全 文 ：回归分析在辣椒品种 !#$反应体系优化中的应用!
张子学!，，侯喜林!!
（! 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京 !##$%；
安徽科技学院，安徽 凤阳 &&!##）
摘要：以辣椒（!#$%&’( ))’’( ’(）为材料，采用回归分析的方法对 )*+,体系进行优化研
究。结果表明在体积为 #!-反应体系中，主要因子的优化组合是：./
0、123+、345酶、引
物、模板 ,2*等的浓度分别为 & 667-8’、#9& 667-8’、!9& :、#9;!67-8’和 <; =/；热循环程
序为：$;>预变性 6?=，$;>变性 &# @，;#>退火 ! 6?=，A>延伸 $# @，;A 个循环，最后
A>延伸 !# 6?=。通过对 ;个辣椒品种进行遗传多样性分析，证明该优化体系是稳定可靠
的。
关键词：辣椒；)*+,体系；回归分析
中图分类号：B $;< 文献标识码：* 文章编号：#%&CA##（##%）#;C #;%C #D
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随机扩增多态 ,2*技术，简称“)*+,”（)4=176 *6R-?V?K1 +7-Q67WRO?Y ,2*）。自 \?-H
云 南 植 物 研 究 ##%，>?（;）：;% ] ;&
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!! 通讯作者：*JSO7W 7V Y7WWK@R7=1K=YK( ^ C 64?-：OZ-_=M4J9 K1J9 Y=
收稿日期：##;C!C#<，##%C#%CD接受发表
作者简介：张子学（!$%
点实验室开放基金项目（E\####<）
!#$%等（&’’(）创立以来，由于其与 )*+,、-*+,等其他技术相比，具有操作简便快速、
自动化程度高、通用性好、不受研究对象已有分子研究基础的限制、对模板 ./-需求量
小、量要求低、不接触放射性等多种优点。该技术被广泛应用于动植物和微生物的遗传多
样性分析、亲缘关系鉴定（韩春艳，0((1；张凤琴等，0((1），遗传多样性分析（苏志龙等，
0((2；周利杰等，0((2）、品种（品系）鉴定（陈吉岳等，0((1）等方面，但其稳定性较差。
影响 )-,.反应体系稳定的因素很多，主要有 3405、6/7,、7#8 酶、引物和模板浓度以及热
循环体系中的退火温度和循环次数等。有关 )-,.体系优化研究，虽已有一些报道（王得元
等，0((&；李先平等，0(((；安德荣等，0((&；9:;<:=等，&’’2）但都停留在宏观的经验方
面，尚未见有进行诸因子的作用大小、因子间的相互作用以及各因子与目标函数之间的稳定
性和数量优化研究的报道。本研究中采用逐步回归分析的方法对 )-,.反应体系进行优化，
并应用于辣椒遗传多样性分析的实践中，为提高 )-,.稳定性和可重复性开辟了新途径。
! 材料与方法
!! 材料
)-,.体系优化试验选用的凤椒 &号辣椒品种为安徽技术师范学院育成，0((0年通过鉴定的质核互
作雄性不育系 >恢复系的 *& 为模板 ./-，在初步掌握辣椒 ,?)反应体系构成和引物筛选条件的基础上，
采用扩增条带比较多的 @, -A(0引物，进行体系各方面条件优化。选用 01个辣椒品种（表 &），对筛选
出的 0B条引物具有多态性的扩增结果，进行遗传多样性分析，对优化体系进行验证。
表 ! 辣椒参试品种类型及其来源
7#C!: & 7DE:% #;6 F=4; FG <=#! H#=:<:% ;
!!
