全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 14期 2016年 7月

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UFLC-MS法同时测定木瓜饮片中 8种有机酸
于 生，张 丽，单鸣秋，钱 岩，丁安伟*
南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，
江苏 南京 210023
摘 要：目的 建立同时快速测定木瓜饮片中莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸 8
种有机酸的超高速液相色谱-质谱（UFLC-MS）分析方法。方法 采用岛津 LC-20A快速液相系统，AB Sciex Qtrap 5500型
三重四级杆线性离子阱质谱仪，Poroshell 120色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相为 0.5%醋酸水溶液（A）-0.5%醋
酸甲醇溶液（B），梯度洗脱：0～5 min，10% A；5～13 min，10%～30% A；13～15 min，30%～95% A；15～25 min，95%
A；分析时间 25 min；体积流量 0.6 mL/min；柱温 30 ℃；进样量 2 μL。采用电喷雾离子源进行负离子模式检测，多反应监
测模式（MRM）用于定量分析，源喷射电压为−4 500 V，离子源温度为 550 ℃。结果 测定的 8种成分在线性范围内均具
有良好的线性关系（r≥0.999 2），平均回收率在 96.14%～101.20%。不同产地的木瓜饮片中 8种成分的量差异较大，其中，
柠檬酸、绿原酸、莽草酸的量较高，咖啡酸的量最低。结论 建立的测定方法重复性好，且快速、灵敏度高，可为木瓜饮片
的质量控制提供依据以及方法学支持。
关键词：木瓜；有机酸；快速液相色谱-质谱法；莽草酸；柠檬酸；原儿茶酸；绿原酸；咖啡酸；肉桂酸；齐墩果酸；熊果
酸；多反应监测
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)14 - 2465 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.012
Simultaneous determination of eight organic acids in Chaenomelis Fructus by
UFLC-MS
YU Sheng, ZHANG Li, SHAN Ming-qiu, QIAN Yan, DING An-wei
Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, and National and Local Collaborative
Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing University of
Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Abstract: Objective To establish an UFLC-MS method for simultaneous determination of eight active components (shikimic acid,
citric acid, protocatechuate, chlorogenic acid, caffeic acid, cinnamic acid, oleanolic acid, and ursolic acid). Methods Shimadzu
LC-20A system was used, equipped with AB Sciex Qtrap 5500. The analysis was performed on a Poroshell 120 column (100 mm× 4.6
mm, 2.7 μm). The eight components were separated in 25 min with gradient mobile phase consisting of 0.5% CH3COOH-H2O (A) and
0.5% CH3COOH-CH3OH (B): 0—5 min, 10% A; 5—13 min, 10%—30% A; 13—15 min, 30%—95% A; 15—25 min, 95% A. The
temperature of column was 30 ℃, and the injection volume was 2 μL. The multiple-reaction monitoring scanning (MRM) was
employed for the quantification with switching electrospray ion source polarity in negative mode. The ion spray voltage was set at −4
500 V and the turbo spray temperature was maintained at 550 ℃. Results The eight components had a good linearity (r ≥ 0.999 2)
within the linear ranges. The average recoveries were 96.14%—101.20%. The contents of the eight components in Chaenomelis
Fructus varied from the different habitats. The contents of shikimic acid, citric acid, and chlorogenic acid were high while the content
of caffeic acid was low. Conclusion The developed UFLC-MS method is simple, sensitive, and accurate and has the good
repeatability in separation, which is available for the quality control of Chaenomelis Fructus.

收稿日期：2016-02-22
基金项目：江苏省中药资源产业化过程协同创新中心项目（ZDXM-1-3）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（ysxk-2014）；江苏高校品牌专
业建设工程资助项目（PPZY2015A070）
作者简介：于 生（1980—），女，高级实验师，博士，主要从事中药炮制及饮片质量标准研究。Tel: (025)85811839 E-mail: yusheng1219@163.com
*通信作者 丁安伟（1950—），男，教授，博士生导师，主要从事中药炮制研究。Tel: (025)85811523 E-mail: awding105@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 14期 2016年 7月

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Key words: Chaenomelis Fructus; organic acids; UFLC-MS; shikimic acid; citric acid; protocatechuate; chlorogenic acid; caffeic
acid; cinnamic acid; oleanolic acid; ursolic acid; multiple-reaction monitoring scanning

