全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·480·
• 药剂与工艺 •
绿原酸人工抗原的合成及多克隆抗体的制备
薛 瑾 2, 3，屈会化 1, 3*，孙 晔 2, 3，张 越 2, 3，王雪茜 2, 3，续洁琨 2, 3，赵 琰 2, 3*，王庆国 2, 3*
1. 北京中医药大学 科研实验中心，北京 100029
2. 北京中医药大学基础医学院，北京 100029
3. 北京中医药大学“经典方剂的应用基础研究”创新团队，北京 100029
摘 要：目的 合成绿原酸（chlorogenic acid，CHA）人工抗原，制备 CHA 多克隆抗体，为制备过敏成分分析的免疫芯片
奠定基础。方法 采用碳二亚胺法分别合成 CHA 免疫抗原（CHA-牛血清白蛋白）和包被抗原（CHA-卵清蛋白）；UV 法和
TLC 法鉴定人工抗原偶联是否成功；间接 ELISA 方法检测免疫小鼠血清中抗体效价；间接竞争 ELISA 方法检测抗体特异性。
结果 经 UV 法和 TLC 法检测，CHA 与 BSA 偶联成功。血清抗体效价为 1∶128 000，CHA-PAbs 的质量浓度与抑制率的线
性方程为 Y＝−0.10 lnX＋1.158，线性检测范围为 15.6～250 ng/mL，R2＝0.995，并且和甘草酸、黄芩苷等与其常配伍应用的
中药化合物均无交叉反应。结论 成功制备了灵敏度高、特应性好的 CHA 多克隆抗体，为 CHA 的微量检测和过敏性研究
提供了实验依据。
关键词：绿原酸；人工抗原；多克隆抗体；碳二亚胺法；免疫分析
中图分类号：R284.3 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)04 - 0480 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.04.006
Synthesis of artificial chlorogenic acid antigen and preparation of polyclonal
antibodies
XUE Jin 2, 3, QU Hui-hua1, 3, SUN Ye 2, 3, ZHANG Yue2, 3, WANG Xue-qian2, 3, XU Jie-kun2, 3, ZHAO Yan2, 3,
WANG Qing-guo2, 3
1. Center of Scientific Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
2. School of Preclinical Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
3. “Classical Prescription Application Foundation Research” Innovation Team, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing
100029, China
Abstract: Objective To synthesize artificial chlorogenic acid (CHA) antigen, to prepare CHA polyclonal antibody, and to lay the
foundation for the preparation of immune chip for allergic component analysis. Methods CHA-bovine serum albumin (CHA-BSA)
and CHA-ovalbumin (CHA-OVA) were synthesized by carbodiimide method. The characterization of the synthesis was examined by
UV spectrometry and TLC method. The titer and specificity of the antibody in serum of immunised mice were detected by indirect
enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) and indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (I-CELISA),
respectively. Results According to the UV and TLC determination, the CHA was successfully conjugated with BSA. The serum
antibody titer was 1∶128 000 with the linear range of 15.6—250 ng/mL, R2 = 0.995, and Y＝−0.10 lnX＋1.158. No cross-reaction
was detected with glycyrrhizic acid, parietic acid and so on, which were commonly used in the combination with CHA. Conclusion
The preparation of multi-clonal antibody with good sensitivity and specificity against CHA is successful, which provides a foundation
for the trace detection and allergy research of CHA.
Key words: chlorogenic acid; artificial antigen; polyclonal antibody; carbodiimide method; immune analysis