!#$%&’(
!!编号 品种名称 类型 来源 编号 品种名称 类型 来源
& BB&’ 长椒 西安市种子公司 &I!! 黄牛角椒 长椒 湖南农业大学
0 上海茄门 甜椒 上海农科院 &1 ’J K 1?!! 甜椒 安徽技术师范学院
I 砀引 &号 甜椒 砀山县种子公司 &2 ’B K J?!! 甜椒 安徽技术师范学院
1 紫甜椒 甜椒 蚌埠市科技园 &J!! 黑壳早 长椒 徐州市种子公司
2 紫簇生椒 簇生椒 安徽技术师范学院 &L 苏引 2!! 号 长椒 江苏农科院
J 萧引 &号 甜椒 萧县辣椒制种基地 &B!! 奶油甜椒 甜椒 蚌埠市科技园
L 萧引 0号 甜椒 萧县辣椒制种基地 &’!! 丰县羊角椒 长椒 丰县种子公司
B 萧引 I号 甜椒 萧县辣椒制种基地 0( 农大 1(!! 甜椒 中国农科院
’ 四叶椒 长椒 寿县种子公司 0&!! 光叶簇生椒 簇生椒 凤阳县种子公司
&( 黄甜椒 甜椒 蚌埠市科技园 00!! 毛叶簇生椒 簇生椒 安徽技术师范学
&& 黄壳早 长椒 徐州市种子公司 0I 砀引 0!! 号 长椒 砀山县种子公司
&0 黄簇生椒 簇生椒 四川重庆 01 紫叶线椒 长椒 安徽技术师范学院
在 )-,.体系中采用的 3405、,?)缓冲液、7#8酶均购自 7#M=#公司，引物、6/7,分别购自 @E:=F;
公司和上海生物工程技术有限公司。
!# 方法
&N0N& ./-提取 采用 ,OP等（&’’I）的 /0QR.R法，并略加改动，利用辣椒新鲜幼嫩果皮，提取过程
中省去 ,S,脱去色素，./-溶解于 7T中， K 0(U保存备用。
&N0N0 试验设计 ,?)体系优化采用二因子全实施和单个因子的试验，包括：3405与 6/7,浓度、7#8 酶
与引物浓度、./-浓度、循环次数和退火温度等研究内容，其因子水平见表 0，以上各因子在不参与优化时，
02!!的反应中分别控制在 0N2 $$F!V+、(NI $$F!V+、& W、(NI!$F!V+、J( ;4、1(次和 1(U。采取分步研究，每个
处理 0次重复。电泳无带的处理，其扩增产物为零，扩增产物为零的处理因无法参与回归运算而舍去。
J01 云 南 植 物 研 究 0L卷
表 ! 辣椒 #$%体系的因子及其水平
!#$% & ’()*+, -. )/%0+ $%1%$, *2 3456 ,7,)%8 0- !#$%&’(
因 子 水 平
9:;$&（88*$<=） &>? &>@ A>? A>@
.B!5（88*$<=） ?>C@ ?>&&@ ?>A ?>AD@
!E酶（F） ?>&@! ?>@ C>? C>@
引物（!8*$<=） ?>C ?>& ?>G ?>H
6B4（-:） C@ A? H? C&? &G?
循环量（次） A? A@ G? G@ @?
退火温度（I） AG>? A@>C AD>J G?>D GA>@ G@>D
AG>A AH>G AK>A G&>C GG>J GH>?
说明：“!”：该因子水平的所有处理组合均无扩增产物（舍弃）。
C>&>A 5;3扩增反应 扩增反应除温度梯度
5;3在 5;3 L0*8%)+ !:+.0%-) KH型上进行之
外，其余的均在 9 M 3%,%+(/ 公司生产的
5!;NC??!9型热循环仪上进行。基本的热循环
程序为：KGI预变性 & 80-，KGI变性 A? ,，
G?I退火 C 80-，D&I延伸 K? ,，G? 个循环，
最后 D&I延伸 C? 80-。&?!$反应体系，扩增
产物用 C倍 !4O 电泳缓冲液在 CG :<=琼脂糖
凝胶板上电泳，加样量 CG!$，电泳结束后，
经溴化乙锭染色 A? 80-，而后采用 F5P 08:N
0-: *2 $#*+)*+7凝胶成像分析系统进行分析。
C>&>G 扩增产物的定量分析 采用6B4建立标准曲线，每次扩增产物的电泳以 C@? -:6B4进行标定，
确定各处理扩增产物的产量。
C>&>@ 回归优化分析 采用曾成秋（CKJJ）逐步回归分析的方法建立模型，因子入选标准 ’ Q ?>@，分别
建立方程，最后对入选因子进行优化分析。
C>&>H 遗传多样性的随机引物筛选 从 CC&条能够扩增产物的随机引物中筛选出 &J条多态性和重复性
强的引物。
C>&>D 遗传多样性的分析方法 每个品种根据扩增条带的有无分别记为 C和 ?，品种间的遗传相似系数：
)* Q &+%,<（+% R +,），其中 +%,为 &个品种共有的带数，+%、+,分别代表成对比较的 &个品种的总带数。
