全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 4期 2016年 2月
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山楂原花青素及维生素 C对胰岛素抵抗大鼠肝脏氧化应激的影响
宓 伟 1,练 武 1,尹淑英 1,赵 倩 1,杨晓慧 2,张爱萍 2,华 蕾 2
1. 滨州医学院公共卫生与管理学院,山东 烟台 264003
2. 滨州医学院临床医学院,山东 烟台 264003
摘 要:目的 探讨山楂原花青素(HPC)和维生素 C(VC)联合应用对胰岛素抵抗(IR)大鼠肝脏氧化应激的影响。方
法 高脂饮食法制备 IR大鼠模型,检测大鼠造模后体质量、空腹血糖、血清胰岛素水平,试剂盒法检测血清丙氨酸转氨酶
(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性;将 IR大鼠分为模型组、HPC(56 g/kg)组、VC(180 g/kg)
组、HPC(56 g/kg)+VC(180 g/kg)组和罗格列酮(122 g/kg)组,连续给药 12周,测定各组大鼠肝匀浆中葡萄糖、胰岛
素、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)
水平和肝线粒体中 SOD、GSH-Px、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶及MDA水平;实时荧光定量 PCR(RT-PCR)检测
过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(PPAR-γ)mRNA表达;Western blotting法检测 PPAR-γ 蛋白表达情况。结果 与对照组比
较,造模后大鼠体质量显著下降(P<0.05),血糖、血清胰岛素水平、ALT、AST 和 ALP 活性均显著升高(P<0.01);模
型组大鼠肝匀浆中 SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性均显著下降(P<0.01),葡萄糖、胰岛素、MDA水平显著升高(P<0.01),
肝线粒体中 SOD、GSH-Px、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均显著降低(P<0.01),MDA水平显著升高(P<0.01);
肝组织 PPAR-γ mRNA、蛋白表达明显下降(P<0.01)。HPC、VC、HPC+VC 和罗格列酮对上述指标均有改善作用,HPC+
VC组作用优于 HPC组和 VC组,与罗格列酮组效果相当。结论 HPC和 VC联合作用可改善 IR大鼠肝脏氧化应激状态。
关键词:山楂原花青素;维生素 C;胰岛素抵抗;肝脏氧化应激;过氧化物酶体增殖物激活受体 γ
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2015)04 - 0625 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.04.016
Effect of hawthorn proanthocyanidins and vitimin C on liver oxidative stress in
insulin-resistance rats
MI Wei1, LIAN Wu1, YIN Shu-ying1, ZHAO Qian1, YANG Xiao-hui2, ZHANG Ai-ping2, HUA Lei2
1. College of Public Health and Management, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China
2. College of Clinical Medicine, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China
Abstract: Objective To explore the effect of hawthorn proanthocyanidins (HPC) and vitimin C (VC) on liver oxidative stress in
insulin-resistance rats. Methods The insulin-resistance models were prepared by high-fat diet, the weight variations of all rats were
tested before and after modeling, so were the contents of fasting blood-glucose and serum insulin after modeling. The colorimetric
technique was used to test the concentration of serum ALT, AST, and ALP. The rats in high-fat diet group, who were succeeded in
modeling, were divided into model, HPC (56 g/kg), VC (180 g/kg), HPC (56 g/kg) + VC (180 g/kg), and rosiglitazone (122 g/kg)
groups. After 12 weeks of continuous administration, these indexes, such as levels of SOD, CAT, GSH-Px, GSH, and MDA in liver
homogenates and SOD, GSH-Px, Na+, K+-ATPase, Ca2+, Mg2+-ATPase, and MDA in liver mitochondria, were all tested; RT-PCR was
used to test the expression of PPAR-γ mRNA; The Western blotting method was adopted to test the PPAR-γ protein expression. Results
After modeling, the body weight of rats decreased significantly (P < 0.05), the concentration of blood, such as glucose, serum insulin
ALT, AST, and ALP all increased significantly (P < 0.01); The model group was compared with control group, the activities of SOD,
CAT, GSH-Px, and GSH were significantly decreased (P < 0.01), the levels of glucose, insulin, and MDA increased significantly (P <
0.01) in rat liver homogenate, the activities of SOD, GSH-Px, Na+, K+-ATPase, and Ca2+, Mg2+-ATPase were significantly decreased
(P < 0.01) and MDA level increased significantly (P < 0.01) in the liver mitochondria; PPAR-γ mRNA and protein expression
decreased significantly in liver tissue (P < 0.01). HPC, VC, HPC + VC, and rosiglitazone improved the above indexes, which in the
收稿日期:2015-06-30
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81302423);滨州医学院科技计划项目(BY2013KJ86)
作者简介:宓 伟(1978—),男,硕士,研究方向为植物化学药物与慢性病。Tel: (0535)6913218 E-mail: miweinew@163.com
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HPC + VC group was better than that in the HPC group and VC group, equivalent to that in rosiglitazone group. Conclusion Liver
oxidative stress which is resulted from insulin-resistance can be improved when HPC and VC are combined.
