全 文 ：第 16 卷 第 6 期
Vol. 16 No . 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 11 月
Nov. 2008
马蔺 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
王 康1, 2 , 董宽虎2 , 孙 彦3 , 康俊梅1* , 董 洁2 , 孟 林4
( 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 2.山西农业大学动物科技学院,太谷 山西 030801;
3.中国农业大学动物科技学院草地研究所,北京 100193; 4. 北京市农林科学院草业与环境发展中心, 北京 100097)
摘要: 根据正交试验设计原理, 设计探索正交试验和细调正交试验以确定马蔺( I r is lacteal Pall. v ar. chinens is
( F isch. ) Koidz) ISSR-PCR 反应体系中各成分的浓度,从 dNTP、T aq酶、Pr imers、M g2+ 4 种因素对马蔺 ISSR 反应
体系进行了优化,得到适合马蔺的 I SSR-PCR最佳反应体系, 即 25 l的反应体系中含有 dNTP 0. 3 mmo l/ L、Taq
酶1. 5 U、P rimer s 0. 4mol/ L、M g2+ 2. 5 mmo l/ L 以及 1 buffer 和50 ng 模板DNA。通过对马蔺 ISSR-PCR 最佳
反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为 52 。这一体系的建立为今后利用 I SSR 标记技术
研究马蔺遗传多样性奠定了基础。
关键词: 马蔺; ISSR-PCR; 反应体系; 正交优化
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 05-0580-06
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Iris lacteal
WANG Kang
1, 2
, DON G Kuan-hu
2
, SU N Yan
3
, KANG Jun-mei
1
* , DONG Jie
2
, MENG Lin
4
( 1. Inst itute of Animal Sciences, CAAS, Beijin g 100193, China;
2. Sch ool of An imal S cien ce, Shanxi Agricu ltural U nivers ity, T aigu , Sh anx i 030801, China;
3. Inst itute of Gras sland Science, China Agricu ltural U nivers ity, Beij ing 100193, China;
4. Beijing Research Developm ent Center for Grass and E nvironment , BA AFSR Beijing 100097, China)
Abstract: In this paper, tw o or thogonal experiments w ere conducted to opt imize ISSR amplificat ion sy stem
of Ir i s lacteal Pall. var. chinensi s ( F isch. ) Koidz. Results show that the opt imum concentrat ions of react-
ants in 25 l react ion mix ture w ere as follow s: dNT P 0. 3 mmo l/ L , T aq DNA polymerase 1. 5 U, Primers
0. 4 mo l/ L, M g2+ 2. 5mmol/ L , 1 buf fer and 50 ng template DNA. T he opt imal annealing temperature
of this primer w as proposed by gr adient PCR at 52 for ISSR-PCR react ion. The result pr ovided a stand-
ardized ISSR-PCR pr ogram for the analy sis of g enetic diver sity o f I . lacteal var. chinensis.
