全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(3)：251～254
Journal of Wuhan Botanical Research
RAPD技术在药用植物绞股蓝鉴别中的初步研究
李雄英，罗育，吴耀生 ，蒋军富，赵瑞强，蓝秀万
(广西医科大学生物化学与分子生物学教研室，南宁 530021)
摘 要：运用RAPD技术对绞股蓝(GynostemmapentaphyIum)及其伪品进行 DNA指纹图谱的鉴别研究。采用改进
的CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓(Cayratiajaponica)3种植物的总DNA，主要以七叶绞股蓝DNA为
模板 ，采用随机引物 WGS001进行 PCR扩增，对反应体系包括模板、Mg2 、Taq酶、牛血清白蛋 白(BSA)、退火温度
进行优化。优化的反应体系总体积 25 ，含 MgC1 2 mmol／L、dNTP 0．2 mmo~L、引物 0．4 mo1／L、模板 60 ng、
g酶 1 U、BSA 2 g／IxL，退火温度 58~C。用 10条含20个碱基的随机引物对以上 3种植物总 DNA作 PCR扩增，
进行引物筛选。筛选得到的两条随机引物(WGS001、WGS004)可扩增得到识别这些物种基因组 DNA的多态性片
段。这些片段可以有效地鉴别绞股蓝和乌蔹莓。
关键词 ：绞股蓝；基因组 DNA；RAPD；鉴别
中图分类号 ：Q75；$567．23 7 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2008)03—0251—04
Initial Research on Authenticati0n of M edicinal Plant
Gynostemma pentaphyHum by RAPD M ethod
LI Xiong—Ying，LUO Yu，WU Yao—Sheng ，JIANG Jun—Fu，ZHAO Rui—Qiang，IJAN Xiu—Wan
(Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)
Abstract：The random amplifed polymorphic DNA (RAPD) analysis was applied to identify the
resources of medicinal plant Gynostemma pentaph? llum and its spurious breed with DNA fingerprints．The
modified CTAB method was used to extract the genomic DNA of several plants，including seven leaves
Jiaogulan，five leaves Jiaogulan，Cayratia japonica．With the DNA extracted from seven leaves Jiaogulan as
template，the random primer WGS00 1 for PCR has been done meanwhile RAPD reaction system has been
optimized SO that it could be determined for the suitable annealing temperature and concentrations of tem—
plate，Mg“
，primer，Taq DNA polymerase，BSA．In the optimized system of 25 txL，MgC12 2 mmol／L，
primer 0．4 txmol／L，template 60 ng，Taq DNA polymerase 1 U，BSA 2 txL and annealing temperature
5 8~C were used．Based on the optimized system
，
ten primers of 20 bp were applied to do random amplif—
cation with total DNAs of the above mentioned three plants，respectively．The polymorphic fragments of
DNA fingerprints of the above mentioned three plants were obtained with two screened random primers