Key words: hawthorn proanthocyanidins; vitimin C; insulin-resistance; liver oxidative stress; PPAR-γ
胰岛素抵抗(insulin-resistance,IR)是各种原
因导致人体组织细胞对胰岛素敏感性下降,体内葡
萄糖的摄取和利用效率降低,血糖过高,使机体代
偿性地分泌胰岛素,导致高胰岛素血症[1]。研究表明,
肝脏是调节血糖的重要脏器,高血糖可损坏肝线粒
体功能,产生大量的细胞内活性氧(ROS),所以肝
脏氧化应激在 IR 的发展进程中起着重要的作用[2]。
IR与多囊卵巢综合征、冠心病、高血压、脂肪肝等
疾病存在密切联系,危害个人健康的同时也给家庭
和社会带来了沉重的负担[3]。原花青素由不同数量
儿茶素或表儿茶素缩合而成,是多酚类化合物的总
称,主要来源于山楂、葡萄籽和松树皮等,目前国
际上公认其为清除机体自由基最有效的天然抗氧化
剂 [4]。其中以低聚体形式存在的山楂原花青素
(HPC)生物活性要远高于从其他植物中提取的高聚
体原花青素[5]。维生素 C(VC)在新鲜蔬菜和水果
中量丰富,在氧化还原代谢反应中起着重要调节作
用,可稳定其他抗氧化剂的活性[6]。HPC和 VC均
作为高效抗氧化剂,联合应用对机体产生的影响未
见报道。本实验通过高脂饮食制备 IR大鼠模型,探
讨 HPC和 VC联合应用对 IR大鼠肝脏氧化应激的
影响,为临床研制和开发新药提供实验和理论依据。
1 材料
1.1 动物
Wistar大鼠 66只,6~8周龄,体质量(190±
15)g,SPF级,由滨州医学院实验动物中心提供。
合格证号 SCXK(鲁)2013-0006。无特定病原体条
件下常规饲养,适应性喂养 1周后用于实验。
1.2 药物及主要试剂
HPC(质量分数为 95%,中国西安绿天生物技
术有限公司,批号 20120401);VC(华南药业集团
有限公司,批号 H44020774);罗格列酮(成都恒瑞
制药有限公司,批号 H20030569)。胰岛素酶联免疫
吸附试剂盒(美国 Millipore 公司);丙氨酸转氨酶
(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶
(ALP)、葡萄糖、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化
氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还
原型谷胱甘肽(GSH)、Na+, K+-ATP 酶、Ca2+,
Mg2+-ATP 酶、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成
科技有限公司);逆转录试剂盒、PCR 扩增试剂盒
(江苏和创生物科技有限公司);抗过氧化物酶体增
殖物激活受体 γ(PPAR-γ)兔多克隆抗体,抗 β-actin
小鼠单克隆抗体、辣根酶标记山羊抗兔 IgG抗体(美
国 Sigma公司)。
1.3 仪器
One-Touch全自动血糖仪及配套血糖试纸(美国
强生公司产品);722 型分光光度计(上海菁华科技
仪器有限公司);TDL-40B台式离心机(上海安亭科
学仪器厂);凝胶成像分析系统(美国 Alpha Innotech
公司);实时荧光定量 PCR(RT-PCR)仪(澳大利
亚 Corbett公司);酶标仪(Molecular Devices)。
2 方法
2.1 模型的制备
对照组给予普通饲料(玉米 73.5%、麦麸 20%、
鱼粉 5%、谷粉 1%、食盐 0.5%),模型组给予高脂
饲料(普通饲料 78.8%、胆固醇 1%、牛胆盐 0.2%、
蛋黄粉 10%、猪油 10%),同时喂养 2 个月。造模
前后称体质量。造模结束后,大鼠禁食 1夜,次日
上午断尾取血 1 mL,检测大鼠空腹血糖,同时眼眶
静脉取血,4 000 r/min离心 8 min,取上清,分别检
测血清胰岛素水平和 ALT、AST、ALP活性。
2.2 动物分组、给药及指标检测
66只大鼠随机分为对照组(10只)和高脂饮食
组(56只)。将造模成功的高脂饮食组大鼠(50只)
随机分为模型组、HPC(56 g/kg,预试验得出的有
效剂量)组、VC(180 g/kg)组、HPC(56 g/kg)+
VC(180 g/kg)组和罗格列酮(122 g/kg)组,每组
10只,ig给药,给药体积 20 mL,每天给药 1次,
对照组和模型组给予等体积的生理盐水。连续给药
12周后将大鼠处死并迅速取肝脏,利用常规方法制
备肝匀浆和肝线粒体,测定各组大鼠肝匀浆中葡萄
糖、胰岛素、SOD、CAT、GSH-Px、GSH、MDA
水平和肝线粒体中 SOD、GSH-Px、Na+, K+-ATP酶、
Ca2+, Mg2+-ATP 酶及 MDA 水平,检测方法严格参
照试剂盒说明书。