Key words: Ir is lacteal Pall. var. chinensis (Fisch. ) Koidz; ISSR-PCR; Reaction system; Orthogonal optimization
马蔺( Ir is lacteal )又称马莲、马兰花,为鸢尾科
鸢尾属多年生草本植物, 广泛分布于我国东北、华
北、华南等地[ 1]。其根系发达, 耐涝、耐旱、耐贫瘠,
在观赏、坪用、饲用及药用等方面的价值较高。目前
关于马蔺的研究主要集中在形态特性、农艺性状、引
种繁殖、核型分析、生态功能、抗逆性和药理学特性
等方面[ 2~ 4] , 对于种、属间遗传多样性的研究报道较
少[ 5]。
ISSR分子标记技术是由加拿大蒙特利尔大学的
Zietkiew icz等人于 1994年提出的[ 6]一种利用 PCR扩
增进行检测的DNA标记, 它与 SSR标记技术相似,
所用的引物是基于简单重复序列而设计的寡核苷酸
引物,用来检测两个 SSR 之间的一段短 DNA 序列
的差异。该技术由于具有多态性水平高、可重复性
好、DNA 用量少、成本低廉等优点,近年来广泛应用
于品种鉴定、种质资源和遗传多样性分析、遗传图谱
收稿日期: 2008-03-10; 修回日期: 2008-05-07
基金项目: 北京市科学自然基金项目( 6062012) ;院所基本科研业务费专项基金创新团队( yw f-td-3)
作者简介: 王康( 1982-) ,男,山西霍州人,硕士研究生, 研究方向为草地资源与草地管理, E- mail : w an gkan gkan g224@ yah oo. com. cn ;
* 通讯作者 Auth or for correspon dence, E-m ail : kangjm ei@ yahoo. com. cn
第 6期 王康等:马蔺 ISSR- PCR反应体系的建立与优化
构建[ 7~ 9] 。在牧草上, 如紫花苜蓿( M edicago sat i-
va)、羊茅 ( F estuca ov ina)、拂子茅( Calamagr ost is
br achy t ri cha)、冰草( A gr opy ron crstatum ( L inn. )
Gaer tn. )、雀麦 ( Br onus j ap onicus )、黑麦 ( Secale
cer eale L . )、沙打旺( A st r agalus adsur gens P al l . )、
胡枝子( L esp edez a f ormesa( Vog . ) K oehne)等, IS-
SR分子标记也得到广泛应用[ 10] 。
虽然 ISSR有诸多优点, 但由于它是基于 PCR
反应的一种标记,所以不同物种对反应体系和程序
存在一定的差异。为了实现 ISSR分析结果的可靠
性和重复性,进行 ISSR-PCR 反应体系的优化是非
常必要的。本试验采用 2 次正交试验, 从 dNT P、
Taq酶、Mg2+ 、引物 4个因素 3个水平进行马蔺 IS-
SR-PCR反应体系的优化分析[ 11]。由于正交试验
设计具有均衡分散、综合可比及可伸缩、效应明显等
特性,既减少了试验的规模, 又不使信息损失得太
多,克服了单因素试验顾此失彼、试验规模巨大的缺
点[ 12, 13] , 因此可最快地找到最优水平组合, 可为马
蔺分子水平的进一步研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 材料及来源
供试材料马蔺采自北京郊区小汤山北京市农林
科学院国家精准农业示范园牧草资源试验基地。共
有 24份不同来源的马蔺材料, 分别栽培于 24 个小
区,每小区采样 4~ 5株, 每株取幼嫩叶片 6 g 左右。
1. 2 基因组 DNA的提取
采用改良过的 CTAB 法提取基因组 DNA[ 14]。
用0. 8%的琼脂糖电泳检测 DNA质量,其浓度通过紫
外分光光度计测定,并将 DNA浓度稀释为 10 ng/ l。
1. 3 ISSR-PCR扩增
ISSR引物由上海生物工程技术服务有限公司
合成,本试验以 834 号引物为固定引物, 其序列为
5-AGAGAGAG-AGAGAGAGYT-3。
PCR扩增在德国产的 Biometra 上进行,扩增程
序为: 94 预变性 3 min, 94 变性 30 s, 52 退火
30 s, 72 延伸 1 min, 进行 35个循环, 最后 72 延
伸 10 m in,然后置于 4 保存。
扩增结束后, 取 6 l PCR扩增产物与 1 l 6
加样缓冲液混匀, 点入含 0. 05% EB的 1. 2%琼脂
糖凝胶中电泳,电压 90V, 胶板在凝胶成像系统上观
