全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·933·
RP-HPLC同时测定护肝剂中 9种活性成分
刘宏胜 1,王树森 1*,张雅敏 2,刘子荣 2,赵晨翔 2
1. 天津市第一中心医院 卫生部危重病急救医学重点实验室,天津 300192
2. 天津市第一中心医院 肝胆外科,天津 300192
摘 要:目的 建立 RP-HPLC法同时测定护肝剂中马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙
素、五味子丙素和熊果酸 9种中药活性成分,为护肝剂的制剂质量提供保障。方法 采用安捷伦 Zorbax SB-C18(150 mm×4.6
mm,5 μm)色谱柱;流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,体积流量 1.0 mL/min;紫外检测波长为 236、280、210 nm;
柱温 30 ℃;进样量为 5 μL。结果 马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素
和熊果酸的最低检测限分别为 12.0、2.60、5.75、9.75、14.39、19.06、14.90、15.63、16.08 ng;线性范围分别为 583.33~18.229、
916.67~28.65、541.67~16.93、416.67~13.02、500.00~15.63、458.33~14.32、625.00~19.53、458.33~14.32、1 000.00~
31.25 mg/L;平均加样回收率分别为 103.51%、104.19%、95.16%、96.71%、105.61%、96.12%、97.09%、96.87%、105.90%;
精密度 RSD 分别为 1.25%、1.31%、1.91%、1.88%、1.95%、1.45%、1.66%、1.52%、1.33%;重复性 RSD 分别为 1.39%、
1.41%、1.87%、1.91%、1.79%、1.45%、1.32%、1.71%、1.49%;稳定性 RSD分别为 1.36%、1.22%、1.87%、1.91%、1.93%、
1.56%、1.39%、1.78%、1.61%。6 批护肝剂中含马钱素、熊果酸、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五味子甲素、乙
素及丙素的平均质量浓度分别在 216.5~222.5、40.8~42.8、125.4~136.3、144.0~147.3、1 640.8~1 947.3、497.5~515.0、
15.0~17.3、33.6~36.0、3.0~3.9 mg/L。结论 该方法简便、灵敏度高、重复性好、平均回收率高,是检测护肝剂中马钱素、
芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和熊果酸的可信方法。
关键词:护肝剂;RP-HPLC;马钱素;芍药苷;野黄芩苷;黄芩苷;黄芩素;五味子甲素;五味子乙素;五味子丙素;熊
果酸;山茱萸;黄芩;五味子;白芍
中图分类号:R286.02 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2016)06 - 0933 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.013
Simultaneous determination of nine kinds of active components in Hugan Agent
by RP-HPLC
LIU Hong-sheng1, WANG Shu-sen1, ZHANG Ya-min2, LIU Zi-rong2, ZHAO Chen-xiang2
1. Key Laboratory of Emergency Medicine of Critical Disease of Healthful Ministry in First Central Hospital, Tianjin 300192,
China
2. Department of Hepatobiliary Surgery, First Central Hospital, Tianjin 300192, China
Abstract: Objective To establish an RP-HPLC method for simultaneous determining the contents of nine kinds of components in
Hugan Agent such as loganin, paeonflorin, scuteuarin, baicalin, baicalein, deoxyschizandrin, schisandrin, schizandrin C, and ursolic
acid, and to provide the quality guarantee for it. Methods Agilent Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) column was used.
Acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water-solution were used as mobile phase of gradient elution, and the volume flow was at 1.0
mL/min; Ultraviolent determination wavelength was 236, 280, and 210 nm; Column temperature was at 30 ℃, and injection volume
was 5 μL. Results The lowest detection limit in loganin, paeonflorin, scuteuarin, baicalin, baicalein, deoxyschizandrin, schisandrin,
schizandrin C, and ursolic acid respectively was 12.0, 2.60, 5.75, 9.75, 14.39, 19.06, 14.90, 15.63, and 16.08 ng; The linear range was
583.33—18.229, 916.67—28.65, 541.67—16.93, 416.67—13.02, 500.00—15.63, 458.33—14.32, 625.00—19.53, 458.33—14.32, and
1 000.00—31.25 mg/L, respectively; The average recovery in Hugan Agent was 103.51%, 104.19%, 95.16%, 96.71%, 105.61%,
96.12%, 97.09%, 96.87%, and 105.90%, respectively; The repeatability RSD was 1.39%,1.41%, 1.87%, 1.91%, 1.79%, 1.45%, 1.32%,
收稿日期:2015-11-04
基金项目:天津市应用基础与前沿技术研究计划(14JCYBJC24800)
作者简介:刘宏胜,女,硕士。E-mail: lhswmg@sina.com
*通信作者 王树森,男,博士。
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1.71%, and 1.49%, respectively; The stability RSD was 1.36%, 1.22%, 1.87%, 1.91%, 1.93%, 1.56%, 1.39%, 1.78%, and 1.61%,
respectively. 6 batche of Hugan Agent contained the average quality of loganin, ursolic acid, paeonflorin, scuteuarin, baicalin,
baicalein deoxyschizandrin, schisandrin, and schizandrin respectively was 216.5—222.5, 40.8—42.8, 125.4—136.3, 144.0—147.3,
1 640.8—1 947.3, 497.5—515.0, 15.0—17.3, 33.6—36.0, and 3.0—3.9 mg/L. Conclusion The method is believable for determining
the concent of loganin, paeonflorin, scuteuarin, baicalin, baicalein, deoxyschizandrin, schisandrin, schizandrin C, and ursolic acid in
Hugan Agent with its simplicity, sensibility, repeatability, and better recovery rate.
Key words: Hugan Agent; RP-HPLC; loganin; paeonflorin; scuteuarin; baicalin; baicalein; deoxyschizandrin; schisandrin; schizandrin
C; ursolic acid; Corni Fructus; Scutellariae Radix; Schisandrae Fructus; Paeoniae Alba Radix
当今,肝脏疾病是严重威胁人类健康的一大类
疾病,包括各种原因导致的肝炎、肝纤维化、肝硬
化和肝癌。虽然肝脏是唯一具有自身强大再生能力
的器官[1-2],但是相对于慢性肝炎、高脂饮食和酒精
