全 文 ：武汉植物学研究 2010, 28(6): 654~659
Journal of Wuhan Botanical Research


收稿日期: 2010-03-05, 修回日期: 2010-05-08。
基金项目: 中南民族大学自然科学基金项目(YZY10007)。
作者简介: 吴绮(1985−), 女, 硕士研究生, 研究方向: 细胞遗传学(E-mail: kiki_wq1985@hotmai.com)。
∗通讯作者: (Author for correspondence. E-mail: liuhong2007@yahoo.cn)。
DOI: 10.3724/SP.J.1142.2010.60654
利用栽培稻 C0t-1 DNA和基因组 DNA比较
分析宽叶野生稻基因组
吴 绮, 覃 瑞, 李 刚, 刘 虹∗
(中南民族大学生命科学学院, 南方少数民族地区生物资源保护与综合利用联合工程中心, 武汉 430074)
摘 要: 利用 AA染色体组栽培稻的中高度重复序列 C0t-1 DNA和基因组 DNA作为探针, 通过荧光原位杂交
技术对宽叶野生稻(Oryza latifolia)(CCDD染色体组)进行了比较基因组分析。结果显示, 在宽叶野生稻染色体
上, C0t-1 DNA的杂交信号没有基因组 DNA的杂交信号明显; 杂交信号主要分布在着丝粒、近着丝粒及端粒
区域; 随着洗脱严谨度的不同, 杂交信号呈现出较高的种特异性。本研究以不同洗脱严谨度下的荧光原位杂
交结果为依据, 对宽叶野生稻进行的核型分析, 可进一步提高稻属染色体识别的准确性。
关键词: C0t-1 DNA; 基因组 DNA; 荧光原位杂交; 洗脱严谨度; 宽叶野生稻
中图分类号: Q943; Q343.2 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X(2010)06-0654-06

Comparative Analysis of Oryza latifolia Genome with
C0t-1 DNA and Genomic DNA of Oryza sativa
WU Qi, QIN Rui, LI Gang, LIU Hong∗
(Engineering Research Centre for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern China,
College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)
Abstract: C0t-1 DNA and genomic DNA (gDNA) of cultivated rice Oryza sativa were used as
probes to analyze comparatively the Oryza latifolia genome by fluorescence in situ hybridization
(FISH). Results showed that the hybridization signals of gDNA were more distinct on the
chromosomes of O. latifolia than that of C0t-1 DNA. These hybridization signals were mostly
distributed on centromeres and telomeres regions as well as those near centromeres under
different stringencies. With increasing washing stringency, hybridization signals showed rela-
tively higher species’ specificity. Karyotype analysis of O. latifolia was carried out according to
fluorescence in situ hybridization results in different washing stringencies. This study can help
improve correct identification of Oryza chromosomes.
Key words: C0t-1 DNA; Genomic DNA; FISH; Stringency; Oryza latifolia
稻属(Oryza)由 2种栽培稻和 20多种野生稻
组成[1], 染色体组迄今发现有 10种: AA、BB、EE、
FF、GG、BBCC、CC、CCDD、HHJJ和 HHKK[2,3]。
原产拉丁美洲的宽叶野生稻(Oryza latifolia), 其基
因组为 CCDD, 是药用野生稻(Oryza officinalis)
复合体中的四倍体。已有研究表明, 多倍体能够揭
示一些物种在基因组水平的变化, 且绝大多数的
多倍体基因组含有能反映祖先基因信息的染色体
片段[4], 因此通过对稻属中 A、C两个基本基因组
的研究, 能够进一步探讨栽培稻和宽叶野生稻在
进化中的关系, 推测稻属多倍体早期基因组结构
的变化。
DNA 重复序列分布于整个基因组中, 是真核
生物基因组的重要特征和重要组成部分[5]。植物基