木瓜为蔷薇科（Rosaceae）植物贴梗海棠
Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的干燥近成熟
果实，味酸性温，归肝、脾经，具有舒筋活络，和
胃化湿等功效，主要用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节
酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿[1]。
传统木瓜以“味酸”者为佳[2-3]，木瓜有机酸组
成复杂、种类丰富，如小分子脂肪酸莽草酸、柠檬
酸等，具有抗炎、抗菌、镇痛的作用[4-5]。原儿茶酸、
绿原酸、咖啡酸、肉桂酸等酚酸类成分具有显著的
抗炎、抗氧化、抗病毒、利胆等多种生物活性[6-11]，
熊果酸、齐墩果酸等三萜酸类成分具有抗炎抑菌、
降低转氨酶、防止肝硬化、镇静、降血糖等多种功
效[12-16]，《中国药典》2015 年版将熊果酸、齐墩果
酸作为指标评价木瓜饮片的质量。但现有文献仅采
用 HPLC-UV法同时测定木瓜脂肪酸、酚酸 2类有
机酸[17]，不能很好地整体评价木瓜的品质，本研究
拟建立同时测定木瓜脂肪酸（莽草酸、柠檬酸）、酚
酸（原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸）、三萜酸
（齐墩果酸、熊果酸）3类有机酸的量的超高速液相
色谱-质谱（UFLC-MS）方法，以期客观、综合地
评价不同产地木瓜饮片的质量，并为其药效物质基
础研究提供方法学依据。
1 仪器与材料
Shimadzu LC 20A型快速液相色谱仪，AB Sciex
Qtrap 5500型三重四级杆线性离子阱质谱仪，配有
ESI离子源，Analyst 1.5.1 Software工作站；Shimadzu
Librorael-40SM型电子分析天平（精确到 0.01 mg）。
柠檬酸（批号 100396-201302）、原儿茶酸（批
号 110809-201205）、绿原酸（批号 110753-200413）、
咖啡酸（批号 110885-200102）、肉桂酸（批号 110786-
200503）、莽草酸（批号 2014-0092），购自南京森
贝伽生物科技有限公司。上述对照品经 HPLC-UV
法检测，归一化法计算质量分数均大于 98.0%。齐
墩果酸（批号 110709-201206，质量分数 94.9%）、
熊果酸（批号 110742-201421，质量分数 93.8%），
购自中国食品药品检定研究院。甲醇、水为质谱纯，
德国Merck公司；其余试剂均为分析纯。
收集产地安徽（编号 S1～S3）、湖北（编号 S4～
S6）、重庆（编号 S7～S9）的 9批木瓜药材，均经
南京中医药大学吴啟南教授鉴定为蔷薇科植物贴梗
海棠 Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的干燥近
成熟果实。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Poroshell 120柱（100 mm×4.6 mm，2.7
μm）；流动相为 0.5%醋酸水溶液（A）-0.5%醋酸甲
醇溶液（B），梯度洗脱：0～5 min，10% A；5～13
min，10%～30% A；13～15 min，30%～95% A；
15～25 min，95% A；分析时间 25 min；体积流量
0.6 mL/min；柱温 30 ℃；进样量 2 μL。
2.2 质谱条件
离子源为电喷雾离子化源（ESI）；多反应监测
模式（MRM）进行定量分析；采用负离子检测模式；
源喷射电压（IS）为−4 500 V；离子源温度为 550 ℃；
雾化气（GS1，N2）压力为 379.28 kPa（55 psi）；
辅助气（GS2，N2）压力为 379.28 kPa（55 psi）；
气帘气（N2）压力为 227.568 kPa（33 psi）。接口加
热，全程通入氮气，MRM 模式定量。监测的离子
对，解簇电压（DP）和碰撞能量（CE）、碰撞室出
口电压（CXP）见表 1。MEM质谱图见图 1。

表 1 8个成分的质谱数据
Table 1 ESI-MSn data of eight components
名称 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) DP/V CE/eV CXP/eV
莽草酸 173.0 93.1 −90 −21 −15
柠檬酸 190.6 85.0 −185 −30 −11
原儿茶酸 153.0 109.0 −100 −30 −14
绿原酸 352.9 191.0 −95 −24 −21
咖啡酸 178.9 135.0 −70 −20 −19
肉桂酸 147.0 103.0 −60 −14 −11
齐墩果酸 455.2 407.2 −245 −54 −33
熊果酸 455.2 407.2 −245 −54 −33