收稿日期：2013-10-11
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81274043，81373542）；“重大新药创制”国家专项课题（2010ZX09502-002）
作者简介：薛 瑾（1986—），女，江苏连云港人，在读博士，主要从事经典方剂的应用基础研究。E-mail: bingstea@163.com
*通信作者 屈会化（1966—），男，副研究员，博士，研究方向为中药免疫分析技术。Tel: (010)64286705 E-mail: quhuihua@gmail.com
赵 琰（1973—），女，研究员，博士，研究方向为中药免疫分析技术。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@gmail.com
王庆国（1952—），男，教授，博士，研究方向为经典方剂的现代应用与基础研究。
Tel: (010)64286727 E-mail: wangqg8558@sina.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·481·
绿原酸（chlorogenic acid，CHA）具有抗氧化、
抗炎、抗菌等多方面的药理作用[1-2]，是清开灵、热
毒宁、双黄连、鱼腥草、茵栀黄等中药注射剂中的
主要有效成分之一。但近年来，有学者认为 CHA 可
能是引起上述中药注射剂不良反应的主要原因[3]。
动物实验也证明，CHA 可以作为一种半抗原刺激小
鼠产生免疫应答并引发过敏反应[4]。为探讨 CHA 是
否与中药注射剂的临床过敏反应相关，本研究团队
提出了利用免疫芯片法分析确认中药注射剂过敏成
分的新思路[5]。免疫芯片法具有简洁快速、灵敏度
高、重复性好、检测容量大、前处理简单等特点，
不仅可用于过敏成分的追踪分析，也可用于研究复
方作用机制、物质基础、质量控制等方面，越来越
引起关注[6]。
免疫芯片制备的核心是获取相应的中药小分子
抗体，以及可特异性结合抗体的人工包被原。本实
验通过碳二亚胺法将 CHA 与牛血清白蛋白（BSA）
和卵清蛋白（OVA）偶联，得到 CHA 的免疫抗原
（CHA-BSA）和包被抗原（CHA-OVA），采用 UV
法和 TLC 法对合成的抗原进行了鉴定，并免疫
Balb/c 小鼠，制备出 CHA 多克隆抗体，为免疫芯片
法的建立奠定了基础。
1 材料
CHA 购自南京泽朗医药科技有限公司，质量分
数 95%（HPLC）；BSA（批号 29180102100）购自
美国 Genview 公司；卵清蛋白（OVA，批号
115K0730）购自北京欣经科生物技术有限公司；水
溶性碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl，批号 5003V09W）
购自阿法埃莎（天津）化学有限公司；弗氏完全佐
剂（FCA，批号 F5881）、弗氏不完全佐剂（FICA，
批号 F5506），购自美国 Sigma 公司；3, 3, 5, 5-四甲
基联苯胺（TMB，批号 0759），购自美国 Amresco
公司；酶标二抗（HRP-标记羊抗鼠 IgG，批号 RPN
4201），购自美国 GE Healthcare 公司；透析袋（截
留相对分子质量 8 000～14 000），北京索莱宝科技
有限公司。
SPF 级健康雌性 Balb/c 小鼠，8～10 周龄，购
自北京维通利华公司，动物许可证号：SCXK-（京）
2007-004，实验动物质量合格证号：No.0029729。
Beckman CoulterDU800 紫外可见分光光度计，
购自德国 Beckman 公司；Themo MK3 型酶联检测
仪，购自美国 Themo 公司；84—1A 磁力搅拌器，
购自上海司乐仪器有限公司。
2 方法与结果
2.1 人工免疫原和包被原的合成
2.1.1 免疫原的合成 称取 CHA 20 mg，EDC-HCl
12 mg，溶解于 2 mL PBS 中，称为 A 液。称取 BSA
20 mg 充分溶于 0.4 mL PBS 中，称为 B 液。将 A 液
逐滴加入 B 液中，并于反应体系中加入 4% NaHCO3
调 pH 值至 6.8，室温下（22 ℃）避光搅拌反应 4 h。
反应结束后用 pH 6.8 的 CBS 透析 48 h，每 6 小时
换液 1 次，得到 CHA-BSA。透析后的产物分装，
−20 ℃保存，待用。
2.1.2 包被抗原的合成 方法与人工抗原基本相
同。称取 CHA 10 mg，EDC-HCl 5 mg，溶解于 1 mL
PBS中，称为A液。称取OVA 10 mg溶于0.4 mL PBS
中，称为 B 液。然后将 A 液逐滴加入 B 液中。调
节 pH 值至 6.8，室温下（22 ℃）避光搅拌反应 4 h。
将制备好的免疫原用 pH 6.8 的 CBS 透析 48 h，每 6
小时换液 1 次，得到 CHA-OVA，4 ℃保存待测。
2.2 紫外扫描鉴定
配制适宜浓度的 CHA、BSA 与 OVA 标准溶液，
用紫外分光光度计在 190～700 nm 进行紫外扫描，
测出 CHA、BSA、OVA、CHA-BSA、CHA-OVA 的
全波长图谱及最大吸收波长处的吸光度（A）值。
图 1、2 为 CHA、BSA、OVA、CHA-BSA、CHA-
OVA 紫外分光光度计扫描结果。其中，CHA λmax＝
323.8 nm，BSA λmax＝278.5 nm。CHA-BSA、CHA-
OVA 与 BSA 在 λ＝（323.8±20.0）nm 光谱特征明
显不同，具有 CHA 和 BSA、OVA 叠加的特点。由
于合成产物经充分透析后完全排除了未结合蛋白的
CHA 小分子，根据 UV 吸收的叠加性原理可知，
CHA-BSA、CHA-OVA 的吸收光谱是 CHA 的吸收
光谱与 BSA、OVA 吸收光谱的整合，说明 CHA 已
经与载体蛋白偶联成功。
根据文献报道的方法[7]，以下列公式计算 CHA-
SA 的偶联率：Ca/Cb＝(ACHA-BSA 324 nm×KBSA 278 nm－
ACHA-BSA 278 nm×KBSA 324 nm) / (ACHA-BSA 278 nm×
KCHA 324 nm－ACHA-BSA 324 nm×KCHA 278 nm)，其中 K 为
吸光系数，C 为各物质的物质的量浓度，则 K＝A/C。
估算 BSA 与 CHA 偶联数目为 3.2∶1。
2.3 TLC 鉴定
TLC 法是鉴定人工抗原较为简捷的方法。按
《中国药典》2010 年版方法进行。用蒸馏水配制适
宜质量浓度的 CHA 对照品溶液和 BSA、OVA 标准
溶液，将已透析的 CHA-BSA、CHA-OVA 和未透析
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·482·