察照相。
1. 4 ISSR-PCR反应体系的正交试验设计
采用L 9 ( 34 )正交设计表,首先对 dNT P、引物浓
度、Taq酶浓度、Mg 2+ 浓度[ 15] 进行 4 因素 3水平的
探索正交试验(表 1、表 2) ,再根据探索正交试验的
结果缩小各个因素的浓度梯度, 进行细调正交试验
(表 3、表 4)。除表中变化因素外,每管( 25 l体系)
中还含有 1 buf fer 和 50 ng 模板 DNA, 试验设 2
次重复。
对细调正交试验结果用紫外可见分光光度计
( U V-2102)测出每管核酸的相对浓度和, 即在波长
260 nm 紫外光下, 1 OD 值的光密度相当于双链
DNA 浓度为 50 g/ ml[ 16] , 然后进行正交直观分析。
1. 5 ISSR-PCR体系稳定性检测
选用其它小区的马蔺 DNA, 分别用细调正交试
验 9个处理组合中的最好组合和统计理论上的最佳
组合进行比较, 检测 ISSR-PCR扩增效率及体系的
稳定性。
1. 6 最佳退火温度的确定
在试验确定的最佳反应体系基础上, 使用美国
Thermo公司生产的 PCR仪进行最佳退火温度的筛
选。设 8个退火温度梯度: 46. 1 、48. 6 、50. 1 、
51. 9 、53. 7 、55. 7 、57. 7 、59. 8 。
表 1 探索正交试验水平 因素
Table 1 Explo ration o f or thogona l design ( leve-l facto r)
水平
Level
dNTP 浓度 dNTP
( mm ol / L)
Taq酶浓度
T aqDNA polym erase( U )
引物浓度
Primers(mol /L )
Mg2+ 浓度
Mg2+ ( mmol/ L)
1 0. 1 0. 5 0. 2 1. 0
2 0. 3 1. 5 0. 4 2. 0
3 0. 5 2. 5 0. 6 3. 0
581
草 地 学 报 第 16卷
表 2 探索正交试验设计表-L9 ( 34 ) 单位 :l
T able 2 Explor ation of o rthogonal design fo r PCR reaction- L 9 ( 34) Unit: l
编号
Number
dNTP 用量
dNT P( 10mM)
Taq酶用量
T aq DNA polym erase( 2. 5U /l)
引物用量
Prim ers ( 10 m ol/ L)
Mg2+ 用量
Mg2+ ( 25 mM)
1 0. 25 0. 2 0. 5 1. 0
2 0. 25 0. 6 1. 0 2. 0
3 0. 25 1. 0 1. 5 3. 0
4 0. 75 0. 2 1. 0 3. 0
5 0. 75 0. 6 1. 5 1. 0
6 0. 75 1. 0 0. 5 2. 0
7 1. 25 0. 2 1. 5 2. 0
8 1. 25 0. 6 0. 5 3. 0
9 1. 25 1. 0 1. 0 1. 0
表 3 细调正交试验水平 因素
T able 3 F ine adjustment of o rthogonal design ( leve-l fact or)
水平 Level dNTP 浓度
dNT P( mmol/ L)
Taq酶浓度
T aqDNA polym erase( U )
引物浓度
Primer s(mol/ L)
Mg2+ 浓度
Mg2+ ( mmol/ L)
1 0. 1 0. 5 0. 2 2. 0
2 0. 2 1. 0 0. 3 2. 5
3 0. 3 1. 5 0. 4 3. 0
表 4 细调正交试验设计表-L9 ( 34 ) 单位 :l
Table 4 Fine adjustment o f or thogonal design for PCR reaction-L9 ( 34 ) Unit: l
编号
Number
dNTP 用量
dNT P( 10mM)
Taq酶用量
TaqDNA polymeras e( 2. 5U/ l)
引物用量
Primers( 10mol/ L)
Mg2+ 用量
Mg2+ ( 25mM)
1 0. 25 0. 2 0. 50 2. 0
2 0. 25 0. 4 0. 75 2. 5
3 0. 25 0. 6 1. 00 3. 0
4 0. 50 0. 2 0. 75 3. 0
5 0. 50 0. 4 1. 00 2. 0
6 0. 50 0. 6 0. 50 2. 5
7 0. 75 0. 2 1. 00 2. 5
8 0. 75 0. 4 0. 50 3. 0
9 0. 75 0. 6 0. 75 2. 0
2 结果与分析
