全 文 ：·386· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 3 期 2014 年 2 月

绿原酸对光老化 ESF-1 细胞 ERK 信号通路的调控研究
王业秋，陈巧云*，李建民，张 宁
黑龙江中医药大学，黑龙江 佳木斯 154007
摘 要：目的 探讨绿原酸对光老化人皮肤成纤维细胞 ESF-1 光损伤的保护作用，及其对细胞外调节蛋白激酶（ERK）信
号通路的影响。方法 用 20 J/cm2的长波紫外线（UVA）照射 ESF-1 细胞制备光老化模型，以不同浓度绿原酸处理光老化细
胞，检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）量，RT-PCR 法检测细胞
中 ERK1、ERK2、基质金属蛋白酶 1（MMP-1）及基质金属蛋白酶抑制因子 1（TIMP-1） mRNA 的表达量，Western blotting
法检测 p-ERK1/2 蛋白的表达，酶联免疫法检测细胞上清液中 MMP-1、TIMP-1 的量。结果 UVA 照射 ESF-1 细胞后，SOD
活性、GSH-Px 活性、TIMP-1 mRNA 的表达量、TIMP-1 的量明显降低，MDA 水平、ERK1、ERK2、MMP-1 mRNA 的表达
量、p-ERK1/2、MMP-1 水平明显升高（P＜0.01）；10.0、1.0 μmol/L 绿原酸能够显著改善光老化 ESF-1 细胞的损伤（P＜0.05、
0.01）。结论 绿原酸调控光老化 ESF-1 细胞 ERK 信号通路，从而减轻 UVA 对 ESF-1 细胞的损伤。
关键词：绿原酸；ESF-1 细胞；长波紫外线；光老化；细胞外调节蛋白激酶信号通路
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0386 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.016
Regulation of chlorogenic acid on ERK signal pathway in photoaging ESF-1 cells
WANG Ye-qiu, CHEN Qiao-yun, LI Jian-min, ZHANG Ning
Heilongjiang University of Chinese Medicine, Jiamusi 154007, China
Abstract: Objective To investigate the regulation of chlorogenic acid on ERK signal pathway and the protection of chlorogenic
acid on photoaging ESF-1 cells. Methods The model of photoaging ESF-1 was established by irradiating of ultraviolet light (20
J/cm2). The chlorogenic acid at different concentration was used for photoaging cell. The SOD and GSH-Px activities, and MDA
content were assayed by hydroxylamine, colorimetric and TBA method, respectively. The mRNA expression levels of ERK1,
ERK2, MMP-1, and TIMP-1 were determined by RT-PCR, the protein expression of p-ERK1/2 was determined by Western
blotting assay and the secretion levels of MMP-1 and TIMP-1 of cultured ESF-1 cells were detected by ELISA. Results After the
UVA irradiation, the activities of SOD and GSH-Px, the mRNA expression level of TIMP-1, and the content of TIMP-1 were
decreased, the contents of MDA, p-ERK1/2 and MMP-1, the mRNA expression levels of ERK1, ERK2, and MMP-1 were
increased (P < 0.01). The above changes were inhibited by 10.0 and 1.0 μmol/L chlorogenic acid to improve the injury of ESF-1
cells (P < 0.05 , 0.01). Conclusion The chlorogenic acid could regulate ERK signal pathway and inhibit the injury of ESF-1 cells
by UVA.
Key words: chlorogenic acid; ESF-1 cells; UVA; photoaging; ERK signal pathway

日光中的长波紫外线（UVA，320～400 nm）
是引起皮肤光老化的最主要环境因素之一，UVA 穿
透力强，直接损伤真皮层中的成纤维细胞，导致成
纤维细胞的过早衰老，胶原合成能力下降，基质金
属蛋白酶（MMPs）表达升高，细胞外基质降解，胶
原降解与合成的平衡被打破，形成了光老化特征[1]。
国内外进行了大量抗光老化的研究，但至今尚未找
到确切的抗光老化方法。中药以其独特的优势，在
抗皮肤光老化领域的研究工作得到广泛开展。杜仲
为杜仲科植物杜仲 Euconunia ulmides Oliv. 干燥茎