(WGS00 1，WGS004)．These polymorphic fragments can be used to distinguish G．pentaphy lum with C．
japonica obviously．
Key words：Gynostemma pentaphyllum；Genomic DNA；RAPD；Authentication
绞股蓝 [Gynostemma pentaphyllum (Thunb．)
Makino]为葫芦科绞股蓝属植物。 自20世纪 70
年代以来 ，从该种植物 中分离出了 84种绞股蓝
皂苷 ，其中 6种与人参皂苷的结构完全相同，具
有降血脂 、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功效 ，由此
引发了对绞股蓝植物的科研和开发热潮H]。药
材市场上常见的伪品有乌蔹莓[Cayratia japonica
(Thunb．)Gagnep]。由于绞股蓝为草类药材 ，其
特点是质地松脆 ，在采收加工、干燥、运输及储藏
的过程中易干瘪皱缩、破裂，给鉴别带来困难 ]。
本实 验 应 用 RAPD(随 机 扩 增 多 态 性 DNA，
random amplifed polymorphic DNA)技术对绞股蓝
及其伪品乌蔹莓进行了分子水平的鉴定 ，为绞股
蓝的准确鉴定提供了理论依据。
收稿日期：2007—11—13，修回日期：2008—03—18。
基金项目：广西科学基金(桂科基 0575065，桂科基0731065)；广西区教育厅硕士研究生科研创新项 目(2006105981001M02)；广西大型
仪器协作共用网大型仪器测试补助(484-20074)63)。
作者简介：李雄英(1982一)，女，在读硕士，从事中药基因克隆研究(E mail：fanqielushui@126．con)。
通讯作者(Author for corespondence．E—mail：wuyaoshengo3@sina．con)。
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252 武 汉 植 物 学 研 究 第26卷
1 材料和方法
1．1 材料
绞股 蓝 [Gynostemma pentaphylum (Thunb．)
Makino]和 乌 蔹 莓 [Cayratia japonica (Thunb．)
Gagnep]由广西药用植物园凌征柱研究员提供并鉴
定。本研究以鸟趾状复叶的小叶数为主要依据划分
绞股蓝种内的不同类型，小叶数为 5片的绞股蓝称
为五叶绞股蓝，小叶数为 7片的绞股蓝称为七叶绞
股蓝。每种植物均取其幼嫩叶片作为提取基因组
DNA的材料，于 一20℃保存。
1．2 方法
1．2．1 七叶绞股蓝、五叶绞股蓝总 DNA提取 参
照陈莉等 的CTAB法稍加修改。称取 0．5 g叶片
置于预冷的研钵中，加入液氮研磨成细粉，迅速转移
至7 mL离心管中，加入 3 mL预热的 1．5 XCTAB提
取缓冲液(1．5 g／100 mL CTAB，75 mmol／L Tris—HC1
pH 8．0，15 mmol／L EDTA pH 8．0，1．05 mol／L
NaC1)，混匀，65 c【=水浴中保温20 rain。冷却至室温，
6200 r／rain离心 10 rain。取上清，分别用下列试剂
进行抽提：等体积的氯仿／异戊醇(24／1)；1／10体积
的 1 X CTAB提取缓 冲液 (1 g／100 mL CTAB，
0．7 mol／L NaC1)和等体积的氯仿／异戊醇(24／1)。
上 清 加 入 等 体 积 的 1 X CTAB 沉 淀 缓 冲 液
(1 g／100 mL CTAB，50 mmol／L Tris—HC1 pH 8．0，
10 mmol／L EDTA pH 8．0)，轻缓颠倒至形成絮状沉
淀。若 无明显沉 淀析 出，则于 65~C水浴 中保温
30 rain，同上离心。沉淀用 0．5 mL NaC1(1 mol／L)
溶解，离心除去不溶物。DNA溶液中加入 2．5倍体
积的预冷无水乙醇，于 一20~C冰箱中静置 15 rain，
5200 r／rain离心 5 rain。沉淀用 1 mL 70％乙醇洗涤
两次，于通风厨中自然挥干后用 200～300 L灭菌
三蒸水充分溶解后作为 DNA样品贮备液，一20℃保
存备用。
1．2．2 乌蔹莓的总 DNA提取 在以上提取方法
的基础上再加以改进。样品中加入 10％ PVP粉末
(W／W)在液氮中共同研磨；磨碎后的粉末加入6 mL
冰预冷的不含 CTAB的清洗缓冲液(0．2 mol／L Tris—
HC1 pH 8．0．50 retooL／L EDTA pH 8．0
． 0．25 Inol／L
NaC1)，充分混匀，于0 冰浴中静置 10 rain，6200 r／
rain离心 10 rain，弃掉上层液体，此步骤重复 l～
