全 文 ：不同培养条件对悬浮培养茶叶细胞生长及
茶氨酸合成的影响*
华 萍1 , 吕 虎2 , 余继红2 , 冷和平3 , 蒋献猷3 , 华 东2
( 1 南昌大学医学院, 江西 南昌 330006; 2江西师范大学生命科学学院, 江西南昌 330027;
3江西绿色制药有限公司, 江西南昌 330002)
摘要: 婺源绿茶嫩叶用MS 培养基 (加 IBA 2mgPL, 6-BA 4mgPL) 进行茶叶愈伤组织悬浮培养, 研究了不同
培养条件对茶叶细胞悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示, NH4+PNO3- 110P6010 mmolPL、
K+ 10010 mmolPL、Mg2+ 310mmolPL、H2PO4- 310 mmolPL、蔗糖3010 gPL、水解酪蛋白 210 gPL条件下, 茶叶细胞
生长量和茶氨酸积累量均达到最高值; 提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得
到延长, 从而有利于茶氨酸积累; H2PO4- 浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性, 低
H2PO4
- 浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值, 高 H2PO4- 浓度环境中早于细胞生长速
率峰值出现时间; K+ 和Mg2+ 对细胞生长的影响不明显 , 但影响细胞茶氨酸合成酶活性, 维持适量的 K+
和Mg2+ 有利于茶氨酸积累。添加盐酸乙胺可大幅度提高茶氨酸积累量, 并且先加入一定量盐酸乙胺再每
天进行少量补充, 茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好。茶叶细胞生长和茶氨酸积累高峰期在整个培养
过程的第 19~ 22天出现, 从生产效率考虑, 培养周期以 19~ 22天为宜。
关键词: 茶氨酸; 茶叶; 细胞培养; 生物合成
中图分类号: TS 20213, Q 946 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2700( 2006) 02- 215- 04
Effects of Different Culture Conditions on Cell Growth and Theanine
Biosynthesis in Suspension Cells of Camellia sinensis ( Theaceae)
HUA Ping
1
, LBHu
2
, YU J-i Hong
2
, LENG He-Ping
3
, JIANG Xian-You
3
, HUA Dong
2
( 1 Medical College , Nanchang University , Nanchang 330006, China; 2 College of Lif e Science , Jiangxi Normal University ,
Nanchang 330027, China; 3 Jiangxi Green Pharmacy Company Limited , Nanchang 330002, China)
Abstrat: The suspension culture of callus obtained from tender leave of Camellia sinensis was conducted with MS medium
plus IBA 2mgPL and 6-BA 4mgPL in a fermenter. The effects of different factors on the growth of tea cells and the amount
of synthesized theaninewere analyzed. The results showed that both the tea-cell growth and theanine accumulation reached
their peak period from 19 to 22 days after culture. Both growth of the cells and the amount of theanine reached optimal va-l
ues when the medium contained NH4
+PNO3
- 110P601 0 mmolPL, K+ 10010 mmolPL, Mg2+ 310 mmolPL, H2PO4
- 310
mmolPL , sucrose 3010 gPL and protein 210 gPL. Both the logarithmic and stationary phases were enhanced when the
amount of sucrose and protein were raised in the medium. Alteration of H2PO4
- concentration in the medium had an effect
on the simultaneity of the cel-l growth and theanine accumulation. The activity of theanine- synthatase ( L-glutamate: ethy-l
amine lingase) can be affected by K+ andMg2+ . Accumulation of theanine could be greatly raised when ethy-l amine was
supplemented in the medium. The efficiency of ethy-l amine on the accumulation of theanine is related to the addition meth-
od i1 e. sequential supplement of ethy-l amine into the medium was better than single addition of that.