2. 1 ISSR-PCR探索正交试验结果及其分析
探索正交试验结果见图 1。各处理组合结果不
尽相同, 1号和 2号处理没有扩出清晰的条带, 3 号
处理只有 1管能扩出条带, 6、7、9号重复性不太好,
说明这些处理组合反应体系稳定性不高, 可能由于
试验所设计的各个因素梯度较大, 有些处理偏离最
优组合较远。其中 4、5、8号处理组合重复性好, 条
带多且清晰, 说明距最优组合偏差不大。再以其为
基点,缩小各个因素的浓度梯度进行细调正交试验。
图 1 ISSR-PCR探索正交试验结果
F ig . 1 Electropho resis of ISSR-PCR o f or thogonal design explorat ion
M: 分子量标准 DL2000; 1-9:处理组合,参见表 2
M : DL2000 marker; 1-9: Treatm ent number, as sh ow n in T able 2
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第 6期 王康等:马蔺 ISSR- PCR反应体系的建立与优化
图 2 ISSR-PCR细调正交试验结果
F ig . 2 Electropho resis of ISSR-PCR of fine-adjusted or thogona l design
M :分子量标准 DL2000; 1-9:处理组合,参见表 4
M : DL2000 marker; 1-9: Treatm ent number, as sh ow n in T able 4
细调正交试验结果见图 2。所有的处理组合都
可扩出数条条带,其中 1、2和 3号条带较弱; 4号和
8号多态性不高; 5号和 9号组合虽可扩出清晰的条
带但 2次重复结果不太一样, 说明其反应体系不太
稳定。试验效果最好的是 4号和 7号处理组合, 总
共扩增出 8个条带而且条带较清晰、重复性也好, 为
最佳的处理组合。
2. 2 ISSR-PCR细调正交试验结果及其分析
细调正交试验结果的正交直观分析见表 5,在 9
个处理组合中 7号处理组合的相对浓度和最大, 说
明该组合的扩增效率最高。综合图 2 观察结果, 7
号是 9个处理组合中最佳处理组合。R值的大小反
映该因素对结果的影响程度, 正交直观统计分析表
明, dNT P 浓度对马蔺 ISSR- PCR扩增结果的影响
最大,其次分别为 Mg2+ 浓度、Primers 浓度、Taq酶
浓度。利用 T 值可以确定每一个因素各水平的最
佳浓度, 每个因素中最大的 X值所对应的水平即为
该因素的最佳浓度,由此可得最佳理论处理组合为:
dNTP 0. 3 mmol/ L、T aq 酶 1. 5 U、Pr imer s 0. 4
mo l/ L、Mg2+ 2. 5 mmol/ L。
为了验证这一推论, 将其与 7号及 4号处理组
合进行比较,所用的 DNA 模板为其它马蔺群落的 7
份 DNA。结果见图 3,这 3个扩增体系条带基本一
样,但最佳理论组合扩增出的有些条带明显较亮,且
扩增条带数较多, 所以选用最佳理论组合为正式试
验的 ISSR-PCR反应体系。
表 5 ISSR-PCR细调正交试验结果直观分析表
T able 5 Visual analysis of ISSR-PCR of fine-adjusted or thogona l design
处理组合
T reatmen ts
dNTP 浓度
dNTP
T aq酶浓度
T aqDNA polymerase
引物浓度
Primers
Mg2+ 浓度
Mg2+
相对浓度和
Total con cent rat ion
1 1 1 1 1 272. 25
2 1 2 2 2 308. 88
3 1 3 3 3 240. 24
4 2 1 2 3 357. 39
5 2 2 3 1 472. 23
6 2 3 1 2 480. 15
7 3 1 3 2 648. 45
8 3 2 1 3 487. 08
9 3 3 2 1 584. 43
T1 821. 37 1278. 09 1239. 48 1328. 91
T2 1309. 77 1268. 19 1250. 7 1437. 48
T3 1719. 96 1304. 82 1360. 92 1084. 71
X1 273. 79 426. 03 413. 16 442. 97
X2 436. 59 422. 73 416. 9 479. 16
X3 573. 32 434. 94 453. 64 361. 57
R 299. 53 12. 21 40. 48 117. 59