第 6期 吴 绮等: 利用栽培稻 C0t-1 DNA和基因组 DNA比较分析宽叶野生稻基因组 655


因组中, C0t-1 DNA 作为中高度重复序列, 是基因
组中受到的选择压力最小, 变异速度最快的序列
之一[6]。以 C0t-1 DNA作为分析基因组的探针, 包
含了整个基因组的中高度重复序列, 在近缘属以
及属内种间基因组分析中具有很强的优势[7]。本研
究选用栽培稻“广陆矮 4号”的中高度重复序列, 即
C0t-1 DNA作为探针, 对宽叶野生稻进行荧光原位
杂交分析, 并通过调整杂交后的洗脱严谨度, 提高
稻属近缘基因组间的分辨力, 从而确定栽培稻重
复序列在宽叶野生稻基因组中的分布情况。与此
同时, 利用该栽培稻基因组总 DNA(gDNA)作为探
针, 对宽叶野生稻进行基因组原位杂交(genomic
in situ hybridization, GISH)作为对照, 研究栽培稻
的基因组结构和宽叶野生稻基因组分布的特点 ,
进一步探讨栽培稻与宽叶野生稻在进化中的关系,
从而为稻属有利基因的分离和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料和染色体制片
供试材料栽培稻广陆矮 4号(Oryza sativa L.),
由湖北省农业科学院曾左葵研究员提供。宽叶野
生稻(Oryza latifolia)IRW6, 由华南农业大学卢永
根院士提供。染色体制片参照 Yan[8]的方法。
1.2 C0t-1 DNA的制备
CTAB法提取栽培稻“广陆矮 4号”总 DNA, 参
照 Doyle 等 [9]的方法稍作修改。C0t-1 DNA 制备
参照 Zwick 等 [6]的方法并稍作修改 , gDNA 于
0.14 Mpa高压灭菌 3~5 min, 使栽培 gDNA 打断
成 800~1500 bp的长度, 根据 C0t-1 DNA 动力学
公式 C0t-1 = mol/L ×Ts, 计算 C0t-1 DNA 完全复性
所需的时间。C0t-1 DNA 完全复性后, S1 核酸酶
(2 U/μg DNA, Promega)37°C酶解 1h, 抽提, 纯化
后得到所需 C0t-1 DNA。
1.3 探针标记
C0t-1 DNA和 gDNA采用 Nick Translation
Kit(Roche)标记。20 μL反应体系中含有 dATP、
dCTP、dGTP、dTTP、biotin-11-dUTP、DNaseI、
DNA 聚合酶 I、0.2~0.5 μg C0t-1 DNA 或 gDNA,
15°C 下标记 1.5~3 h 后加 1 μL 0.5 mol/L
EDTA(pH 8.0)终止反应, 抗生素蛋白的碱性磷酸
酶(AP, alkaline phosphatase conjugate, Roche)
的点印记法检测标记效果。
1.4 原位杂交及检测
荧光原位杂交方法参阅 Jiang等[10]和Wei 等[11]
程序稍加修改。染色体制片于 60°C烤片 1 h后, 先
后经 RNase A/2×SSC(10 μg/mL)37°C、胃蛋白酶
(Genview)/10 mmol/L、HCl(5 μg/mL)、70%甲酰
胺 70°C变性处理, 用−20°C条件下储存的 70%、
95%和 100%乙醇洗脱, 室温晾干。每张片子杂交
液含有 80 ng标记的探针 DNA, 50%去离子甲酰
胺 (Sigma), 8%硫酸葡聚糖 (Amresco), 2×SSC,
0.5% SDS, 0.5 μg 鲑鱼精 DNA(DNA Salmon,
Sigma), 37°C杂交过夜。杂交信号的荧光检测：
根据不同洗脱严谨度, 42°C下用 20%~40%的甲
酰胺, 2×SSC, 0.2×SSC 各洗脱 10 min, 室温下用
0.1% TritonX -100(Sigma)处理 10 min, 室温下
1×PBS 洗脱 10 min。依次加入 streptavidin-Cy3
(Rockland), Biotinylated, Streptavidin(Vector),
streptavidin-Cy3 (Rockland), 37°C温育 1 h, 1×
PBS 室温洗涤 3 次 , 每次 5 min。 10 μg/mL
DAPI(Sigma)复染, Olympus BX61 荧光显微镜观
察, 用 Case Data Manager Expo 2.1.1 图像系统
控制的 Cool-1300QS CCD(VDS, Germany)照相
系统摄取图片。SPOT advanced软件测量染色体
长度, FISH View EXPO 2.0 进行软件图片处理和
核型分析。
2 结果与分析
2.1 C0t-1 DNA的原位杂交与核型分析
用栽培稻 C0t-1 DNA作为探针, 对宽叶野生稻
进行荧光原位杂交, 其结果如图 1中 A—B、D— E、
G— H 所示, 图 1：A— B、D— E、G— H分别为洗
脱严谨度为 60%、70%、80%时 , 栽培稻 C0t-1
DNA作为探针, 对宽叶野生稻进行荧光原位杂交的
图像。根据图示中红色荧光信号来看, 当洗脱严谨度
60%和 70%时, 几乎所有的染色体上均有信号分布,
某些染色体上信号分布较多, 另一些染色体上信号
分布较少。随着洗脱严谨度的调整, 信号分布也逐
渐呈现特异性, 主要集中在染色体的着丝粒、近着
丝粒和端粒区。当洗脱严谨度达到 80%时, 明显有
数条染色体上不再有信号分布。