Key words: Theanine; Camellia sinensis ; Suspension culture; Biosynthesis
云 南 植 物 研 究 2006, 28 ( 2) : 215~ 218
Acta Botanica Yunnanica

* 收稿日期: 2005- 07- 02, 2005- 10- 08接受发表
作者简介: 华萍 ( 1961- ) 女, 副教授, 主要从事生物医药研究。
茶氨酸 ( N-乙基-L-谷氨酰胺, N-ethy-l L-glu-
tamine) 为茶叶的特征性氨基酸, 也是茶叶的呈
味物质之一; 茶氨酸可抑制其它食品中的苦味和
辣味物质、改善食品风味, 并且具有多方面的药
理作用, 在食品和医药行业中具有很高的应用前
景 (高小红等, 2004)。固体培养基和液体培养
基摇瓶振荡培养研究表明, 培养基中添加初级胺
类前体物质、适宜的植物激素组合, 可大幅度提
高茶树愈伤组织茶氨酸合成量 (高小红等,
2004; 杜荣茂和詹太华, 2003; 汤 , 2002;
Matsuura等, 1992; Furuya等, 1990) ; 培养基中
的无机元素含量、碳源、氮源等因素都对茶树细
胞生长与茶氨酸合成具有不同影响 (高小红等,
2004; 成浩和高秀英, 2004)。本文采用正交试
验设计, 以婺源绿茶嫩叶为材料用MS 培养基进
行茶叶愈伤组织悬浮培养, 研究了不同培养条件
对茶叶细胞悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合
成的影响。
1 材料与方法
111 材料
采自江西婺源县鄣公山地区的婺源绿茶嫩叶, 经
10%次氯酸钙溶液 15 min 表面消毒后在固体培养基上诱
导成为愈伤组织, 取其中较为疏松的愈伤组织在含
015%纤维素酶的MS 液体培养基中消化 30 min 后接种到
MS 液体培养基中置摇床振荡培养 (转速 100 ? 10 rPmin,
振幅 2~ 3 cm) , 每 7 天继代一次, 接种量为 10 g鲜细胞P
100 ml。连续继代 7 次后将三角瓶静置 30 min, 取上层细
胞液建立悬浮培养细胞系。
112 培养方法
搅拌式发酵罐 ( 20 L, Bioeng ineering NLF22, 桨叶板
型搅拌器) , 转速 90 rPmin, 通气量 110~ 112 vvm; 接种量
5 g鲜细胞P100 ml培养基; 于培养第 5 天加入 25 mmolPL
盐酸乙胺; 培养温度 26? 1e 。
113 基础培养基
MS 培养基, 加 IBA 2mgPL, 6-BA 4 mgPL。
114 培养基成分对细胞生长与茶氨酸合成量的影响
采用正交实验设计, 考察大规模培养过程中培养基
中氮源、碳源、K+ 、Mg2+ 、H2PO4- 、NH4+ PNO3- 等因素
对细胞增长和茶氨酸合成的影响。
115 细胞总量测定
取定量悬浮细胞培养液在 2 000 rPmin下离心 10 min,
沉淀物于 70e 恒温箱中干燥至恒重, 精密称量干燥细胞
总重量。
116 茶氨酸含量测定
定量精密称取干燥至恒重的细胞, 粉碎后用 80% 乙
醇溶液 ( 75 e ~ 80e ) 浸提 2 h, 浸提液经过滤后作为上
样液。采用氨基酸分析仪 (日历 835- 50 型) ; 分析条件
为: 分离柱U4@ 150 mm, 2619 F树脂 (日历公司) ; 滤氨
柱U4 @ 150 mm, 2650 树脂 (日历公司 ) ; 缓冲液 I pH
116, 缓冲液泵流速 0145 mlPmin, 压力 90 kgPcm2; 茚三酮
流速 0130 mlPmin, 压力 10 kgPcm2 ; 进样量 500Ll。
表 1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
水平
levels
因素 Factors
NH4
+PNO3- ( mmolPL) K+ ( mmolPL) Mg2+ (mmolPL) H2PO4- (mmolPL) 蔗糖 ( gPL) 水解酪蛋白 ( gPL)
A B C D E F
1 1010P6010 8010 110 210 3010 010
2 410P6010 10010 210 310 4010 110
3 110P6010 12010 310 410 5010 210
2 结果与讨论
211 茶叶细胞生长周期与茶氨酸生物合成曲线
实验结果显示, 在一个培养周期中, 悬浮培
养的茶叶细胞呈现几个不同的生长阶段; 在培养
的第 10天茶叶细胞生长开始进入加速期 ( acce-l
eration phase) , 细胞数量逐渐增加; 第 13天开始
进入对数生长期 ( logarithmic phase) , 细胞总量迅
速增加; 从第 19天前后细胞增长速度减慢而转
入稳定生长期 ( stat ionary phase) ; 第 22天后细胞
数量逐渐减少转入衰减期 ( decline phase)。茶氨
酸的合成速度在细胞对数生长中后期开始迅速增
加, 积累速率略滞后于细胞增长速率, 培养至第
19~ 22天左右积累量达到峰值, 以后逐渐下降;
并且茶氨酸积累量与细胞生长量密切相关 (表
2)。本文研 究与 Matsuura ( 1992) 和 Furuya
( 1990) 的研究结果基本一致。从生产效率考虑,
细胞培养周期以 22天为宜。
212 培养基组成对细胞生长与茶氨酸合成量的影响
表 2 结果显示, NH4+ PNO3- 、K+ 、Mg2+ 、
H2PO4
- 等元素不同含量以及蔗糖、水解酪蛋白不
216 云 南 植 物 研 究 28卷
同浓度的组合对茶叶细胞增长周期、生长量和茶
氨酸积累量均产生影响。从表 2结果直观分析可
见, 以收获的茶叶细胞量和茶氨酸积累总量为考
察指 标, 6 种 主 要 因 素 的 最 佳 组 合 为
A3B2C3D2E1F3 , 茶叶细胞生长量 ( 16133 gP100
ml) 和茶氨酸积累量 ( 205157 mgPgDW) 均达到
最高值; 实验结果与其它文献 (张莹等, 2003;
Matsuura 等, 1992; Furuya 等, 1990) 报道的在
摇瓶培养和固体中获得最佳组合各主要因素含量
有一定的差异。由此表明, 摇瓶培养获得的工艺
参数不能直接用于放大培养; 进行工业放大时应
综合考虑各种因素影响。
