristy, Nan jing, J iang su 210095, Chin a;
2. In st itute of Botany, Jiangsu Province and C hinese Academ y of S cien ces , Nanjing, Jiangsu Province 210014, China)
Abstract: T he ISSR-PCR sy stem w as opt im ized and the ef fects of template DNA w ith dif ferent concentra-
t ions on the PCR amplif icat ion w ere studied by an orthogonal experimental design w ith 3 dif ferent lev els of
4 factors, e. g . M g2+ , dN TP, primers, and Taq DNA po lymerase. T he results show that each factor in
dif ferent levels had signif icant effect on the amplificat ion result of PCR and the orthogonal design w as use-
ful to optim ize the ISSR-PCR sy stem. The opt im ized PCR r eaction system for Zoy sia spp. w as 10X Buf f-
er, 70 ng genom ic DNA template, 2. 0 mmol
L- 1 Mg2+ , 150
mo l
L - 1 dNTP, 0. 3
mol
L- 1 Pr imer,
1. 0 U T aq DNA po lymerase w ith total react ion solution of 20
L. T he sy stem w as pr oved stable and cred-i
ble according to the result of 11 Zoy sia spp. and the result of this study could be useful to pro vide the basis
in the analysis of g enet ic diversity, germplasm identif icat ion, and kinship of Zoy sia spp.
Key words: Zoy sia spp. ; ISSR-PCR; Orthogonal design; Sy stemat ic opt imizat ion


结缕草属( Zoy sia spp. )为禾本科画眉草亚科
的多年生草本植物, 是一种优良的暖季型草坪草, 具
有非常发达的地下茎和匍匐茎, 耐旱、耐盐碱、病虫
害较少,耐磨性、耐寒性较强, 在低水平养护下亦有
不俗的表现, 是国内外公认的典型环保型草坪草。
结缕草属约有 11种, 其中我国有 5种, 2变种, 1变
型, 5个种为大穗结缕草( Z. macrostachya Franch.
et Saw . ) , 中华结缕草 ( Z. sinica H ance) , 结缕草
( Z. j aponica Steud. ) , 沟叶结缕草 ( Z. matr el la
( L . ) M er r. ) ,细叶结缕草( Z. tenuif ol ia Willd. ex
T rin. ) , 2变种为长花结缕草( Z. sinica v ar . nip-
ponica Ohw i. )和青结缕草( Z. j ap onica var . p ol-
lida Nakai et Honda) , 1 变型为大穗日本结缕草
( Z. j aponica f. macr ostachya H. D. Kung et L.
J. Gong)。结缕草属的生长习性 [ 1~ 3]、结实性[ 11]、
抗逆性[ 4~ 6] 、育种[ 7] 、染色体[ 8] 、同工酶 [ 9, 10] , 以及结
收稿日期 : 2007-04-12;修回日期: 2008-12-15
基金项目:国家自然基金项目( 30571307) ;江苏省高技术项目( BG2006320)资助
作者简介:王志勇( 1979- ) ,男,江西景德镇市人,在读博士,研究方向为草坪植物种质评价与遗传育种; E-mail: fafu 301@ yahoo. com. cn; *
通讯作者 Author for correspondence, E-mail: turfunit@ yah oo. com. cn
第 1期 王志勇等:结缕草属植物 ISSR- PCR 反应体系研究
缕草分子水平的分子标记 [ 12~ 14] 等方面已有报道。
本实验采用 10 X Buf fer 和正交设计对其反应体系
进行优化,并在获得最佳扩增基础上,首次对结缕草
属植物 5个种进行扩增, 得到理想的结果,为该技术
进行结缕草遗传多样性评价、不同种质资源鉴定及
明确亲缘关系等奠定基础。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
供试材料为结缕草属植物中的 Z. j aponica、
Z. sinica、Z. matr el la、Z. tenui f ol ia、Z. macrosta-
y cha 5个种 12份材料, 其中 z119用作体系优化,其
他均用作体系验证(表 1)。
表 1
供试材料
T able 1
Exper imental mater ials
序号
Number
材料
Mat erial
种名
Specific name
来源