2.3 RT-PCR检测 PPAR-γ mRNA表达
称取大鼠肝脏组织 200 g,Trizol法提取完整、
纯度良好的 RNA,参照逆转录试剂盒的操作规程合
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成 25 μL cDNA,PCR扩增 PPAR-γ 基因片段。PPAR-γ
基因的 PCR 扩增反应条件:94 ℃变性 3 min,
94 ℃、30 s,60 ℃、60 s,72 ℃、30 s条件下扩增
35个循环,4 ℃保存。引物序列:PPAR-γ 正向引物
5’-AATACGTCAGACTTCGGGAAGCA-3’,反向引
物 5’-GTCAATGTACAGCTGCCGTACACA-3’(498
bp); GADPH 正向引物 5’-CCAAGGCCAAC-
CGCGAGAAGATGA-3’,反向引物 5’-AGGGTAC-
ATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’(587 bp)。反应后取
10 μL PCR 扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳,利用凝
胶成像系统分析灰度值,实验重复 5次。
2.4 Western blotting法检测 PPAR-γ 蛋白表达
取大鼠肝脏组织 100 mg,以 PBS洗涤 2次,
弃 PBS液,加入 2 mL裂解液,置摇床,200 r/min
震摇 30 min,收集裂解液 1.5 mL置 EP管中,分 2
管,4 ℃、12 000 r/min离心 5 min,取上清液,超
滤备用。分别取 20 mg蛋白样品,SDS-PAGE凝胶
电泳分离;将蛋白条带转移至 PVDF膜后立刻用含
5%脱脂奶粉的 TBST封闭 2 h;依次加入一抗(抗
PPAR-γ 兔多克隆抗体,抗 β-actin小鼠单克隆抗体)
及相应二抗;经洗涤后 ECL系统检测,曝光 20 s~
5 min,显影 2 min,定影 5 min。洗片后用 Quanlity
One 软件扫描各条带,获取目的蛋白灰度值,实验
重复 5次。
2.5 统计学处理
数据以 ±x s表示,采用 SPSS 17.0软件进行统
计学分析,组间比较采用 t检验或单因素方差分析。
3 结果
3.1 IR大鼠造模结果
造模后出现 IR(血糖升高、胰岛素水平升高)的
大鼠共 50 只,与对照组比较,高脂饮食组大鼠体质
量显著下降(P<0.05),血糖及血清胰岛素、ALT、
AST和ALP水平均显著升高(P<0.01),结果见表 1。
3.2 对肝组织中各项指标的影响
与对照组比较,模型组大鼠 SOD、CAT、
GSH-Px、GSH活性均显著下降(P<0.01),葡萄糖、
胰岛素、MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组
比较,HPC组、VC组、HPC+VC组和罗格列酮组
SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性显著升高(P<0.01),
MDA水平显著降低(P<0.01);HPC+VC组和罗
格列酮组葡萄糖、胰岛素水平显著降低(P<0.01)。
同时,HPC+VC和罗格列酮对 SOD、CAT、GSH-Px、
GSH、MDA水平的改善作用优于 HPC组和 VC组
(P<0.05)。结果见表 2。
3.3 对肝线粒体中各项指标的影响
与对照组比较,模型组大鼠肝线粒体中 SOD、
GSH-Px、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性
均显著降低(P<0.01),MDA水平显著升高(P<
表 1 对照组和模型组大鼠观察指标比较 ( ±x s )
Table 1 Comparison of observational indexes of rats in control and model group ( ±x s )
组别 n/只 体质量/g 血糖/(mmol·L−1) 胰岛素/(μU·mL−1) ALT/(U·L−1) AST/(U·L−1) ALP/(U·L−1)
对照 10 333.944±6.386 5.329±0.131 25.761±2.928 57.300± 6.499 63.400±10.189 111.200±15.873
模型 50 329.467±4.897* 7.372±0.400** 56.456±9.815** 399.480±35.550** 162.700±23.018** 211.660±28.414**
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01,下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below