图 1 CHA、BSA 和 CHA-BSA 的 UV 全波长图谱
Fig. 1 Full wavelength UV spectra of CHA, BSA,
and CHA-BSA




图 2 CHA、OVA 和 CHA-OVA 的 UV 全波长图谱
Fig. 2 Full wavelength UV spectra of CHA, OVA,
and CHA-OVA

的 CHA-BSA 用蒸馏水稀释到适宜质量浓度。将 6
个样品分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以醋酸乙
酯-丙醇-甲酸-水（7∶3∶1∶1.2）为展开剂，展开
后晾干，用 10%硫酸-乙醇溶液显色，置紫外光灯
（365 nm）下检视。
图 3 为薄层色谱结果，可以看出 CHA 的 Rf 值
约为 0.68，并显现浅棕色斑点；BSA、OVA 的 Rf
为 0，停留于原点位置，也未显现浅棕色斑点；未
透析的 CHA-BSA 样品中包含偶联物、BSA 以及未
与 BSA 偶联的游离 CHA，故在原点及相应位置均
显色；已透析的 CHA-BSA、CHA-OVA 样品中已无
CHA，只含有偶联物及载体蛋白，故仅在原点位置
显现浅棕色斑点，该结果说明，CHA 与 BSA、OVA
的偶联是成功的。
2.4 抗体的制备
选用雌性 Balb/c 小鼠。首次免疫用无菌水稀释
适量的免疫抗原，与等量的弗氏完全佐剂充分混匀
乳化，免疫剂量 100 μg/只。采用背部皮下多点免疫


1-CHA 2-CHA-BSA（已透析） 3-CHA-BSA（未透析）
4-BSA 5-CHA-OVA（已透析） 6-OVA
1-CHA 2-CHA-BSA (dialyzed) 3-CHA-BSA (not dialyzed)
4-BSA 5-CHA-OVA (dialyzed) 6-OVA

图 3 CHA-BSA 和 CHA-OVA 的 TLC 图 (365 nm)
Fig. 3 TLC of CHA-BSA and CHA-OVA (365 nm)