收稿日期：2013-07-22
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81274035）；黑龙江省青年科学基金资助项目（QC2010085）；黑龙江省中医药管理局科研基金项目
（ZHY12-W012）；黑龙江中医药大学创新人才支持计划项目
作者简介：王业秋（1979—），男，讲师，从事中药抗光损伤研究。Tel: (0454)6103261 E-mail: wyq8119@163.com
*通信作者 陈巧云 Tel: (0454)6050350 E-mail: chenqy0114@163.com
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皮，在我国药用历史悠久，《神农本草经》将其列为
上品，杜仲传统以干燥树皮入药，是名贵滋补药材，
具有补中益气、强筋骨、强志、安胎，有久服轻身
耐老之功效[2-3]。现代药理学研究表明杜仲具有抗菌、
抗病毒、抗氧化、清除自由基、降血压等作用[4]。本
课题组前期研究发现杜仲提取物具有很好的抗光老
化效果，其药效物质可能是绿原酸[5-6]。本实验以绿
原酸为研究对象，考察绿原酸对光老化人皮肤成纤
维细胞 ESF-1 细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通
路的调控作用，探讨其抗 ESF-1 细胞光老化的作用
机制，为绿原酸及杜仲的进一步开发和应用提供理
论依据。
1 材料
1.1 细胞
人皮肤成纤维细胞 ESF-1，来源于中国医学科
学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院细胞
资源中心。
1.2 试剂
DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗
（Thermo Fisher 公司），超氧化物歧化酶（SOD）试
剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、丙
二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程公司），
TRIzol（Invitrogen 公司），第一链 cDNA 合成试剂
盒、PCR 扩增试剂盒、目的基因及内参引物、琼脂
糖、丙烯酰胺、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺、SDS、Tris
[生工生物工程（上海）有限公司]，Western 及 IP 细
胞裂解液、PMSF、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1.5
mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、TEMED、SDS-PAGE 蛋白
上样缓冲液（5×）、超敏 ECL 化学发光试剂盒、显
影定影试剂盒、PVDF 膜（碧云天生物技术研究所），
磷酸化丝裂原活化蛋白激酶1/2抗体、β-actin抗体（内
参抗体）、羊抗兔 IgG（北京博奥森生物技术有限公
司），基质金属蛋白酶 1（MMP-1）ELISA 试剂盒、
基质金属蛋白酶抑制因子 1（TIMP-1）ELISA 试剂
盒（上海研吉生物科技有限公司），绿原酸对照品（质
量分数≥98%，上海锐谷生物科技有限公司）。
1.3 仪器
紫外照射仪（Sigma 公司），紫外线辐照计（北
京师范大学光电仪器厂），Resecarch UV UF 型超纯
水制备系统（上海和泰仪器有限公司），IX—71—
21PH 型 Olympus 倒置显微镜（日本 Olympus 株式会
社），HF90 型二氧化碳培养箱（上海智城分析仪器有
限公司），MS—500A 半自动生化分析仪（美生科技
有限公司），MK3 酶标仪（美国热电公司），TGL—
16G—C 型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），
Tprofessional 型 PCR 扩增仪（德国 Biometra 公司），
DYY—10C 型电泳仪电源、DYCP—31DN 型水平电
泳仪、DYCZ—24DN 型电泳仪、DYCZ—40B 型转
印电泳仪（北京市六一仪器厂），Champ Gel5000 型
凝胶成像系统（北京赛智创业有限公司）。
2 方法
2.1 药物配制
通过预试验发现绿原酸浓度大于 10 μmol/L 时
对 ESF-1 细胞产生毒性，所以本实验将绿原酸加入
DMEM 培养液中，配制成高、中、低（10.0、1.0、
0.1 μmol/L）3 个浓度，调 pH 值为 7.0，0.22 μm 微
孔滤膜滤过除菌。
2.2 ESF-1 细胞的体外培养
ESF-1 细胞在含有 10%胎牛血清的 DMEM 培
养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
取对数生长期细胞以胰酶消化，调整其密度为 1×
106/mL 接种于 6 孔板、5×104/mL 接种于 96 孔板。
2.3 细胞光老化模型的制备
96 孔和 6 孔板细胞继续培养 24 h，参考文献方
法[7]，使用 20 J/cm2 的 UVA 照射细胞，对照组用铝
箔盖住细胞，建立细胞光老化模型。紫外线照射剂
量（J/cm2）＝照射强度（W/cm2）×照射时间（s），
紫外线辐照计测量照射强度为 8.33 mW/cm2，照射
时间为 2 400 s。
2.4 实验分组及药物处理
接种于孔板内的细胞随机分为对照组，模型
组，绿原酸高、中、低剂量组。对照组细胞给予
DMEM 培养液培养，模型组细胞给予 DMEM 培养
液培养 24 h 后，按照“2.3”项方法进行紫外线照
射，加入 DMEM 培养液继续培养，绿原酸高、中、
低剂量组细胞给予 DMEM 培养液培养 24 h 后，按
照“2.3”项方法进行紫外线照射，给予含不同浓
度（10.0、1.0、0.1 μmol/L）绿原酸的 DMEM 培
养液继续培养。
2.5 细胞中 SOD、GSH-Px 活性和 MDA 测定
给药 24 h 后收集 6 孔板中各组细胞，用冷 PBS
清洗 2 次，超声破碎，严格按照试剂盒说明书操作，
检测 SOD、GSH-Px 活性和 MDA 的量。
2.6 RT-PCR 法检测细胞中 ERK1、ERK2、MMP-1
及 TIMP-1 mRNA 表达
给药 24 h 后，使用 Trizol 分别提取 6 孔板中各
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组每孔细胞的总 RNA；以 RNA 为模板按照第一
链 cDNA 合成试剂盒操作说明书分别逆转录为
cDNA；以 cDNA 为模板进行 PCR 反应，以 β-actin
为内参，内参基因与目的基因同时扩增，各基因
的引物序列、产物长度及退火温度见表 1，反应
条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，退火
40 s，72 ℃延伸 40 s，35 个循环，72 ℃延伸 10
min；取扩增产物 4 μL 上样于 1.5%琼脂糖凝胶（含
0.5 mg/mL EB），100 V 电泳 30 min，将凝胶放入
凝胶成像系统摄像，荧光强度值即代表 DNA 样品
的相对量，与 β-actin 两两比较即得到各处理组的
比值。
表 1 RT-PCR 反应引物序列、产物长度及退火温度
Table 1 Primer sequences, products length, and annealing temperature of RT-PCR reaction
基因 引物序列 产物长度 / bp 退火温度 / ℃
ERK1 正向：5’-AGCAGGTTGGAGGGCTTTAGAT-3’
反向：5’-GGGAGGTGGAGATGGTGAAG-3’
442 56
ERK2 正向：5’-AAAAGCCACAACTACCAGAAAC-3’
反向：5’-ACCCACACAAGAGGATTGAAGT-3’
353 54
MMP-1 正向：5’-GGAAGGGCAAGGACTCTAT-3’
反向：5’-CAGGGTTTCAGCATCTGGT-3’
366 53
TIMP-1 正向：5’-GCTTCTGGCATCCTGTTGTTG-3’
反向：5’-ACTCCTCGCTGCGGTTGTG-3’
295 56
β-actin 正向：5’-GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’
反向：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’
160 同各目的基因