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草 地 学 报 第 16卷
图 3 三种反应体系结果的比较
F ig . 3 Compar ison of thr ee reaction systems
M:分子量标准 DL2000; 1-7: 7种不同的 DN A模板
M : DL2000 marker; 1-7: show n different template DNA
2. 3 最佳退火温度的筛选
退火温度梯度 PCR 试验结果见图 4。当退火
温度较低时, ISSR- PCR扩增效果条带多而模糊, 背
景也较深,主要原因是退火温度过低引起扩增的特异
性较差。当退火温度较高时扩增的条带较少,而且也
较弱,甚至当 59. 8 时没有条带扩出,主要是由于温
度过高使得引物与模板结合差, PCR产物丰度低。当
退火温度为 51. 9~ 53. 7 时,扩增条带较亮,且清晰,
所以确定这条引物的最佳退火温度为 52 。
图 4 不同退火温度对扩增的影响
F ig. 4 Effect of annea ling temperatur e on
amplificat ion pattern
M:分子量标准 DL2000 ;从 1到 8依次为 46. 1 、48. 6 、
50. 1 、51. 9 、53. 7 、55. 7 、57. 7 、59. 8
M: DL2000 marker; 1 to 8 rep resents the annealing
temperature applied at 46. 1 , 48. 6 , 50. 1 ,
51. 9 , 53. 7 , 55. 7 , 57. 7 , and 59. 8 , respect ively
3 讨论与结论
ISSR分子标记是基于 PCR反应的一种标记技
术,虽然较 RAPD 等标记稳定, 但同样受到反应条
件和扩增程序及物种的影响, 如 DNA 模板的浓度
和纯度、引物和 dNT P、T aq 酶的用量和商品型号、
Mg 2+ 浓度、反应时间和 pH 值大小等,因此在利用
ISSR分子标记时首先应对其反应体系进行优化, 以
保证分析结果的可靠性[ 17]。已报道过的关于 PCR
反应体系的优化大多采用单因素试验设计,分别对
每个因素的最佳水平进行摸索 [ 15] , 需要进行多次梯
度试验,过程繁琐且无法兼顾到各因素间的交互作
用。而正交试验的特点是用部分试验来代替全部试
验,并通过部分试验即可找到最优的组合设计(包括
处理中没有的水平组合) [ 12, 13] , 其关键是合理地设
计各个因素的水平组合。
为了建立适合马蔺的 ISSR-PCR 最佳反应体
系,提高 ISSR产物的产量和特异性,本研究根据正
交试验设计原理, 设计了探索正交试验和细调正交
试验来确定马蔺 ISSR-PCR反应体系中各成分的浓
度,从 dNT P、T aq 酶、引物浓度、Mg 2+ 4 种因素对
马蔺 ISSR反应体系进行了优化, 得到适合马蔺的
ISSR-PCR最佳反应体系, 即 25 l的反应体系中含
有 dNTP 0. 3 mmol/ L、T aq酶 1. 5 U、引物浓度 0. 4
mo l/ L、Mg2+ 2. 5 mmo l/ L 以及 1 buf fer 和 50
ng 模板 DNA。
由于影响 ISSR 分析中的 PCR 扩增的因素比
较复杂,尤其是 PCR扩增中的退火温度。较低的退
火温度允许适当错配, 扩大了引物在基因组中配对
的随机性,而较高的退火温度虽可提高配对的专一
性,却会影响引物与模板的结合程度。席嘉宾等在
地毯草及曾兵等在鸭茅 ISSR反应体系建立时也指
出,引物的退火温度对 ISSR 扩增影响很大, 确定最
佳退火温度可适当参考其熔点[ 18, 19] 。本试验通过
利用梯度 PCR仪对所用引物进行最佳退火温度的
筛选, 共设 8 个退火温度梯度: 46. 1 、48. 6 、
50. 1 、51. 9 、53. 7 、55. 7 、57. 7 、59. 8 ,最
终确定了 834号引物的最佳退火温度为 52 。
总之, 不同物种 ISSR-PCR反应体系的建立既
要保证扩增产物足量, 条带清晰, 重复性好,又要兼
顾节约成本和尽量缩短试验周期的原则。
(下转 589页)
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(责任编辑 李 扬 梁艳萍)
(上接 584页)
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(责任编辑 梁艳萍 李 平)
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