2.3 溶液的制备
2.3.1 对照品溶液的制备 取各对照品适量，加甲
醇制成含莽草酸 37.41 μg/mL、柠檬酸 384.1 μg/mL、
原儿茶酸 2.509 μg/mL、绿原酸 46.52 μg/mL、咖啡
酸201.8 ng/mL、肉桂酸5.104 μg/mL、齐墩果酸60.82
μg/mL、熊果酸 62.75 μg/mL的混合对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备[1] 取本品细粉约 0.5 g，
精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，
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A-莽草酸 B-柠檬酸 C-原儿茶酸 D-绿原酸 E-咖啡酸 F-肉桂酸 G-齐墩果酸 H-熊果酸
A-shikimic acid B-citric acid C-protocatechuate D-chlorogenic acid E-caffeic acid F-cinnamic acid G-oleanolic acid H-ursolic acid

图 1 混合对照品溶液 (I) 和供试品溶液 (II) 8个成分的MRM质谱图及溶剂空白质谱图
Fig. 1 MRM chromatograms of eight components in mixed reference solution (I) and sample solution (II)

密塞，称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40
kHz）20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失
的质量，摇匀，滤过，取续滤液 1 mL，置于 10 mL
量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系、检测限（LOD）与定量限（LOQ）
精密量取混合对照品溶液 1 mL，置于 5 mL量瓶中，
加甲醇稀释至刻度。用倍比稀释的方法以甲醇制成
系列对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进样 2
μL，每个质量浓度进 3针，测定峰面积值。以峰面
积平均值与质量浓度进行线性回归。将混合对照品
溶液用甲醇不断进行稀释后分析，得到 8个成分的
LOD值（S/N≈2～3）和 LOQ值（S/N≈10）。结果
见表 2。
2.4.2 精密度试验 取 S3 样品按“2.3.2”项下方
法制备供试品溶液，进样 2 μL，连续进样 6次，依
法测定，分别记录峰面积，计算 RSD，结果莽草酸、
柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐
墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.27%、1.63%、
3.28%、2.85%、3.01%、1.47%、0.98%、1.13%。

表 2 8个成分的回归方程及 LOD、LOQ值
Table 2 Regression equations and values of LOD and LOQ in eight components
化合物 回归方程 线性范围/(ng·mL−1) r LOD/(ng·mL−1) LOQ/(ng·mL−1)
莽草酸 Y＝7.19×104 X＋2.69×104 149.6～74 820 0.999 7 3.09 9.27
柠檬酸 Y＝2.17×105 X－1.71×106 1 521～760 800 0.999 7 0.32 0.96
原儿茶酸 Y＝5.85×106 X－1.26×105 10.04～5 018 0.999 8 0.83 4.15
绿原酸 Y＝7.73×106 X＋4.30×106 186.1～93 040 0.999 8 0.29 2.04
咖啡酸 Y＝2.23×108 X－2.76×105 0.807～403.6 0.999 9 0.95 4.75
肉桂酸 Y＝1.85×105 X－1.06×104 20.42～10 210 0.999 8 3.85 19.25
齐墩果酸 Y＝5.73×105 X＋3.82×105 243.3～121 600 0.999 9 1.05 5.25
熊果酸 Y＝5.61×104 X＋2.65×104 251.1～125 500 0.999 2 3.76 18.80
A-I A-II B-I
C-I
E-I
D-I
F-I
G-I
B-II
C-II D-II
E-II F-II
G-II
空白
0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30
t/min
H-I
H-II
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2.4.3 稳定性试验 取 S3 样品按“2.3.2”项下方
法制备供试品溶液，于 0、1、2、4、6、8 h分别进
样 2 μL，依法测定，分别记录峰面积，计算 RSD，
结果莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、
肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸峰面积的 RSD 分别为
2.42%、2.08%、1.93%、1.75%、3.18%、2.54%、1.58%、
2.17%，表明供试品溶液中 8个成分在 8 h内稳定。
2.4.4 重复性试验 取编号为 S3的木瓜饮片 6份，
每份 0.5 g，按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，依
法测定并计算 6份样品中 8个成分的平均质量分数
和 RSD。结果莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、
咖啡酸、肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸的平均质量分
数分别为 1.174 mg/g、16.46 mg/g、56.53 μg/g、2.224
mg/g、6.712 μg/g、207.4 μg/g、3.294 mg/g、1.853
mg/g，RSD分别为 2.08%、1.97%、2.53%、2.22%、
3.06%、3.65%、1.00%、1.62%。
2.4.5 加样回收率试验 取编号为S3的木瓜饮片6
份，每份 0.25 g，精密称定，精密加入混合对照品
溶液 25 mL（含莽草酸 18.9 μg/mL、柠檬酸 0.205
mg/mL、原儿茶酸 0.932 μg/mL、绿原酸 27.0 μg/mL、
咖啡酸 0.114 μg/mL、肉桂酸 7.15 μg/mL、齐墩果酸
31.3 μg/mL、熊果酸 15.8 μg/mL），按“2.3.2”项方
法制备供试品溶液，依法测定并计算 6 份样品中 8
个成分的平均加样回收率和 RSD。结果莽草酸、柠
檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐墩
果酸、熊果酸的平均加样回收率分别为 96.77%、
97.05%、97.98%、96.14%、100.9%、101.2%、100.2%、
99.23%，RSD分别为 2.59%、1.72%、2.68%、1.72%、
2.71%、1.08%、2.32%、1.71%。
2.5 样品测定
取 9批木瓜饮片，每批 3份，按“2.3.2”项方
法分别制备供试品溶液，各进样 2 μL，依法测定并
计算每批样品中 8个成分的平均质量分数，结果见
表 3。