2次；加入 3 mL预热的 1．5 X CTAB提取缓冲液，
0．1 g活性炭和30 L p一巯基乙醇(终浓度为2％)，
混匀，65℃ 水 浴 中保 温 20 min。其 它 步 骤 同
1．2．1项。
1．2．3 DNA电泳检测及鉴定 DNA采用 1．5％琼
脂糖凝胶电泳，用 UVI-7600Z凝胶成像系统观察并
拍照。用 Smartspee ”plus核酸蛋 白测定仪 (Bio—
RAD Lab，Inc，USA．)测定 A：6o和A 0，计算其纯度
和浓度。
1．2．4 PCR扩增及其条件探索 参照常规的PCR
反应(引物为 Sangon产品，其它为Takara产品)，将
本研究的RAPD初始反应体系确定为：反应总体积
25 IxL，MgC1，2 retooL／L，dNTP 0．2 mm0l／L，引物
0．4 p~mol／L，模板 120 ng，Taq酶 1 U。在整个实验
过程中，保持前后各次反应的各组分如 10 X bufer、
Mg 、dNTP、Taq酶、引物及琼脂糖等的来源和浓度
一 致，在同一型号的 PCR仪上扩增，在同一型号的
电泳仪上电泳，电泳液为同一次配制和稀释。在排
除系统带来的误差后，根据预实验的结果，主要以七
叶绞股蓝 DNA为模板，WGS001引物对 RAPD反应
体系中3种主要成分 (模板、Mg 、Taq酶)分别进
行单 因素实验。在 MyCyelerTM PCR仪 (Bio—RAD
Lab，Inc，USA．)上扩增。反应程序：预变性 94℃
3 rain，然后 94c【=30 S，58c【=30 S，72c【=1 rain 20 S，40
个循环，72~C延伸 10 rain。确定 3种主要成分的用
量后，设计不同的退火温度：60、59、58、56、51、50c【=，
选择最佳温度。
1．2．5 BSA用量摸索和引物筛选 根据 BSA在植
物 RAPD反应 中可以有效改善扩增效果的研究报
道 ，在模板、Mg 、Taq酶、退火温度优化结果的
基础上，往体系中加入不同量 BSA，探索不同 BSA
浓度对 PCR扩增改善情况。同时，对 10条含 20 bp
的随机引物(编号为WGS001～WGS010)进行筛选，
选择多态性高、重复性好的引物。各考察因素水平
设计见表 1。取扩增产物 5 ，进行 1．5％琼脂糖
凝胶电泳鉴定。
表 1 因素水平
Table 1 Factors and levels
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武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
能是作用于多酚体系，植物DNA中常含有内源的多
酚类化合物，可与蛋白质结合，使酶失活。而 BSA
可以通过其结构上富含赖氨酸的阳离子与多酚化合
物的阴离子相互作用，或通过疏水相互作用消除内
源性多酚类化合物，即阻止它们与Taq酶结合，从而
提高酶的活性，最终对 PCR反应起到改善作用 。
2．4 绞股蓝与乌蔹莓的区别
本实验在添加合适浓度 BSA的情况下，从 10
条引 物 中筛 选 得 到 两 条 引 物 即 WGSO01和
WGSO04，均能扩增得到清晰的、重复性好的条带，能
区别绞股蓝及其伪品乌蔹莓。其中，WGSO01引物
扩增绞股蓝时得到约6～7条特征带，对乌蔹莓扩增
得到 5～6条带，但条带位置与绞股蓝明显不同。
WGSO04对绞股蓝、乌蔹莓的扩增带也有明显差别。
上述扩增结果有良好的重复性(见图3：a，b)。将绞
股蓝的主要特征亮带进行克隆测序，其序列特征与
乌蔹莓不一样(另文待发表)。
3 讨论
目前，关于绞股蓝 DNA分子标记的报道仅见于
庞敏等 对不 同类型绞股蓝的 RAPD图谱研究。
但是对于绞股蓝及其伪品乌蔹莓的 DNA分子水平
鉴别研究还没有报道。绞股蓝和乌蔹莓不管是植物
外部形态还是干药材都十分相似，给绞股蓝的开发
利用和临床上的安全用药带来困难。本研究经优化
的RAPD条件可明确区别绞股蓝及乌蔹莓，所扩增
得到的PCR产物片段数及长度均有明显区别，可用
于绞股蓝不同伪品的分子鉴定，相应的研究正在进
行之中。
在对绞股蓝遗传背景不清楚 的情况下，应用
RAPD技术对绞股蓝及其伪品进行分子水平的鉴
定，可解决传统的生药鉴定如性状、显微、理化鉴定
等易受外界因素和生物个体发育阶段及器官组织差
异影响的问题，为绞股蓝的分子鉴定提供理论依据。
本实验用于鉴别的植物材料是新鲜叶片，而药
材市场上绞股蓝为干燥药材，经过烘烤干燥等处理
过程，DNA会降解，植物细胞内的杂质也发生变化，
这些改变是否会对绞股蓝 干品的 DNA提取和
RAPD反应产生影响，有待进一步研究。
致谢：广西药用植物园凌征柱研究员为本研究提供了植
物材料并进行了鉴定，特此致谢!
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