动物（0.1 mL/只）。以后改用弗氏不完全佐剂乳化
抗原，每 14 天经 sc 加强免疫 1 次，免疫剂量相同。
从第 3 次免疫起，每次免疫 7 d 后小鼠尾静脉釆血，
分离血清，间接 ELISA 法测效价。在最后一次大量
采血前 2 d 再以相同剂量（不加佐剂）腹腔冲击免
疫１次[8-9]。采用饱和硫酸铵沉淀法对得到的血清进
行纯化[7]，获得纯化后的抗 CHA 特异性多克隆抗体
（polyclonal antibodies，PAbs）——CHA-PAbs。
2.5 CHA-PAbs 的效价测定
采用间接 ELISA 方法测定 CHA-PAbs 的效价。
以CHA-OVA作为包被原，用蒸馏水稀释至1 μg/mL，
在 96 孔板中每孔加入 100 μL，37 ℃温育 1 h，洗
板。每孔加脱脂奶粉 200 μL 封闭，37 ℃孵育 2 h，
洗板。将 CHA-PAbs 按倍比稀释成 1 000、2 000、
4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、
256 000 倍。每孔加入 100 μL，同时以小鼠免疫前
的阴性血清作对照，各设 3 个复孔。37 ℃温育 1 h，
洗板，每孔加入 100 μL HRP-羊抗鼠 IgG（1∶
10 000），37 ℃温育 30 min，洗板，每孔加 100 μL
TMB工作液，避光反应 15 min，2 mmol/L硫酸 50 μL
终止，测定 A490 值。以样品（P）与阴性血清（N）
A490 比值大于 2.1 时定义为阳性，CHA-PAbs 为阳性
的最大稀释倍数的倒数定义为 CHA-PAbs 的效价。
CHA-PAbs 的稀释倍数和 P/N 值见表 1。当 P/N
值≥2.1 时认为结果为阳性，可见 CHA-PAbs 的效
价为 1∶128 000。
1 2 3 4 5 6
A
2.5


1.6


0.7


−0.2
CHA-BSA
BSA CHA
213 274 334 395 455 516
λ / nm
3.4


2.5


1.6


0.7


−0.2
A
CHA-OVA
CHA
OVA
210 270 331 391 452 512
λ / nm
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·483·
表 1 间接 ELISA 法测定 CHA-PAbs 的效价
Table 1 Titer of CHA-PAbs determined by I-ELISA
稀释倍数 P/N 稀释倍数 P/N 稀释倍数 P/N
1 000 15.19 8 000 9.23 64 000 4.41
2 000 14.09 16 000 5.50 128 000 2.16
4 000 10.81 32 000 4.39 256 000 1.26

2.6 CHA-PAbs 的竞争抑制曲线
采用间接竞争ELISA方法测定CHA-PAbs的竞
争抑制曲线。酶标板包被、封闭后，将 1.000 μg/mL
的 CHA 对照品溶液用 PBS 倍比稀释为 8 个质量浓
度（7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000
ng/mL），每孔加 50 μL，对照孔给予 50 μL PBS。各
孔加入 50 μL 的 CHA-PAbs（1∶2 000）混合，其余
方法与间接 ELISA 基本一致。以对照孔的 A490 值为
A0，各质量浓度对应孔的 A490 值为 A；以 A/A0 值为
纵坐标（Y），相应的 CHA 质量浓度（X）的自然对
数为横坐标，绘制 CHA-PAbs 的竞争抑制曲线。
图 4 为 CHA 在 7.8～1 000 ng/mL 时 CHA-PAbs
的质量浓度与抑制率的线性关系曲线。计算得到线
性范围为 15.6～250 ng/mL，回归方程为 Y＝−0.10
lnX＋1.158，R2＝0.995。




图 4 CHA 质量浓度与抑制率的线性关系曲线
Fig. 4 Linear relationship curve of inhibitory rate and
CHA concentration

2.7 CHA-PAbs 的特异性检测
采取间接竞争 ELISA 的方法测定 CHA-PAbs
的特异性，方法同“2.5”项。选择甘草酸、大黄酸、
丹酚酸 B、胆酸、去氧胆酸、栀子苷、黄芩苷、葛
根素、芍药苷等常与金银花等含 CHA 中药配伍使
用的其他中药主要成分，将 9 种化合物倍比稀释成
一系列质量浓度梯度替代 CHA 稀释液。其他条件
相同，测定它们与 CHA-PAbs 之间的交叉反应。计
算各个化合物的 IC50（IC50 值定义为样品孔 A490 值
为对照孔 A490 值一半时对应的化合物的质量浓度）。
根据下列公式计算交叉反应率[10]。
交叉反应率＝CHA 标准品的 IC50 / 类似物 IC50
CHA-PAbs 与中药小分子的交叉反应率计算结
果见表 2，由此可知，CHA-PAbs 与常用中药的有
效成分间交叉反应率＜0.01%，均无交叉反应。