Source




1 z141 Z. j aponi ca 江苏宜兴 Yix ing , Jiangsu
2 z136 Z. j aponi ca 美国 USA
3 z109 Z. j aponi ca 辽宁大连 Dalian, Liaoning
4 z116 Z. sinica 山东枣庄 Zaozhuang, Shandong
5 z039 Z. sinica 安徽宁国 Ningguo, Anhui
6 z021 Z. sinica 山东胶州湾 Jiao zhouwan, Shandong
7 z114 Z. matrell a 北京 Beijing
8 z123 Z. matrell a 美国 USA
9 z075 Z. matrell a 台湾 T aiwan
10 z160 Z. tenui f oli a 重庆 Chongqing
11 z130 Z. macrost ay cha 浙江普陀山 Put uo shan, Zhejiang
12 z119 Z. j aponi ca 江苏响水 Xiangshui, Jiang su
1. 2
试验方法
1. 2. 1
基因组 DNA 提取
样品 DNA 提取采用
SDS法,具体操作参照郭海林等的方法[ 18]。
1. 2. 2
DNA质量检测
用 1. 0%琼脂糖电泳检测
DNA 质量完整性。采用琼脂糖凝胶电泳, 取 2
L
DNA 溶液,加入 0. 2 mL 的小离心管中, 再加入 2

L 6
Loading buf fer, 稍加离心, 上样于 0. 8% 的
琼脂糖凝胶, 在 1
TAE 的电泳缓冲液中进行水平
板电泳(电泳仪为 DY-A 型电泳仪,电泳槽为 H2-中
号水平电泳槽) , 电泳电压为 60 V, 时间 60 min 左
右,电泳结束后,用溴化乙锭( EB)染色, 染色后在上
海培清科技有限公司 JS-380 自动凝胶图像分析仪
观测分析并照相。最后确定 DNA 浓度(图 1)。
1. 2. 3
PCR反应体系正交试验
采用 L 9 ( 34 )正交
试验设计,对 Mg2+ 、dNTP、引物、T aq DNA 聚合酶
进行 4因素 3 水平筛选(表 2、3)。ISSR引物购自
南京生兴生物工程公司, dNT P 和 Taq酶购自南京
申能博彩公司。DNA marker 购自南京 TaKaRa
公司。
图 1
部分结缕草基因组 DNA 原液电泳图
Fig. 1
Electr ophoresis o f Zoy s ia spp. genomic DNA
注: 1代表部分结缕草基因组 DNA 原液; 2-5为
DNA, 浓度从
左至右分别为 50、100、150、200
g

L- 1
Note: 1. Gen om ic DNA of Zoy sia spp. ; 2-5.
DNA, the con-
cent rat ion of
DNA from lef t t o right are 50、100、150、and 200

g

L- 1
表 2
ISSR-PCR 体系的因素-水平
T able 2
Fact ors and levels o f ISSR-PCR system
水平
L evel
因素 Fact or
Mg 2+
( mmol
L- 1)
dNTP
(
mo l
L- 1 )
P rimer
(
mo l
L - 1 )
T aq DNA
Po lymerase, ( U )
1 1. 5 100 0. 30 0. 5
2 2. 0 125 0. 60 1. 0
3 2. 5 150 0. 90 2. 0
表 3
ISSR-PCR 正交试验设计[L9 (34 )]
Table 3
Ort ho ronal design fo r ISSR-PCR [L9 ( 34 ) ]
处理编号
T reatment
number
因素 Facto r