2.7 Western blotting 检测细胞中 p-ERK1/2 蛋白
表达
给药 24 h 后，弃去 6 孔板中培养液，用预冷
的 PBS 液洗涤 3 次，置冰上，加入 WIP 裂解液（含
PMSF 1 mmol/L）150 μL 裂解，4 ℃、12 000×g
离心，取上清，加入上样缓冲液，沸水煮 5 min，
然后进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳；采用湿转法
将蛋白转移至 PVDF 膜上；TBST 震荡洗涤 3 次；
用含 5%脱脂奶粉的 TBST 室温封闭 2 h；一抗封闭
4 ℃过夜；TBST 震荡洗涤 3 次；二抗封闭 2 h；
TBST 震荡洗涤 3 次；在暗室中，用滤纸将膜上液
体吸干，在 ECL 反应混合液中反应 5 min 后，压 X
光片，后显影，定影；放入凝胶成像系统对 X 光
片观察，照相，对条带进行定量分析，确定各蛋白
的表达量。
2.8 ELISA 法检测细胞上清液中 MMP-1 及
TIMP-1 水平
给药 24 h 后收集 96 孔板各组细胞的上清液，
严格按照 ELISA 试剂盒操作说明书检测 MMP-1 及
TIMP-1 水平。
2.9 数据处理
用 SPSS 13.0 软件对数据进行统计分析，数据
均以 ±x s 表示，多样本间的方差分析采用 LSD 法。
3 结果
3.1 绿原酸对 ESF-1 细胞中 SOD、GSH-Px 活性
和 MDA 量的影响
UVA 照射 ESF-1 细胞造成了氧化损伤，致使模
型组细胞中 SOD、GSH-Px 活性明显降低，MDA 的
量明显升高（P＜0.01）；而绿原酸各剂量组均能提
高 SOD、GSH-Px 活性，降低 MDA 的量，且 10.0、
1.0 μmol/L 剂量组与模型组相比，差异具有统计学
意义（P＜0.05、0.01）。结果见表 2。
3.2 绿原酸对ESF-1细胞中ERK1、ERK2、MMP-1
及 TIMP-1 mRNA 表达的影响
UVA 照射使 ESF-1 细胞中 ERK1、ERK2、
MMP-1 mRNA 的表达量明显升高，而 TIMP-1
mRNA 的表达量明显降低（P＜0.01）；绿原酸各剂
量组均能降低 ERK1、ERK2、MMP-1 mRNA 的表
达量，并提高 TIMP-1 mRNA 的表达量，且 10.0、
1.0 μmol/L 剂量组与模型组相比，差异具有统计学
意义（P＜0.05、0.01）。结果见图 1 及表 3。
3.3 绿原酸对ESF-1细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响
UVA 照射使 ESF-1 细胞中 p-ERK1/2 蛋白表达
明显升高（P＜0.01）；绿原酸各剂量组均能降低细
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 3 期 2014 年 2 月 ·389·