采用卢崇飞等（CKJJ）相似系数 C次成型法构建聚类图。
! 结果与分析
!&’ #$%体系优化分析
&>C>C 9:&R和 .B!5浓度的优化 首先通过对 9:&R和 .B!5浓度进行逐步回归分析，结果
表明二者之间符合 7 Q S C?J@>C R JJH>&DTC R JGH>KJT& S CDJ>?JTC& S GHA@>&T&& R H@H>GATC T&
（’ Q &D>CD）回归达极显著水平，可以用于预测和控制，通过对偏回归系数的标准化分析
表明，二者及互作对目标函数的作用大小的比较关系为：9:&R U .B!5 U二者的互作效应。
分别对 TC 和 T& 求一阶导数得方程组：
S A@H>CHTC R H@H>GAT& R JJH>&D Q ? （C）
S K&D?>GT& R H@H>GATC R JGH>KJ Q ? （&{ ）
解之得：当在 &?!$的反应体系中添加 A>?@ 88*$<= 9:
&R和 ?>A?DH 88*$<= .B!5时，扩
增产物的产量达到或接近极大值（AKK>?A -:）。
从图 C中也可以看出：在 9:&R &>@ V A>@ 88*$<=和 .B!5 ?>&&@ V ?>AD@ 88*$<=范围内
均能扩增出较为一致的条带，但也有一定的差异，在此范围内，随着 .B!5浓度的增加，
扩增条带数呈下降的趋势。同时，在同一 .B!5浓度下，随着 9:&R浓度的增加，扩增条带
数呈增加的趋势。
&>C>& !E酶与引物浓度的优化 从 !E 酶与引物（5+08%+）& 因子逐步回归分析表明，
符合 7 Q S KAC>&? R C&AC>JTC R &JDG>@T& S GC@>CHTC& S &JJ?>JT&& S A@A>?&TC T&，（’ Q CK>GA）
回归极显著，通过求一阶偏导，得极大值点的坐标（C>A?H，?>GCJK）。说明在 &?!$的反应
D&GA期 张子学等：回归分析在辣椒品种 3456反应体系优化中的应用
图 ! 不同 #$%和 &’()浓度对 *+),带型的影响
-.#/ ! 011234 56 *+), 7851.92: .6 &.1128264 35632648;4.56 51 #$% ;6& &’() .6 !#$%&’(
：<;8=28（!,’+>0 35*! % ?.6&），下同。! @ A、B @ C、D @ !$和 !E @ !F分别用 GH!B、GH$$B、GHEG和 GHEIB <<59>J
&’()处理；每种 &’()处理浓度内随编号从小到大 #$%处理浓度逐渐提高（表 $）。每个处理皆为 $次重复。
体系中有 !HE K (;L酶活性和 GHA!CD#<59>J引物时，扩增产量最高。同时，通过对偏回归
系数的标准化分析表明，二者及互作对目标函数的作用大小的比较关系为：引物 M (;L酶
M 二者的互作效应。从图 $也可以看出，在试验区间范围内，低浓度的 (;L酶，需要有
较高浓度的引物下，才能扩增出产物；在适宜的 (;L酶浓度下，引物浓度低时，仅有少量
大片段的扩增产物，且扩增产量较低；随着引物浓度的逐渐增加，扩增带数及扩增产量趋
于稳定，当引物浓度超过一定量时，扩增大片段的产量相对下降，小片段的产量相对提
高。这是由于引物浓度过高，在变性至复性的初始阶段，引物之间相互竞争，结合在同一
模板片段不同位点引物数的概率增加，导致扩增大片段的延伸受阻、产率下降，小片段的
产率相对提高。这也是 N8O65等（!DDE）和顾红雅等（!DDB）所论述的造成 )P*非特异性
扩增的主要原因之一。
图 $ 不同 (;L和 )8.<28浓度对 *+),带型的影响
-.#/ $ 011234 56 *+), 7851.92: ;4 &.1128264 35632648;4.56 51 (;L 26QR<2 ;6& 78.<28
! @ A、B @ C、D @ !$为从低到高 E种 (;L酶处理浓度；每种 (;L酶处理浓度内从小到大分为 A种
)8.<28处理浓度（表 $）。每个处理皆为 $次重复。
$H!HE 循环量和模板 ,’+浓度的优化 对循环量和模板 ,’+浓度逐步回归分析表明：符
合 R S T ABBHIE % $$EHDGU! % EH!$CEU$ T $HEECCU!$ T GHG!G!EFU$$ T GHGECC$BU! U$，（- S !AFHED）