表 2 各组大鼠肝匀浆中各项指标检测结果 ( ±x s , n = 10)
Table 2 Testing results of each index in liver homogenate of rats in each group ( ±x s , n = 10)
组别
葡萄糖/
(mmol·L−1)
胰岛素/
(μU∙mL−1)
SOD/
(U·mg−1)
CAT/
(U·mg−1)
GSH-Px/
(U·mg−1)
GSH/
(μmol∙g−1)
MDA/
(μmol∙g−1)
对照 5.218±0.341 24.952±2.647 199.500± 8.003 9.100±1.350 458.700± 7.945 32.650±1.958 0.949±0.098
模型 7.025±1.398** 55.954±8.627** 157.200±14.405** 8.000±1.098** 354.100±13.304** 21.490±1.813** 1.516±0.080**
HPC 6.954±1.125** 48.647±6.257** 198.000±13.864## 9.890±0.489## 444.700±17.650## 25.840±0.931## 1.025±0.152##
VC 7.014±1.589** 52.347±7.657** 192.000±9.019## 9.790±0.458## 436.900±12.591## 25.190±1.790## 0.978±0.071##
HPC+VC 5.634±1.357##▲ 29.268±5.698##▲ 214.300±10.034##▲ 12.820±0.700##▲ 526.000±15.144##▲ 29.370±1.650##▲ 0.951±0.094##▲
罗格列酮 5.347±0.457##▲ 26.347±2.687##▲ 214.200±10.570##▲ 11.770±0.718##▲ 465.500±14.034##▲ 28.210±1.063##▲ 0.863±0.108##▲
与模型组比较:##P<0.01;与 HPC组或 VC组比较:▲P<0.05,下同
##P < 0.01 vs model group; ▲P < 0.05 vs HPC or VC group, same as below
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0.01)。与模型组比较,VC组、HPC+VC组和罗
格列酮组各指标均有显著改善(P<0.01),HPC
升高 SOD活性,但差异不显著,对其他指标均有
显著改善作用(P<0.01)。与 HPC组、VC组比较,
HPC+VC 组和罗格列酮组 SOD、GSH-Px、Na+,
K+-ATP 酶、Ca2+, Mg2+-ATP 酶活性显著升高(P<
0.05),MDA水平显著降低(P<0.05)。结果见表 3。
3.4 对肝组织 PPAR-γ mRNA表达的影响
与对照组比较,模型组大鼠 PPAR-γ mRNA 表
达明显下降(P<0.01);与模型组比较,HPC组、
VC组、HPC+VC组和罗格列酮组 PPAR-γ mRNA
表达均明显升高(P<0.01);与 HPC组、VC组比
较,HPC+VC组和罗格列酮组 PPAR-γ mRNA 表达
明显升高(P<0.05)。结果见图 1。
表 3 各组大鼠肝线粒体中各指标检测结果 ( ±x s , n = 10)
Table 3 Testing results of each index in liver mitochondia of rats in each group ( ±x s , n = 10)
组别 SOD/ (U·mg−1)
GSH-Px/
(U·mg−1)
Na+, K+-ATP酶/
(U·mg−1)
Ca2+, Mg2+-ATP酶/
(U·mg−1)
MDA/
(nmol·g−1)
对照 133.700±3.917 322.000±12.858 6.910±0.325 9.910±0.431 1.212±0.066
模型 108.100±8.144** 274.400±19.795** 3.900±0.598** 7.520±0.469** 3.389±0.219**
HPC 118.200±5.514** 301.300±11.206## 4.390±0.318## 8.570±0.581## 1.864±0.118##
VC 112.800±3.293## 285.100±11.628## 4.280±0.394## 8.060±0.403## 2.411±0.110##
HPC+VC 132.400±4.222##▲ 347.300±17.134##▲ 6.090±0.657##▲ 9.920±0.522##▲ 1.360±0.906##▲