Mg2+
( mmol
L- 1)
dN TP
(
mol
L- 1)
Pr imer
(
mol
L- 1)
T aq DN A
Polymerase, ( U)
1 2. 5 150 0. 60 0. 5
2 2. 5 125 0. 30 2. 0
3 2. 5 100 0. 90 1. 0
4 2. 0 150 0. 30 1. 0
5 2. 0 125 0. 90 0. 5
6 2. 0 100 0. 60 2. 0
7 1. 5 150 0. 90 2. 0
8 1. 5 125 0. 60 1. 0
9 1. 5 100 0. 30 0. 5
1. 2. 4
PCR反应条件
根据表 2、3制备总体积为
20
L 的 PCR反应体系, 除表中变化因素外, 每管
中还含有 10X PCR Buf fer 和 100 ng 模板 DNA,引
物选用 ISSR-61。引物序列为: ( A G) 8GT。PCR扩
增程序为: 95
预变性 3 m in; 94
变性 45 s, T m

(具体温度参照引物合成单推荐温度)复性 30 s,
72
延伸 90 s, 35个循环; 72
延伸 5 min, 4
保
存, 扩增反应在英国TECHNE公司的 TC-412 PCR
仪上进行。扩增反应结束后, PCR 产物在1. 3%琼
49
草
地
学
报 第 17卷
脂糖凝胶上电泳,凝胶中含 0. 05% 的溴化乙锭, 电
极缓冲液为 1 X T AE, 电压 5V/ cm ,电泳结束后在
上海培清科技有限公司 JS-380 自动凝胶图像分析
仪观测分析并照相。
1. 2. 5
模板 DNA 浓度筛选
应用上述体系最佳
组合,引物选用 ISSR-61, 20
L 体系中模板 DNA
浓度设为 50、60、70、80、90、100、110、120、130 ng

( 20
l) - 1共 9个处理。
1. 2. 6
优化体系应用
根据以上实验结果确定
ISSR-PCR的最佳反应体系和扩增条件。从筛选的
引物中随机选取引物 ISSR-17( GACAGA CAGA-
CAGACA) ,对 11份结缕草属植物进行扩增, 对筛
选出的最佳体系进行稳定性检测。
1. 3
数据处理
数据与图片处理在正交设计软件 3. 1、Word
2000和 Pho toshop 7. 0上完成。
2
结果与分析
2. 1
PCR扩增效果分析
PCR的扩增结果是 Mg2+ 、dNTP、Primer 和
DNA 聚合酶等因素综合作用的结果, 在 9个组合
中,由于浓度组合不同,其扩增结果差异显著。1和
2组合谱带数虽然很多, 但除一条较强, 其他均很
弱,可能是 Mg2+ 浓度过高而 dNTP 浓度偏高所致。
第 5、6、7、8、9组合谱带的数目相同, 但与 1 和 2 组
合相比,带的数目减少而条带比较清晰。其原因可
能是 Mg2+ 浓度较低时, PCR产物随着 dN TP 浓度
的增大而增加。第 3 组合谱带强度较弱, 可能是
Mg
2+ 浓度过高而 dNT P 浓度偏低所致。第 4 组合
谱带较强且谱带数目多、非常清晰,背景很小。通过
比较,以特异谱带多态性高、背景干扰低、主带清晰、
副带明显为原则,同时考虑实验成本因素, 确定第 4
组合为 ISSR-PCR的最佳反应体系, 即 20
L 反应
体系中含有 Mg 2+ 2. 0 mmol
L- 1、dN TP 150
mol

L - 1、Primer 0. 3
mol
L- 1、T aq DNA 聚合酶
1. 0 U(图 2)。
2. 2
模板浓度确定
在 20
L ISSR-PCR 反应体系中 DNA 模板的
量在 50~ 130 ng
( 20
L) - 1虽均能扩出条带,但模
板浓度较低[ 50 ng
( 20
L) - 1 ]时造成扩增条带的
缺少。在 60~ 130 ng
( 20
L) - 1谱带多态性高, 谱
带数目先增加而后保持不变, 当超过 70 ng

( 20
L) - 1时,谱带强度减弱。通过比较, 以特异谱
带多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明显为原
则,因此反应体系中 DNA 模板浓度确定为 70 ng