滥用引起的慢性损伤而言,这种肝细胞的自我修复
能力是远远不够的。本课题组根据中医的藏象学说
理论及临床药理学观察,以山茱萸、白芍、黄芩、
五味子等药材制成护肝剂,并观察该制剂在治疗伴
有肝脏炎症、纤维化、损伤等基础肝病时对肝脏的
保护与再生作用。
五味子甲、乙、丙素是五味子的主要活性成分,
具有增强肝的解毒功能,增强肝细胞色素 P450 活
性、并能促进肝蛋白质和糖原的生物合成,五味子
乙素还能降低血清谷氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨
酸转氨酶(AST),可见五味子甲、乙、丙素对肝脏
具有保护作用[3-4]。马钱素、熊果酸是山茱萸的主要
活性成分,具有较好的抗氧化能力,可降低肝、脑
组织的过氧化脂质水平,清除氧自由基。芍药苷是
白芍中的主要活性成分,能明显对抗四氯化碳所致
的小鼠肝损伤后血清丙氨酸转氨酶升高及血清白蛋
白下降和肝糖原水平下降的改善和恢复。野黄芩苷、
黄芩苷与黄芩素是黄芩中的主要活性成分,黄芩苷
及黄芩素可通过多种环节影响花生四烯酸代谢,不
同程度地抑制前列腺素 E(PGE)和白三烯(LT)
等炎性介质的生成,起到抗炎的功效;此外,黄芩
苷与黄芩素还具有抗毒素、解热、保肝、利胆、调
脂及免疫抑制作用等。野黄芩苷具有抑制肿瘤细胞
活性,抗血小板聚集,降低脑血管阻力,改善脑血
循环等功效,与黄芩苷、黄芩素协同发挥对抗肝纤
维化、肝损伤的药理作用[5-7]。本实验采用 RP-HPLC
法检测护肝剂中马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄芩
苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙
素和熊果酸,为评价护肝剂的质量提供依据。
1 仪器与材料
Agilent 1260型高效液相色谱仪,包括四元泵,
G1311C、自动进样器,G1329B、VWD 检测器,
G1314F、色谱工作站,安捷伦科技有限公司;AE240
精密电子分析天平,梅特勒-上海托利多仪器;超纯
水器,法国Millipore公司;万能粉碎机,北京中兴
伟业仪器有限公司制造;DZKW-4电子恒温水浴锅,
北京中兴伟业仪器有限公司;超声提取器,宁波新
艺生物科技股份有限公司;电热鼓风干燥箱,天津
市三水科学仪器有限公司。
对照品马钱素(批号 20150112)、芍药苷(批
号 20141205)、野黄芩苷(批号 20150306)、黄芩苷
(批号 20150129)、黄芩素(批号 20150415)、五味
子甲素(批号 20141204)、五味子乙素(批号
20150430)、五味子丙素(批号 20150506)和熊果
酸(批号 20150727)均购自南昌品正商贸有限公司,
质量分数均≥99.9%。乙腈(色谱纯),德国 Merck
公司;磷酸(色谱纯),天津市光复精细化工研究所;
乙醇(色谱纯),天津市北联精细化学品开发有限公
司;实验用水为二次纯化水,天津市第一中心医院
药厂提供。山茱萸药材(产品批号 131203)、黄芩
药材(产品批号 131129)、白芍药材(产品批号
140130)、五味子药材(产品批号 140113),中国安
国市昌达中药材饮片有限公司,经天津中医药大学
李天祥副教授鉴定,分别为毛茛科植物芍药Paeonia
lactiflora Pall. 干燥根、唇形科植物黄芩 Scutellaria
baicalensis Georgi 的干燥根、木兰科植物五味子
Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. 的干燥成熟果
实、山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb. et
Zucc. 的干燥成熟果肉。护肝剂样品(液体制剂,
由白芍、黄芩、山茱萸、五味子等药材制备而成),
天津市第一中心医院重点实验室自行研制,批号分
别为 20150512、20150605、20150709、20150729、
20150806、20150831。
2 方法与结果
2.1 护肝剂的处理
2.1.1 护肝剂供试品溶液的制备 取护肝剂 1 mL
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·935·
置于 PE管中,水浴蒸干,加入 85%乙醇 1 mL,称
质量,在 250 W、40 kHz、30 ℃条件下超声提取
30 min,用 85%乙醇填补损失的质量。滤液过 0.22
μm微孔滤膜,进样 5 μL。
2.1.2 护肝剂缺黄芩的阴性对照溶液的制备 按护
肝剂的制备方法制得除黄芩的护肝剂,取 1 mL置
于 PE管中,水浴蒸干,其余操作同“2.1.1”项。
2.1.3 护肝剂缺五味子的阴性对照溶液的制备 按