表 2 L18( 37 ) 正交实验设计及结果表
Table 2 Orthogonal design and results
实验次数
t imes
A B C D E F 10thd 13thd 16th d 19thd 22thd 25thd 28th d
1 1 1 1 1 1 1 5173 8199 14106 14199 13196 12154 11179
31104 74174 81100 137144 138169 101101 93171
2 1 2 2 2 2 2 5198 8179 14136 14172 14148 13193 12199
29122 99116 153124 179190 183137 150132 150111
3 1 3 3 3 3 3 5177 9133 13175 14161 14102 14100 13167
30164 87171 109145 108136 102122 103113 96199
4 2 1 1 2 2 3 6101 10143 12160 13190 13181 13182 13118
31197 90102 98133 133193 134144 120192 118107
5 2 2 2 3 3 1 6133 11101 14107 13161 13153 12126 11104
28180 84114 109181 109181 100110 97177 96139
6 2 3 3 1 1 2 5165 9174 15100 14167 14101 13166 12120
29111 92110 117134 149101 156143 120109 106166
7 3 1 2 1 3 2 5160 10159 13197 15184 15102 14141 13116
29192 104159 136187 196132 206100 197133 194104
8 3 2 3 2 1 3 5196 10122 14139 16109 16133 16119 14184
30107 51126 107105 204111 205157 201100 192182
9 3 3 1 3 2 1 5188 9187 15102 15164 13197 12105 11163
28135 164142 201109 196174 183115 180100 156140
10 1 1 3 3 2 2 5169 9195 14199 15131 14105 13133 13119
27143 151139 189199 183163 183101 178156 179170
11 1 2 1 1 3 3 5157 10101 15134 15177 14161 14100 13106
28101 99135 148157 160133 166105 160100 158112
12 1 3 2 2 1 1 5190 10104 15122 15101 14102 11196 10181
30100 98196 130111 147137 132170 121129 105105
13 2 1 2 3 1 3 5199 9199 15146 15146 15103 13144 13116
31103 117164 150148 150110 145104 141174 129196
14 2 2 3 1 2 1 5141 8194 14143 14122 13179 13105 12177
30177 79146 101137 128192 159138 130167 124199
15 2 3 1 2 3 2 5155 9138 14157 14154 14155 14117 12100
31121 110100 140104 173114 170190 167177 168112
16 3 1 3 2 3 1 5176 9143 14111 14100 13137 13104 12183
29155 106154 151102 197125 196150 183137 169156
17 3 2 1 3 1 2 5148 10100 14170 14159 13175 12199 12157
26153 111121 150167 150170 149131 144151 145169
18 3 3 2 1 2 3 5193 10127 14132 15101 15100 14120 13101
27144 89178 160109 197128 187101 174143 161155
( 1) 表中A、B、C、D、E、F 分别表示培养基中NH4+ PNO3- 、K+ 、Mg2+ 、H2PO4- 、蔗糖和水解酪蛋白 6种考察因素; 1、2、3代表各
因素的 3个不同浓度水平; ( 2) 10th d~ 28thd列数据分别为培养不同天数取样检测结果; 做 3个平衡, 结果取均值; ( 3) 检测结果中第
一行数据为茶叶细胞总量 ( gP100ml) , 第二行数据为茶氨酸积累量 ( mgPgDW)。
( 1) In the table, A, B, C, D, E and F represent the medium mixed with NH4
+ PNO3
- , K+ , Mg2+ , H2PO4
- , sucrose and protein; the different
levels of each factor are indicatedwith 1, 2 and 3, respectively; ( 2) The data in right l ines were tested separately on 10thd- 28th d during the culture- pe-
riod. Each item was measured three times and its f igures is the average of the measured values; (3) In the table, the data in the f irst row and in the sec-
ond row represent the figures of cell weight ( gP100ml) and theanine accumulation (mgPgDW) , respectively.