C$A 云 南 植 物 研 究 $I卷
回归极显著，当 !极大时，循环量为 #次，模板 $%&的浓度为 ’()*+ ,-。根据标准化的
偏回归系数可知，其因子的作用大小比较关系为：循环量 .模板浓度 .互作效应。从图 (
也可以看出这一点，在整个区间范围内，随着循环量的增加，扩增产物的产量和扩增条带
数有逐渐增加的趋势。当模板浓度在 /0 1 /23 ,-，循环量在 3 1 03次时，扩增带数基本相
等，但在模板浓度 23 ,-时，循环量低于 3次，无可见的扩增产物带，随着循环量的增
加，虽能扩增出产物，但扩增产物的产量低，且带数少。其原因是反应体系中模板、引物
和 4%56都可与 7-28结合，7-28为 59:酶活性不可缺少的辅助因子，由于模板浓度的过量
提高，使自由 7-28的浓度下降，因而阻碍了 ;&6$反应。在其他条件不变时，将 7-28浓
度提高到 <<=>?@，其扩增产物及其条带数明显增加。但7-28浓度过高也会增加引物的错
配频率（安德荣等，233/，张凤琴等，233(）。
图 ( 不同循环量和模板 $%&浓度对 ;&6$带型的影响
AB-C ( DEEFGH =, ;&6$ IJ=EB>FK 9H 4BEEFJF,H G!G>F ,L
/ 1 0、’ 1 /3、// 1 /0、/’ 1 23和 2/ 1 20分别为 (3、(0、3、0和 03次循环；每种循环处理内从小到大分别为 0种
不同模板 $%&浓度（/0、(3、’3、/23和 23 ,-）的处理组合。皆为 2次重复。
2)/) 退火温度的优化 从退火温度优化拟合分析表明，在试验区间范围内，符合 ! N O
)+2P2 8 (+()’(P O #/0)3的二次曲线，其最佳退火温度为 (+)+#Q。从图 可以看出，在
试验区间内，退火温度低的情况下，主要扩增产物是一些大片段，而随着退火温度的逐渐
提高，扩增产物中大片段的比例逐渐减少，而小片段的比例逐渐增多。同时，在试验区间
范围内，随着退火温度的提高，扩增条带数有逐渐增加的趋势。这是由于在退火温度较低
的情况下，虽然循环体系除退火温度不同外，其余条件完全相同，然而就是因为退火温度
+2(期 张子学等：回归分析在辣椒品种 ;&6$反应体系优化中的应用
低，从变性温度 !#降到退火温度，再上升到延伸温度，所经历的时间延长，其结果引
物与模板 $%&结合和扩增产物延伸时间相对延长，导致扩增大片段产物较多，小片段很
少或没有。相反，退火温度提高，从变性到延伸所经历的时间缩短，其结果扩增产物中小
片段的比例增多，同时，由于扩增片段较小，’(或 &)碱基对比例相对增大，不同位点
的扩增产物的相对差异增大，不同片段的泳动距离差异拉大，扩增带数增多。这与刘红彦
等（*++,）的观点是基本一致的。
图 不同退火温度对 -&.$带型的影响
/012 344567 89 -&.$ :;840<5= 09 >0445;597 ?995?<091 75@:5;?7A;5
, B C、D B ,*分别为从低到高 *组不同的退火温度处理（表 *），每个处理皆为 *次重复；(E：阴性对照。
!! 供试品种的遗传多样性分析
*F*F, -&.$分析 通过 *G条随机引物对 *个辣椒品种的 -&.$分析，共扩增出 ,GC条 $%&
带，其中 ,CH条具有多态性，说明不同的辣椒品种之间的遗传多样性是很丰富的（图 H）。
图 H *个辣椒品种的 $%&采用随机引物 &I+D扩增的 -&.$条带
/012 H -&.$ :;840<5= ?@:<0405> JK ;?9>8@ :;0@5; &I+D 09 * !#$%&’( L?;05705=
*F*F* 聚类分析 *个品种的聚类结果见图 C。在聚类域值!M +FCN+时分为 N大类群：簇
生椒类型、甜椒类型和长椒类型，其中簇生椒与另外两类的遗传差异较为明显，说明簇生椒
与其他两类在起源上分化较早，长椒和甜椒相对在起源上分化较晚，它们属于 ! F ))’’( O2
的 N个不同变种，这与栽培学上的分类是完全相符的。
簇生椒的遗传多样性 簇生椒共有 个品种，其中紫叶簇生椒与其他 N种簇生椒的遗
传差异较大，光叶簇生椒与毛叶簇生椒的遗传差异最小。
甜椒的遗传多样性 甜椒又可分为 *个亚类，分别包含 H个和 C个品种。从图 C可以
+N 云 南 植 物 研 究 *D卷
看出，亚类内不同品种间遗传相似性很高，而亚类间遗传差异则较为明显；这为甜椒不同