护肝剂的制备方法制得除五味子的护肝剂,取 1 mL
置于 PE管中,水浴蒸干,其余操作同“2.1.1”项。
2.1.4 护肝剂缺白芍的阴性对照溶液的制备 按护
肝剂的制备方法制得除白芍的护肝剂,取 1 mL置
于 PE管中,水浴蒸干,其余操作同“2.1.1”项。
2.1.5 护肝剂缺山茱萸的阴性对照溶液的制备 按
护肝剂的制备方法制得除山茱萸的护肝剂,取 1 mL
置于 PE管中,水浴蒸干,其余操作同“2.1.1”项。
2.2 色谱条件
色谱柱为 Zorbax SB-C18柱(150 mm×4.6 mm,
5 μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱:
0~15 min,14%~16.5%乙腈;15~17.5 min,
16.5%~21.5%乙腈;17.5~33 min,21.5%~33%乙
腈;33~55 min,33%~43%乙腈;55~63 min,
43%~53%乙腈;63~103 min,53%~63%乙腈;
103~128 min,63%~73%乙腈;分段变波长测定:
0~13.5 min 为 236 nm,检测马钱素和芍药苷,
13.6~40 min为 280 nm,检测野黄芩苷、黄芩苷和
黄芩素,40.1~120 min为 210 nm,检测五味子甲、
乙、丙素和熊果酸;体积流量 1.0 mL/min;柱温
30 ℃;进样量 5 μL。
2.3 线性关系考察
分别精密称取马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄
芩苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味子
丙素和熊果酸对照品 1.4、2.2、1.3、1.0、1.2、1.1、
1.5、1.1、2.4 mg,配成 1.2 mL的混合对照品乙醇
溶液,并进行倍比稀释,得到马钱素的质量浓度分
别为 1 166.67、583.33、291.68、145.83、72.92、36.46、
18.23 mg/L;芍药苷的质量浓度分别为 1 833.33、
916.67、458.33、229.17、114.58、57.30、28.65 mg/L;
野黄芩苷的质量浓度分别为 1 088.33、541.67、
270.83、135.42、67.71、33.85、16.93 mg/L;黄芩
苷的质量浓度分别为 833.33、416.67、208.33、
104.17、52.08、26.04、13.02 mg/L;黄芩素的质量
浓度分别为 1 000、500、250、125、62.5、31.25、
15.63 mg/L;五味子甲素的质量浓度分别为 916.67、
458.33、229.17、114.58、57.29、28.65、14.32 mg/L;
五味子乙素的质量浓度分别为 1 250、625、312.5、
156.25、78.13、39.06、19.53 mg/L;五味子丙素的
质量浓度分别为 916.67、458.33、229.17、114.58、
57.29、28.65、14.32 mg/L和熊果酸的质量浓度分别
为 2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 mg/L,
取后 6个质量浓度对照品溶液作标准曲线。各质量
浓度溶液分别过 0.22 μm微孔滤膜后进样 5 μL进行
色谱分析。以峰面积积分值(A)对质量浓度(C)
进行线性回归,得各成分的回归方程、相关系数(r)
及线性范围分别为马钱素 A=5.448 C+21.385,r=
0.999 9,583.33~18.229 mg/L;芍药苷 A=5.480 C+
46.340,r=0.999 8,916.67~28.65 mg/L;野黄芩
苷 A=8.324 C-89.711,r=0.999 5,541.67~16.93
mg/L;黄芩苷 A=13.723 C-43.907,r=0.999 8,
416.67~ 13.02 mg/L;黄芩素 A= 26.086 C+
121.917,r=0.999 9,500.00~15.63 mg/L;五味子
甲素 A=31.765 C+130.080,r=0.999 9,458.33~
14.32 mg/L;五味子乙素 A=26.478 C+149.704,
r=0.999 9,625.00~19.53 mg/L;五味子丙素 A=
26.561 C+118.140,r=0.999 8,458.33~14.32
mg/L;熊果酸 A=2.368 C+34.567,r=0.999 9,
1 000.00~31.25 mg/L。
在给出的仪器条件下,根据信噪比(S/N)为 3
求得各个成分的最低检测限分别为马钱素 12.0 ng、
芍药苷 2.60 ng、野黄芩苷 5.75 ng、黄芩苷 9.75 ng、