罗格列酮 128.500±5.276##▲ 333.200±12.735##▲ 6.020±0.598##▲ 9.680±0.555##▲ 1.388±0.109##▲
图 1 各组大鼠肝组织 PPAR-γ mRNA表达 ( ±x s , n = 5)
Fig. 1 Expression of PPAR-γ mRNA in live tissue of rats in
each group ( ±x s , n = 5)
3.5 对肝组织 PPAR-γ蛋白表达的影响
与对照组比较,模型组大鼠 PPAR-γ 蛋白表达明
显下降(P<0.01);与模型组比较,HPC组、VC组、
HPC+VC组和罗格列酮组 PPAR-γ 蛋白表达均明显
升高(P<0.01);HPC+VC组和罗格列酮组 PPAR-γ
蛋白表达比 HPC 组、VC 组明显升高(P<0.05),
结果见图 2。
4 讨论
肝脏相关疾病是 IR发展过程中的常见并发症,
其共同病理基础为肝细胞的损伤[7]。血清 ALT 和
图 2 各组大鼠肝组织 PPAR-γ蛋白表达 ( ±x s , n = 5)
Fig. 2 Protein expression of PPAR-γ in live tissue of rats in
each group ( ±x s , n = 5)
AST等的活性均可反映肝细胞的损伤程度,ALT增
高提示肝细胞膜通透性增高并遭到破坏;在肝实质
细胞线粒体中合成的 AST 活性增高表示线粒体受
到损伤;ALP也是肝损伤的测定指标之一,与胆管
的功能有关[8]。本研究中,模型组大鼠血清 ALT、
AST、ALP 活性均增高,说明 IR 大鼠均出现了肝
损伤。另外大量研究表明氧化应激在肝细胞损伤中
起着十分重要的作用[9]。肝脏氧化还原系统由抗氧
化酶类、抗氧化剂及其他酶类构成,其中 SOD 构
成抗氧化第一道防线,可消除单线态氧;GSH是有
效的巯基抗氧化剂,可防止血红蛋白和其他辅因子
352 bp
489 bp
614 bp
770 bp
1 057 bp
PPAR-γ
GAPDH
PPAR-γ
β-actin
1.5
1.0
0.5
0
PP
A
R-
γ/G
A
PD
H
10
8
6
4
2
0
模型 罗格列酮 HPC+VC HPC VC 对照
模型 罗格列酮 HPC+VC HPC VC 对照
**
##▲ ##▲
##
##
PP
A
R-
γ/β
-a
ct
in
**
##▲ ##▲
## ##
5.1×104
4.3×104
模型 罗格列酮 HPC+VC HPC VC 对照 Marker 模型 罗格列酮 HPC+VC HPC VC 对照
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受到氧化损伤,减弱氧化应激;CAT、GSH-Px 都
可清除 H2O2,减轻并阻断氧化反应引发的损伤[10]。
线粒体也有自身的一套抗氧化防御系统,充分保证
物质代谢和细胞能量顺利进行,同时存在于膜上的
ATP依赖酶(Na+, K+-ATP酶和 Ca2+, Mg2+-ATP酶)
的活性大小也是反映细胞能量代谢和功能损伤情况
的指标之一。罗格列酮是治疗糖尿病的一种常规药
物,对 PPAR具有高选择性、强效激动性,可通过
提高靶组织对胰岛素的敏感性而有效降低血糖,然
而贫血、水肿等并发症的存在,使此药的使用受到
一定限制[11],因此仍需开发并研制出更为安全的天
然药物。PPAR 是一类配体激活的核转录因子超家
族成员,其中 PPAR-γ 可通过磷脂酰肌醇-3 激酶
(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、瘦素和脂联
素等信号转导途径参与糖代谢过程,增强外周组织
对胰岛素的敏感性,改善 IR状况[12]。
IR 大鼠同时摄取 HPC 和 VC,体内 PPAR-γ
mRNA和蛋白表达增强,PPAR-γ 途径被激活,肝匀
浆中 SOD、CAT、GSH-Px、GSH 活性明显增强,
MDA下降,肝线粒体中 SOD、GSH-Px、Na+, K+-ATP
酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶表达明显升高,肝脏的氧化还
原系统被激活,从而保护肝组织,改善 IR。HPC+
VC联合应用比 HPC、VC单独作用活性要强,同罗
格列酮活性相差不大,说明 HPC和 VC可产生联合
作用,改善 IR 肝脏氧化应激,且由于 HPC 和 VC
均为食物中的营养成分,无明显副作用,有一定的
开发和研究价值。
综上所述,HPC 和 VC 联合应用改善 IR 肝脏
氧化应激作用与 PPAR-γ 途径有关,但 HPC和 VC
如何同时作用于受体,PPAR-γ 途径如何抑制 IR大
鼠肝脏氧化应激,目前尚不清楚,仍需进一步研究。
参考文献
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