表 2 绿原酸对 ESF-1 细胞中 SOD、GSH-Px 活性和 MDA 量的影响 ( ± = 6x s , n )
Table 2 Effect of chlorogenic acid on SOD and GSH-Px activities and MDA content in ESF-1 cells ( ± = 6x s , n )
组别 C / (μmol·L−1) SOD / (U·mg−1) GSH-Px / (U·mg−1) MDA / (nmol·mg−1)
对照 — 44.752±4.753** 43.486±4.621** 3.245±0.362**
模型 — 21.115±2.254 23.972±2.293 5.829±0.561
绿原酸 0.1 22.534±2.319 25.097±2.438 5.778±0.562
1.0 35.091±3.348** 26.679±2.955* 4.936±0.425*
10.0 37.449±3.926** 38.176±3.732** 4.323±0.419**
与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs model group, same as below


图 1 各组 ESF-1 细胞中 ERK1、ERK2、MMP-1 及 TIMP-1 mRNA 表达的 RT-PCR 产物电泳图
Fig. 1 RT-PCR electrophorograms on mRNA expression of ERK1, ERK2, MMP-1, and TIMP-1 in ESF-1 cells of each group
表 3 绿原酸对 ESF-1 细胞中 ERK1、ERK2、MMP-1 及 TIMP-1 mRNA 表达的影响 ( ± = 6x s , n )
Table 3 Effect of chlorogenic acid on mRNA expression of ERK1, ERK2, MMP-1, and TIMP-1 in ESF-1 cells ( ± = 6x s , n )
组别 C / (μmol·L−1) ERK1 ERK2 MMP-1 TIMP-1
对照 — 0.314±0.032** 0.414±0.047** 0.203±0.021** 0.552±0.065**
模型 — 0.401±0.041 0.493±0.044 0.295±0.028 0.387±0.037
绿原酸 0.1 0.386±0.034 0.481±0.051 0.267±0.026 0.402±0.043
1.0 0.375±0.042* 0.467±0.042 0.251±0.022* 0.486±0.049*
10.0 0.338±0.037** 0.435±0.043* 0.213±0.024** 0.515±0.058**

胞中 p-ERK1/2 蛋白表达量，且 10.0、1.0 μmol/L 剂
量组与模型组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05、
0.01）。结果见图 2。
3.4 绿原酸对 ESF-1 细胞上清液中 MMP-1 及
TIMP-1 水平的影响
UVA 照射使 ESF-1 细胞上清液中 MMP-1 水平
明显升高，TIMP-1 水平明显降低（P＜0.01）；绿原
酸各剂量组均能降低上清液中 MMP-1 水平，提高
TIMP-1 水平，且 10.0、1.0 μmol/L 剂量组与模型组
相比，差异具有统计学意义（P＜0.05、0.01）。结
果见图 3。
4 讨论
正常情况下，细胞自身存在酶及非酶的抗氧化
防御机制，但在大剂量或长期 UV 作用下，活性氧