品种间杂种优势利用提供了可能性。
图 ! #个辣椒品种的遗传关系聚类图
$%&’ ! ()*+,-&,./ -0 &)*)1%2 ,)3.1%-*45%64 ./-*& # 7.,%)1%)4 -0 !#$%&’(
长椒的遗传多样性 长椒也可以分为两个亚类：长尖椒和棒形椒，分别包括 !个和 8
个品种。由于长椒类的品种分别源于我国不同地区的地方品种，比甜椒具有更高的遗传多
样性水平。这与 9)0):,7)等（;<<）所报道结果是一致的，从一定程度上也反映出我国长
椒资源的遗传多样性较为丰富。
! 讨论
=>?(的反应程序是基于 ?@=反应体系的。因而该反应体系的优化便是获得理想的
=>?(图谱的前提条件。本研究中从提高扩增产物的产量和稳定性出发，对辣椒 =>?(体系
中的 A个因子进行了优化处理探索。该优化体系在 B&C浓度、退火温度和循环量方面略高
于王得元等（DD;），李先平等（DDD），安德荣等（DD;）的报道。在较高的 E.F 酶浓度时，
扩增产物并不象安德荣等（DD;）所报道的出现弥散现象，只是扩增产量下降，条带数减
少。总之，在 =>?(反应体系中，B&C、+GE?、E.F 酶、引物、模板 (G>等的浓度、循环量
和退火温度等方面都存在如何优化的问题。本文仅以扩增产物的产量作为目标函数进行优
化，与最理想的体系尚有差距。我们认为以扩增产量、清晰度和稳定性为综合目标，编制应
用程序分析软件，并引入凝胶成像分析系统，对人为可控因子水平进行合理量化，结合操作
程序规范化，才能使 =>?(技术更准确、更稳定，才能更好地应用于生物遗传育种研究。
结论
通过对辣椒 =>?(反应体系的 A个因子的优化分析表明，在 D!3的反应体系中，优
化组合是：B&C、+GE?、E.F酶、引物、模板 (G>等的浓度分别为 8 //-3H9、DI8 //-3H9、
;I8 J、DI#!/-3H9和 !# *&；在热循环程序中其他参数相同的条件下，采用 #DK退火 ; /%*，
#A个循环可以获得较为稳定、可靠的扩增产物。
在试验区间范围内，采用 因子或单因子的回归优化分析表明 B&C比 +GE?、引物比
;8#8期 张子学等：回归分析在辣椒品种 =>?(反应体系优化中的应用
!#酶、循环量比模板 $%&浓度及其互作效应对扩增产量及稳定性影响更大，互作效应的
影响均最小；退火温度的高低仅对扩增产量及条带数有一定影响。因此，在 ’&($反应体
系优化过程中，首先对 )*+,、引物浓度和循环量进行优化，可以取得事半功倍的效果。
应用本研究辣椒 ’&($优化体系，采用相似系数直接 -次成型聚类法，所得到的聚类
结果与蔬菜栽培学各论（南方本）（浙江农业大学主编，-../）的辣椒分类是一致的，这
说明采用该 ’&($体系进行辣椒遗传多样性分析是可行的。
〔参 考 文 献〕
王得元，张长远，殷秋妙，+00-1 辣椒 ’&($反应体系研究［2］1 广东农业科学，（-）：+-—++
卢崇飞，高惠璇，叶文虎编著，-.331 环境数理统计学应用及程序［)］1 北京：高等教育出版社，-4/—-5.
顾红雅，瞿礼嘉，明小天等编著，-..61 植物基因与分子操作［)］1 北京：北京大学出版社，-+-—-+7
浙江农业大学主编，-../ 1 蔬菜栽培学各论（南方本）（第 +版）［)］1 北京：农业出版社，++.—+/0
曾成秋著，-.33 1 数理统计程序设计与使用［)］1 合肥：安徽教育出版社，-07—-+7，+74—+6-
&8 $’（安德荣），9:;8* 2<（程继红），9:;8* =)（成卓敏）， ! #$，+00-1 >?@AB C8 DCE; FGCHI;ED HC@? ?:; G;F;? HJIJ?B CK
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>@ =T（苏志龙），SJ8 ><（殷寿华），P@ 92（吴成军）， ! #$，+0061 &8IBDJD CK *;8;?JO D?G@O?@G; CK ?:; ;8A8*;G;A DF;OJ;D
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［2］1 ?’-$!,- 1-,;0 @!0!#(-4，%：46/-—46/6
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+/7 云 南 植 物 研 究 +5卷