黄芩素 14.39 ng、五味子甲素 19.06 ng、五味子乙素
14.90 ng、五味子丙素 15.63 ng、熊果酸 16.08 ng。
2.4 色谱分离
分别对供试品中的马钱素、芍药苷、野黄芩苷、
黄芩苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味
子丙素和熊果酸进行色谱分离,结果见图 1。可见,
各组分的分离均能达到基线分离,峰形对称,分离
度好,且无明显杂质峰干扰。马钱素的保留时间为
4.43 min,芍药苷的保留时间为 7.39 min,野黄芩苷
的保留时间为 15.01 min,黄芩苷的保留时间为
24.12 min,黄芩素的保留时间为 34.94 min,五味子
甲素的保留时间为 81.58 min,五味子乙素的保留时
间为 90.03 min,五味子丙素的保留时间为 95.80
min,熊果酸的保留时间为 107.76 min。分别做供试
样品阴性对照试验,结果见图 1。可见,没有相应
的干扰色谱峰出现。
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1-马钱素 2-芍药苷 3-野黄芩苷 4-黄芩苷 5-黄芩素 6-五味子甲素 7-五味子乙素 8-五味子丙素 9-熊果酸
1-loganin 2-paeonflorin 3-scuteuarin 4-baicalin 5-baicalein 6-deoxyschizandrin 7-schisandrin 8-schizandrin C 9-ursolic acid
图 1 混合对照品 (A)、护肝剂样品 (B) 及缺芍药 (C)、缺山茱萸 (D)、缺黄芩 (E) 和缺五味子 (F) 护肝剂阴性对照的
HPLC图
Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A), Hugan Agent (B), and Hugan Agent negative control without Paeoniae Alba
Radix (C), Corni Fructus (D), Scutellariae Radix (E), or Schisandrae Fructus (F)
2.5 精密度试验
取含马钱素 72.92 mg/L、芍药苷 114.58 mg/L、
野黄芩苷 67.71 mg/L、黄芩苷 52.03 mg/L、黄芩素
62.50 mg/L、五味子甲素 57.29 mg/L、五味子乙素
78.13 mg/L、五味子丙素57.29 mg/L和熊果酸125.00
mg/L的混合对照品溶液,连续进样 6次,结果马钱
素、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五味子
甲素、五味子乙素、五味子丙素和熊果酸峰面积的
RSD分别为 1.25%、1.31%、1.91%、1.88%、1.95%、
1.45%、1.66%、1.52%、1.33%。
2.6 稳定性试验
取同 6批护肝剂(批号 20150831),按“2.1.1”
项方法处理后,分别在 0、4、8、12、24、48 h进
样测定,结果马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、
黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和
熊果酸峰面积的 RSD分别为 1.36%、1.22%、1.87%、
1.91%、1.93%、1.56%、1.39%、1.78%、1.61%,表
明供试品溶液在 48 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同一批护肝剂(批号 20150831),按“2.1.1”
项方法平行制备 6份供试品溶液,进样测定,结果
马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五
味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和熊果酸的
RSD分别为 1.39%、1.41%、1.87%、1.91%、1.79%、
1.45%、1.32%、1.71%、1.49%。
2.8 加样回收率试验
取已测定的护肝剂(批号 20150831)1 mL,平
行 9份,分为 3组,分别加入 0.1 mL混合对照品溶
液(马钱素质量浓度 287.70、143.85、71.93 mg/L,
芍药苷 256.50、128.25、64.13 mg/L,野黄芩苷
325.50、162.75、81.38 mg/L,黄芩苷 400.00、200.00、
100.00 mg/L,黄芩素 390.90、195.25、97.63 mg/L,