656 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷



A—B, D—E, G—H. 洗脱严谨度分别为 60%、70%、80%时, 栽培稻 C0t-1 DNA对宽叶野生稻的 FISH 图; C, F, I. 洗脱严
谨度分别为 60%、70%、80%时, 栽培稻 gDNA对宽叶野生稻的 GISH 图; J. 洗脱严谨度为 70%时, 基于 FISH 图像 E的
分裂中期的宽叶野生稻核型图
A—B, D—E, G—H. With washing stringency was 60%、70%、80%, FISH images of rice C0t-1 DNA as probe to O. latifolia;
C, F, I. With washing stringency was 60%、70%、80%, GISH images of rice gDNA as probe to O. latifolia; J. With washing
stringency was 70%, karyotype of O. latifolia according to its FISH images E
图 1 栽培稻 C0t-1 DNA和基因组 DNA对宽叶野生稻基因组的 FISH图
Fig. 1 C0t-1 DNA and gDNA of O. sativa to O. latifolia
以严谨度为 70%时, 所得的 FISH图像(图 1：E)
为依据, 使用 FISH View EXPO 2.0软件对宽叶野
生稻的染色体从长到短进行配对排序的核型图见
图 1：J。从图 1：J来看, 重复序列在染色体上的

第 6期 吴 绮等: 利用栽培稻 C0t-1 DNA和基因组 DNA比较分析宽叶野生稻基因组 657


分布有特异性, 并且具有一定的带型, 具有相同带
型的应该是同源染色体, 其中, 第 1、2、3、7、9、
15和 16号染色体上的信号最强。核型分析结果
见表 1。
表 1 基于 FISH图像对宽叶野生稻的核型分析
Table 1 Karyotype analysis of Oryza latifolia
based on FISH images
序号
No.
相对长度
RL±SD
臂比
AR±SD
着丝粒位置
PC
1 6.67±0.27 1.22±0.14 m
2 6.19±0.32 1.33±0.19 m
3 5.70±0.25 1.27±0.17 m
4 5.36±0.24 1.33±0.06 m
5 5.07±0.32 1.36±0.24 m
6 4.82±0.21 1.54±0.37 m
7 4.57±0.19 1.60±0.34 m
8 4.53±0.19 1.24±0.24 m
9 4.43±0.13 2.07±0.50 sm
10 4.30±0.24 1.32±0.27 m
11 4.22±0.24 1.56±0.42 m
12 4.10±0.18 1.22±0.09 m
13 3.82±0.29 1.07±0.05 m
14 3.78±0.31 1.86±0.60 sm
15 3.66±0.22 1.69±0.50 m
16 3.62±0.18 1.28±0.19 m
17 3.49±0.20 1.80±0.44 sm
18 3.47±0.21 1.34±0.49 m