表2结果还显示, H2PO4- 浓度主要影响细胞 生长速率和茶氨酸积累速率的同步性, 低
2172 期 华 萍等: 不同培养条件对悬浮培养茶叶细胞生长及茶氨酸合成的影响
H2PO4
- 浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细
胞增长速率峰值, 而高 H2PO4- 浓度环境中茶氨
酸积累速率峰值出现时间前移; K + 和 Mg2+ 对细
胞生长的影响不明显, 但影响茶氨酸合成酶活
性, 维持适量的 K+ 和 Mg2+ 有利于茶氨酸积累;
提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可使细胞对
数生长期和稳定期得到延长, 从而有利于茶氨酸
积累。这些因素对茶氨酸合成的作用机制还有待
进一步研究。
213 盐酸乙胺及其添加方式对茶叶细胞生长与
茶氨酸积累量的影响
由表 3可见, 添加茶氨酸合成前体物质盐酸
乙胺对茶叶细胞生长量影响较小, 培养前期细胞
增长量基本一致, 培养后期添加盐酸乙胺的细胞
增长量略有增加。但是, 添加盐酸乙胺后对茶氨
酸合成量的影响非常明显; 在没有添加盐酸乙胺
时, 培养细胞中的茶氨酸合成量很少并且几乎没
有增加; 当添加了盐酸乙胺后, 细胞中的茶氨酸
合成量从培养后第 10天后开始迅速增加, 于培
养至 19~ 22 天左右达到高峰, 之后逐渐下降。
本文结果与前人的研究相似 (成浩和高秀英,
2004; Matsuura等, 1992; Furuya等, 1990)。
表 3 盐酸乙胺加入方式与茶叶细胞生长P茶氨酸积累的关系
Table 3 Growth dynamics of tea cell and accumulation of theanine with different ZtNH2-HC-l addting modes
培养时间 ( d) Cultured durat ion (d) 10thd 13thd 16th d 19th d 22thd 25thd 28thd
细胞总量 ( gP100 ml) 6107 10189 14134 15187 16100 15147 14152
Cell quantity ( gP100 ml ) 5196 10122 14139 16109 16133 16119 14184
5199 10105 15100 16127 16109 15180 14177
茶氨酸积累量 ( mgPgDW) 32113 46166 45102 44104 43115 34110 29176
Accumulation of theanine (mgPgDW) 30107 51126 107105 204111 205157 201100 160128
30101 68172 122133 207105 206116 197164 172131
( 1) 做 3个平衡, 结果取均值; 第一行数据为不加盐酸乙胺; 第二行数据为培养第 5天加入 25 mmolPL 盐酸乙胺; 第三行数据为培养
第 5天加入 20mmolPL盐酸乙胺, 并且每天补充 1mmolPL 盐酸乙胺。
( 1) Each item was measured three t imes and its f igure was the average of the measured values. The data in the first row are the ones without ZtNH2-HCl
addition; the f igures in the second row are the ones with ZtNH2-HCl added at 25mmolPL on the f ifth day culture; the f igures in the third row are the ones
with ZtNH2-HCl added at 20 mmolPL on the f ifth day culture and then at 1mmolPL each culture day.
资料报道, 当在培养基中添加 25 mmolPL 的
乙胺时, 茶叶愈伤组织的茶氨酸合成量处于最大
值 (张莹等, 2003; 汤 , 2002)。本文研究通
过对一次性添加和多次添加盐酸乙胺的比较研究
结果显示, 先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少
量补充, 茶氨酸合成量比一次性加入的效果要
好, 茶氨酸积累高峰时间在培养 22 d 出现。培
养基中盐酸乙胺浓度维持在 20 mmolPL 以上时,
茶叶愈伤组织的茶氨酸合成量和细胞生长量即可
保持良好状态; 大规模培养时以多次添加方式补
充盐酸乙胺等前体物可使细胞中茶氨酸合成酶活
性水平处于较高状态, 在细胞密度较高时更是如
此; 可能是, 添加的前体物质能促进或诱导细胞
中茶氨酸合成活性, 使细胞充分利用前体进行茶
氨酸合成; 在培养基中保持一定量的盐酸乙胺等
前体物有利于提高茶氨酸合成速率和积累量。
1参 考 文 献2
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