表 2 CHA-PAbs 与中药小分子的交叉反应率
Table 2 Cross-reaction rate of CHA-PAbs and
small molecule of Chinese medicines
化合物 交叉反应率 / % 化合物 交叉反应率 / %
CHA 100 丹酚酸 B ＜0.01
甘草酸 ＜0.01 黄芩苷 ＜0.01
胆酸 ＜0.01 芍药苷 ＜0.01
去氧胆酸 ＜0.01 栀子苷 ＜0.01
大黄酸 ＜0.01 葛根素 ＜0.01

3 讨论
当前，中药注射剂的安全性引起广泛关注[11-12]。
然而，中药注射剂中 99%以上为小分子化合物，其
中的致敏成分，极有可能是半抗原，需要在体内与
大分子结合成抗原才能引起变态反应[4]。同时，致
敏成分的结构、含量、来源等也有多种。因此，建
立从中药注射剂中分离过敏成分的方法，从中药注
射剂这一复杂多组分体系中分离寻找小分子半抗原
或致敏成分，进而建立相应的特异性诊断方法，是
中药注射剂乃至于全部中药复方新药研究过程中亟
需解决的一个重要的方法学问题。免疫芯片技术是
一种适合检测多组分抗原或半抗原的新技术[13]，适
合中药注射剂多组分体系小分子半抗原或致敏成分
的鉴定、判断及分离寻找，实现这一方法学的关键
是获取能与中药小分子成分特异性结合的人工抗体
与相应的包被原。
CHA 与清开灵、热毒宁、双黄连、鱼腥草、茵
栀黄等中药注射剂过敏反应与的关联性已引起人们
广泛的重视[14]。但 CHA 是小分子化合物，与蛋白
等大分子不同，不能直接包被于目前常用的芯片固
相载体上；CHA 也不具备免疫原性，需要与大分子
载体偶联后，才能作为免疫原制备抗血清及单克隆
抗体，以验证相关免疫芯片的稳定性、准确性和灵
敏度等。
CHA 分子结构中含有羧基基团。对于含羧基的
半抗原与载体的偶联方法包括混合酸酐法、活泼酯
法及碳二亚胺法等。本实验采用了碳二亚胺法，并
采用 TLC 法[15]和 UV 法进行了人工抗原的鉴定。
0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4
A
/ A
0
10 100 1 000
CHA / (ng·mL−1)
f
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月 ·484·
结果显示，CHA 成功偶联到 BSA 和 OVA 上，平均
偶联比为 3.2∶1，偶联比较低。CHA 是对光、湿不
稳定的化合物[16]，同时偶联比也受到 pH 值[17]、温
度[18]、浓度等多种因素的影响。因此，合成过程中
CHA 的结构可能发生了改变，进而影响了偶联比。
但有研究证明，连接过多的半抗原并不一定能得到
预期的免疫效果，半抗原与载体的偶联比存在最佳
范围[19]，这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多
时，可能不利于载体与淋巴细胞表面结合并引起免
疫反应。
本实验获得的多克隆抗体效价为 128 000，说明
CHA-BSA 有效的激活了小鼠的免疫应答，也从另
一方面说明偶联比等化学指标并不能很好地说明人
工抗原的免疫学特征。因此，评价人工抗原是否成
功关键在于其是否能够刺激机体产生抗体，以及抗
体的特异性。
本实验获得的抗 CHA 多克隆抗体，线性范围
为 15.6～250 ng/mL，灵敏度较高，并与甘草酸、大
黄酸、胆酸等中药小分子之间无交叉反应，也显示
出较好的特异性，从而为 CHA 免疫芯片的制备以
及 CHA 免疫分析方法的建立奠定了基础。
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