五味子甲素 365.50、182.75、91.34 mg/L,五味子乙
素 350.00、175.00、87.50 mg/L,五味子丙素 415.50、
207.75、103.88 mg/L和熊果酸 380.50、190.25、95.13
mg/L),按照“2.1.1”项方法处理后按“2.2”项色
谱条件分析。结果马钱素、芍药苷、野黄芩苷、黄
芩苷、黄芩素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙
素和熊果酸的平均回收率分别为 103.51%、104.19%、
95.16%、96.71%、105.61%、96.12%、97.092%、96.87%、
105.90%,RSD分别为 1.79%、1.57%、1.91%、1.85%、
1.77%、1.51%、1.64%、1.39%、1.47%。
2.9 样品测定
取 6批护肝剂样品各 1 mL,按“2.1.1”项方法
4
A B
C D
E F
1 2
3
5
6 7
8
9
1
2
3
4 5
9 8
6 7
9
5
1
4
3 3 2 6 7 8
2
1
6
4 5
8 6 7
7 8 9 2
1 3
4
5
9
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
t/min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·937·
处理后,按“2.2”项色谱条件进行测定,结果见表
1。可知 6批护肝剂中含马钱素、熊果酸、芍药苷、
野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、五味子甲素、乙素及
丙素的平均质量浓度分别在 216.5~222.5、40.8~
42.8、125.4~136.3、144.0~147.3、1 640.8~1 947.3、
497.5~515.0、15.0~17.3、33.6~36.0、3.0~3.9 mg/L。
表 1 样品测定结果
Table 1 Determination of samples
批号
质量浓度/(mg·L−1)
马钱素 芍药苷 野黄芩苷 黄芩苷 黄芩素 五味子甲素 五味子乙素 五味子丙素 熊果酸
20150512 216.5 125.4 145.0 1 942.5 497.5 16.3 33.8 3.6 42.5
20150605 222.5 136.3 147.3 1 947.3 489.0 15.0 34.4 3.0 41.3
20150709 221.8 135.3 144.3 1 640.8 515.0 17.3 35.9 3.1 40.8
20150729 218.8 124.5 147.5 1 897.3 477.5 16.3 33.6 3.9 42.8
20150806 220.0 124.5 144.0 1 756.5 514.0 16.1 36.0 3.4 41.5
20150831 221.3 133.6 145.8 1 872.3 514.5 16.0 35.8 3.8 42.3
3 讨论
肝脏炎症、纤维化等慢性损伤会严重影响肝脏
的功能及再生能力,进而影响临床肝癌的治疗效果。
可见,探讨、发现、研制对伴有基础肝病肝脏的保
护与再生作用的中药制剂是非常重要和有意义的。
护肝剂是根据中医理论整体观念、辨证论治和
临床长期良好的疗效拟定的组方。初期的动物实验
验证该方对刀豆蛋白(Con A)引起的肝损伤小鼠
具有很好的防治作用。该方起药效作用的主要活性
成分是山茱萸中的马钱素、熊果酸;黄芩中的野黄
芩苷、黄芩苷和黄芩素;芍药中的芍药苷及五味子
中的五味子甲、乙、丙素。因而,准确测定该方中
这 9种活性成分是保证制剂质量的关键所在。
通过对这 9 种活性成分进行紫外可变波长扫
描,发现马钱素和芍药苷在 236 nm 均有较大的吸
收;黄芩苷、野黄芩苷和黄芩素在 280 nm 有较大
的吸收;五味子甲、乙、丙素及熊果酸在 210 nm
均有较大的吸收。因而,将 236、280、210 nm 作
为这 9种成分的检测波长。
野黄芩苷本身显弱酸性,芍药苷在酸性环境中
稳定,因而,选择 0.1%磷酸水和洗脱能力较强的
乙腈作为流动相。黄芩苷的溶解性比较特殊,几乎
不溶于水,微溶于甲醇、乙醇中。而且,黄芩药材
中含有的内源酶会将黄芩苷降解为黄芩素,尤其在
温度 40~60 ℃时降解力最强,1 h可将黄芩苷降解
完全[5]。因此,本研究将超声提取药材成分的温度
设置为 30 ℃,以防黄芩苷的降解。同时,在此色
谱条件下采用梯度洗脱,其他活性成分也得到很好
的分离,且峰形对称性好、方法简便快速、回收率
较高。该方法既保证了护肝剂的质量,又为以此 9
种单体成分为质量检测指标的其他制剂提供了检
测方法。
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