19 3.44±0.19 1.99±0.15 sm
20 3.37±0.17 1.27±0.19 m
21 3.27±0.17 1.40±0.14 m
22 3.13±0.07 2.21±0.13 sm
23 2.70±0.22 1.30±0.24 m
24 2.39±0.21 1.11±0.03 m
RL: Relative length; AR: Arm ratio; PC: Position of centromere;
SD: Standard deviation.
2.2 基因组 DNA(gDNA)的原位杂交分析
用栽培稻基因组 DNA为探针, 对宽叶野生稻
进行基因组原位杂交(GISH), 结果见图 1中 C、F、
I。图 1：C 是洗脱严谨度为 60%时的 GISH图, 图
1：F 和图 1：I 分别是严谨度为 70%和 80%时的
GISH图像。从图像可以看出, 随着严谨度的增加,
红色荧光信号在宽叶染色体上的分布逐渐减少 ,
当严谨度达到 80%时, 仅很少一部分的染色体上
还有信号分布, 大多数染色体上的信号微弱不可
见。与 C0t-1 DNA作为探针进行杂交的 FISH图
像相比, 在相同严谨度下, gDNA 作为探针进行杂
交所得的GISH图像, 信号在宽叶染色体上的分布
更多、更明显; 随着严谨度的调整, 分布信号的变
化也更明显。
3 讨论
在植物基因组中, 重复序列多在 50%以上, 占
据基因组的大部分[12]。过去, 对植物基因组的研究
多集中在特异重复序列和转座子等低拷贝重复序
列以及简单重复序列[13−15]。对中度重复序列和高
度重复序列的分析多集中于人和动物, 植物中仅
有 Zwick等[6]和蓝伟侦等[16]的报道。已有研究表明,
水稻中高度重复序列在药用野生稻基因组中也同
样存在[17], 而且有分子证据表明, 宽叶野生稻是通
过单次杂交起源的[3,18,19], CC基因组是宽叶野生稻
的母本 [20], 因此可以推测水稻的中高度重复序列
在宽叶野生稻基因组中也应该存在。所以, 本研究
选用栽培稻 C0t-1 DNA 作为探针, 对宽叶野生稻
进行荧光原位杂交分析。从图 1中 A—B、D— E、
G— H的结果来看, 栽培稻中度和高度重复序列在
宽叶野生稻中大量存在, 说明 AA基因组与宽叶野
生稻的 CCDD基因组在 DNA组成上具有很高的
保守性, 这与用 gDNA 作为探针的分析结果相印
证, 并且与 Huang等通过构建异源四倍体宽叶野
生稻和栽培稻的比较图所得出的结论是一致的[21]。
本实验室蓝伟侦曾经用水稻 C0t-1 DNA作为探针,
对药用野生稻进行杂交, 结果显示杂交信号的覆
盖率仅为 38.61%[16], 在药用野生稻第 1、2、4和
6号染色体上, 重复序列信号主要分布在端粒、着
丝粒和近着丝粒区。在第 3 和 7号 染色体上, 重
复序列信号主要集中在染色体短臂的端粒区。第
10 和 11 号染色体重复序列信号主要分布在着丝
粒区, 而第 9 号染色体重复序列主要在长短臂的
端部。其余第 5、8 和 12号染色体上的信号分布
较少, 并且分布相对较分散。本实验用相同探针,
在相同实验条件下, 对宽叶野生稻进行的荧光原
位杂交分析来看, 信号覆盖率明显高于 38.61%,
约为 43.37%。且第 3、7、17和 18号染色体上, 重
复序列信号主要分布在端粒、着丝粒和近着丝粒
区。在第 12和 20 号染色体上, 重复序列信号主要