( 20
L) - 1 (图 3)。
2. 3
ISSR-PCR反应体系应用
从筛选出的引物中随机挑选引物 ISSR-17, 对
11份结缕草资源进行扩增, 以检测确定的 ISSR-
PCR反应体系的结果。该引物在 11份结缕草上都
能扩增出清晰、重复性好、多态性高的谱带,表明已
确立的 ISSR- PCR反应体系稳定可靠,可用于结缕
草遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究(图 4)。
3
讨论与结论
3. 1
与以往的单因素 PCR 设计相比, 利用正交实
验直观分析的方法,能够迅速获得满意的试验结果。
50
第 1期 王志勇等:结缕草属植物 ISSR- PCR 反应体系研究
本实验采用 L9 ( 34 ) 正交表, 用 ISSR-61 引物进行
PCR扩增, 通过对扩增结果的分析, 考察了引物、
Mg 2+ 、dN TP、Taq酶、模板 DNA等 5种 ISSR反应
成分浓度变化对扩增结果的影响,得到稳定可重复
的反应体系。
图 4
优化 ISSR-PCR反应体系对供试材料扩增结果
F ig. 4
Amplification r esult s o f different Zoy s ia spp.
g enemic DNA under the optimized ISSR-PCR reaction system
注: 1~ 11为表 1编号对应的结缕草属植物; M : DNA M ark er;
引物: 17
Note: 1-11 repres ents the different Zoy sia spp. , see table 1;
M : Mark er; Primer: 17
3. 2
ISSR分子标记技术基于 PCR反应, 其扩增谱
带虽较 RAPD标记稳定, 但同样受反应条件和扩增
程序变化以及物种不同的影响。ISSR-PCR扩增结
果受 PCR体系中 Taq DNA 聚合酶、引物、Mg 2+ 、
dNT P,模板 DNA 等多种因素影响, 并认为各因素
水平变化对 PCR反应的影响从大到小依次为: Taq
酶、引物、Mg2+ 、dNTP 和模板 DNA [ 15]。而王彦华
等认为 PCR的扩增结果受 Mg2+ 浓度影响最大 [ 16]。
无论哪种因素是主要因素, 每个因素间都会进行相
互作用。引物与模板结合后在 T aq酶作用下进行
延伸, TaqDNA 聚合酶是 Mg2+ 依赖性酶, 受 Mg2+
的浓度影响, 而 Mg2+ 又受 dNT P 的拮抗作用。因
此体系中一种因素发生变化都可能影响扩增的结
果。对于本实验结缕草 ISSR 反应体系来讲, 当
Mg 2+ 浓度、dN TP 浓度、Pr imer 浓度、DNA 浓度分
别为 2. 0 mmo l
L - 1、150
mol
L - 1、0. 3
mol

L- 1、70 ng
( 20
L) - 1和 T aq DNA 聚合酶为 1U
时可得到较好的扩增结果。此外, 不同的试验条件,
如不同厂家和不同批次的实验试剂,不同实验仪器,
不同实验材料等, 都有可能对扩增结果产生影响。
利用正交试验设计对 PCR 反应体系的多因素进行
筛选,可以较快地找到最优水平组合,避免单一因素
试验的不足。因此在新的实验条件下 PCR 反应体
系建立和优化, 正交试验是值得借鉴的方法。
3. 3
ISSR-PCR技术简单、快速、稳定和多态性高,
不必知道基因组背景信息,已被广泛应用于植物品
种鉴定、遗传作图、基因定位、分类、进化等诸多方面
的研究[ 17] 。本文在胡雪华等[ 14] 研究基础上加以改
进,并首次对结缕草属植物的 5个种( Z. j aponica,
Z. sinica, Z. matr el la, Z. tenui f olia, Z. mac-
rostay cha)进行 ISSR-PCR分析, 得到了丰富的扩增
谱带。本研究为日后草坪草种源鉴定、遗传多样性、
亲缘关系、优良性状标记等研究奠定了基础。
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(责任编辑
孟昭仪
才
杰)
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