2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
ERK1
β-actin
ERK2
β-actin
Marker 对照 模型 0.1 1.0 10.0 Marker 对照 模型 0.1 1.0 10.0
绿原酸 / (μmol·L−1) 绿原酸 / (μmol·L−1)
MMP-1
β-actin
TIMP-1
β-actin
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
对照 模型 0.1 1.0 10.0 Marker Marker 对照 模型 0.1 1.0 10.0
绿原酸 / (μmol·L−1) 绿原酸 / (μmol·L−1)
·390· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 3 期 2014 年 2 月


图 2 绿原酸对 ESF-1 细胞 p-ERK1/2 蛋白表达的影响
Fig. 2 Effect of chlorogenic acid on protein expression of p-ERK1/2 in ESF-1 cells

图 3 绿原酸对 ESF-1 细胞上清液中 MMP-1 和 TIMP-1 水平的影响
Fig. 3 Effect of chlorogenic acid on MMP-1 and TIMP-1 levels in culture supernatant of ESF-1 cells
（ROS）的产生超过其被清除的速度，导致 SOD、
GSH-Px 活性下降，损伤的抗氧化防御体系会导致
更多 ROS 的产生，ROS 可直接攻击细胞膜脂质，
引发膜脂质过氧化链式反应产生 MDA，ROS 还可
作为第二信使，参与启动 UV 照射后的细胞内信
号传导，激活 ERK 信号传导通路，ERK 活化最终
可上调 c-jun 的基因表达，c-jun 蛋白和 c-fos 蛋白组
成的二聚体复合物 AP-1 刺激 MMPs 基因转录[8]。
MMPs 是一类含有锌离子、活性依赖于钙离子的
蛋白酶，具有广泛的生物学活性。皮肤中的胶原
纤维首先由 MMP-1 降解为小分子肽，然后被
MMP-3 及 MMP-9 进一步降解[9]。TIMPs 是 MMPs
天然的特异性内源性抑制剂，TIMP-1 为相对分子
质量 28 500 的分泌型糖蛋白，主要抑制 MMP-l、
MMP-3、MMP-7 及 MMP-9，TIMPs 与 MMPs 的
精密平衡在细胞外基质（ECM）的合成和降解中
发挥着重要作用，皮肤光老化是二者动态平衡失
调的结果。
本实验以 20 J/cm2 UVA 照射 ESF-1 细胞，细胞
内 SOD 和 GSH-Px 的活性下降，MDA 的量升高，
ERK1、ERK2 mRNA 和 p-ERK1/2 蛋白表达量升高，
MMP-1 mRNA 及蛋白表达量升高、TIMP-1 mRNA
及蛋白表达量降低，加入绿原酸处理后，上述指标
发生明显改变，在绿原酸的安全剂量范围内呈一定
的量效关系。光老化的ESF-1细胞在加入 1.0 μmol/L
绿原酸后可引起 MMP-1 明显降低（P＜0.05），而
TIMP-1 变化不明显，随浓度增大，加入 10.0 μmol/L
绿原酸后，TIMP-1 才明显增加（P＜0.05），提示绿
原酸对光老化 ESF-1 细胞的 MMP-1 影响较大。上
述结果表明，绿原酸可以明显拮抗 UVA 引起的抗
氧化酶活性的改变，清除氧自由基，抗脂质过氧化，
从而保护细胞免受氧化损伤；同时绿原酸可以抑制
ERK 信号传导通路中 ERK1、ERK2 mRNA 的转录
及 p-ERK1/2 的表达，抑制 MMP-1 的分泌，提高
TIMP-1 的分泌来拮抗光老化。
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p-ERK1/2
β-actin
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 对照 模型 0.1 1.0 10.0 对照 模型 0.1 1.0 10.0
绿原酸 / (μmol·L−1) 绿原酸 / (μmol·L−1)
p-
ER
K
1/
2
/ β
-a
ct
in

* ****

10
8
6
4
2
0
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
对照 模型 0.1 1.0 10.0 对照 模型 0.1 1.0 10.0
绿原酸 / (μmol·L−1) 绿原酸 / (μmol·L−1)
M
M
P-
1
/ (
ng
·m
L−
1 )

TI
M
P-
1
/ (
ng
·m
L−
1 )
*
**
*
**
**
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