658 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


分布在着丝粒区。在第 22号染色体上, 信号主要
分布在短臂的端部。其余染色体上的信号分布比
较分散, 约 10对左右的染色体上没有信号。药用
野生稻和宽叶野生稻杂交信号的差异, 再次证明
了C0t-1 DNA作为探针, 用于荧光原位杂交带型具
有特异性, 并且说明 AA基因组不仅与宽叶野生稻
基因组中的 C基因组有同源性, 与 D基因组也存
在同源性。长期以来, 由于自然界中没有发现 DD
二倍体野生稻, 因此对 CCDD中 DD基因组的组
成有诸多猜测, 利用中高度重复序列作为探针分
析 CCDD的基因组, 对于 DD基因组的起源有一
定的启示。
对栽培稻和野生稻比较基因组的研究可以阐
明栽培稻和野生稻的进化关系, 为稻属有利基因
的利用提供有用的信息。而准确的核型分析, 能够
提高稻属染色体识别的准确性, 是栽培稻和野生
稻比较基因组研究的基础和依据。在传统的染色
体核型分析方法中, 由于稻属染色体小, 形态相似,
着丝粒不明显, 易发生折叠和扭曲, 给分析带来了
困难和偏差。本研究在传统的从长到短的核型分
析基础上, 依据相对长度结合信号的分布情况来
进行同源染色体的配对, 有相似信号分布的染色
体, 被认为是同源染色体。并且随着洗脱严谨度的
调整, 非特异性的杂交信号不断减少, 核型分析的
结果也更加准确。这种基于基因组组成进行的核
型分析, 能够弥补传统核型分析的不足, 能够更加
快速、准确地进行同源染色体的配对, 核型结果也
更为准确可靠。
杂交严谨度及杂交后洗脱严谨度的调整, 能
够提高植物中基因组间关系的分辨力, 使GISH技
术逐渐成为在染色体和 DNA 水平上研究近缘物
种不同基因组间关系和组成的有力工具。从图 1
中 C、F和 I的结果来看, 随着洗脱严谨度的提高,
信号分布明显变弱, 表明非特异性的杂交信号逐
渐减少甚至被除去。但是从图 1中 A—B、D—E、
G—H的结果来看, 部分中高度重复序列在异源多
倍体基因组中的分布不大稳定, 呈现细微的变化,
经过反复大量的 FISH实验, 也证实了这一结果。
董正伟的研究表明 , 宽叶野生稻染色体的 45S
rDNA位点具有多态性, 大约有 10~14个位点, 由
于 C0t-1 DNA包含了整个基因组的中高度重复序
列, 这可能是导致用 C0t-1 DNA做探针, 有个别杂
交信号分布不大稳定的原因之一。
参考文献：
[ 1 ] Lu B R. Taxonomy of the genus Oryza (Poaceae) : a
historical perspective and current status [J]. Intern
Rice Resour Notes, 1999, 24: 428.
[ 2 ] Aggarwal R K, Brar D S, Khush G S. Two new genomes
in the Oryza complex identified on the basic of mo-
lecular divergence analysis using total genomic DNA
hybridization [J]. Mol Gen Genet, 1997, 254:1212.
[ 3 ] Ge S, Sang T, Lu B R, et al. Phylogeny of rice genomes
with emphasis on origins of allotet-raploid species[J].
Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 14400−14405.
[ 4 ] Keith L A, Jonathan F W. Polyploidy and genome
evolution in plants [J]. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8:
135−141.
[ 5 ] Rokka V M, Clark M S, Knudson D L, et al. Cytological
and molecular characterization of repetitive DNA
sequences of Solanum brevidens and Solanum tu-
berosum [J]. Genome, 1998, 41: 487−494.
[ 6 ] Zwick M S, Hanson R E, Mcknight T D, et al. A rapid
procedure for the isolation of C0t-1 DNA from plants [J].
Genome, 1997, 40: 138−142.
[ 7 ] Liu H, Chen Y, Li G, Liu X Q, Qin R. Analyses of
karyotypes and comparative physical locations of the
resistance gene, Xa-5, between Oryza sativa and
Oryza officinalis [J]. Afr. J Biotechnol, 2009, 8(21):
5673−5678.
[ 8 ] Yan H M, Song Y C, Li L J, et al. Physical location of
rice Pi-5(t), Glh and RTSV genes by FISH of BAC
clones [J]. Wuhan University Journal of Natural
Science, 1998, 3 (2): 226−230.
[ 9 ] Doyle J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh
tissue[J]. Focus, 1990, 12: 13−15.
[10] Jiang J M, Gill B S, Wang G L, Ronald P C, Ward D C.
Metaphase and interphase fluorescence in situ hy-
bridization mapping of the rice genome with bacterial
artificial chromosome [J]. PNAS, USA, 1995, 92:
4487−4491.
[11] Wei W H, Qin R, Song Y C, Guo L Q, Gu M G. Com-
parative analyses to diseases resistant and nonre-
sistant lines from maize×Zea diploperennis by GISH [J].
BBAS, 2001, 42: 109−114.
[12] Bennett M D, Leitch I J. Plant genome size research: a

第 6期 吴 绮等: 利用栽培稻 C0t-1 DNA和基因组 DNA比较分析宽叶野生稻基因组 659


field in focus [J]. Ann Bot, 2005, 95: 1−6.
[13] Wang J F(王金发), Li Y K(李一琨 ), He H Q(何海琼),
Chen J J(陈中健) , Liu L S(刘良式). Promoter function of
a rice repetitive DNA sequence RRD3 in transgenic
plants [J]. Acta Bot Sin (植物学报 ), 2000, 42(10):
1057−1061. (in Chinese with English abstract)
[14] Quiroz H C. Plant genomics: an overview[J]. Biological
Research, 2002, 35: 385−399.
[15] Yu Y(余 艳), Chen H S(陈海山),Ge X J(葛学军). Op-
timization of Experiment Conditions and Primer
Screening with ISSR Markers [J]. Journal of Tropical
and Subtropical Botany (热带亚热带植物学报), 2003,
11(1): 15−19. (in Chinese with English abstract)
[16] Lan W Z, He G C, Wang C Y, Wu S J, Qin R. Comparative
analysis of genomes in Oryza sativa, O.officinalis, and
O. meyeriana with C0t-1 DNA and genomic DNA of
cultivated rice [J]. Agric Sci China, 2007, 6(9):
1027−1034
[17] Qin R, Wei W H, Jin W W, He G C, Ning S B, Yu S W, Song
Y C. Physical location of rice Gm-6, Pi-5(t) genes in
O. officinalis with BAC- FISH [J]. Chin Sci Bull, 2001,
46: 2427−2430.
[18] Wang Z Y, Second G, Tanksley S D. Polymorphism and
phylogenetic relationships among species in the
genus Oryza as determined by analysis of nuclear
RFLPs [J]. Theor Appl Genet, 1992, 83: 565−581.
[19] Jena K K, Kochert G. Restriction fragment length
polymorphism analysis of CCDD-genome species of
the genus Oryza [J]. Pl Mol Bio, 1991, 16: 831−839.
[20] Bao Y, Ge S. Origin and phylogeny of Oryza species
with the CD genome based on multiple -gene se-
quence data [J]. Plant Syst, 2004, 249: 55−66.
[21] Huang H, Kochert G. Comparative RFLP mapping of an
allotetraploid wild rice species (Oryza latifolia) and
cultivated rice (O.sativa) [J]. Plant Mol Biol, 1994, 25:
633−639.
(责任编辑：王豫鄂)