表 3 木瓜饮片中 8个化合物质量分数 (n = 3)
Table 3 Contents of eight components in Chaenomelis Fructus
样品
质量分数/(μg·g−1)
莽草酸 柠檬酸 原儿茶酸 绿原酸 咖啡酸 肉桂酸 齐墩果酸 熊果酸
S1 1 252 19 280 541.80 5 120 8.740 3 964.0 4 241 1 973
S2 2 334 17 460 36.29 1 887 11.940 1 299.0 2 300* 2 183*
S3 1 969 16 780 73.66 2 402 5.140 315.1 3 293 1 815
S4 2 434 14 780 68.99 1 451 29.160 302.3 2 460* 2 012*
S5 2 628 17 330 25.23 3 998 5.628 947.6 1 410 6 369
S6 1 934 20 210 27.13 1 613 20.790 1 004.0 1 993* 2 666*
S7 1 084 15 880 108.80 4 092 4.690 3 763.0 3 838 4 024
S8 3 315 16 980 122.80 3 102 46.760 2 824.0 1 539 5 740
S9 2 515 20 690 22.31 2 074 23.700 1 553.0 4 562 3 327
*表明齐墩果酸、熊果酸质量分数之和低于《中国药典》2015年版规定的 0.5%
* Total contents of oleanolic acid and ursolic acid less than 0.5%, prescribed in Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition)

3 讨论
实验前期采用 HPLC-PDA 分离以上 8 种有机
酸，小分子脂肪酸如苹果酸、莽草酸由于极性较大，
普通十八烷基键合相不保留且因紫外仅有末端吸
收，导致测定莽草酸的紫外灵敏度很低。酚酸、三
萜酸类有机酸对照品基线虽然实现基本分离，但样
品中其他成分对待测有机酸产生干扰，不能实现基
线分离，影响定量结果的准确性，故采用 UFLC-MS
法，MRM 模式检测，既可以缩短分析周期，也提
高了检测灵敏度，实现待测化合物的准确定量。
遵循化合物的裂解规律，优化质谱离子源温度、
辅助气和气帘气电压、子母离子的质荷比、解簇电
压、碰撞电压、碰撞室出口电压，优选出最佳MRM
测定条件。
实验结果表明，虽然熊果酸、齐墩果酸是《中
国药典》2015年版规定的指标性成分，《中国药典》
2015 年版规定 2 者质量分数总和不低于 0.5%。但
是柠檬酸、绿原酸、莽草酸的量均较高，尤其柠檬
酸的量超出其他有机酸的量 10倍以上。初步推断可
能与产地种植品种、不同的初加工方式有关[18]。
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本实验 3类有机酸的量测定方法的建立，为完
善木瓜质量控制提供了技术支撑，对木瓜产地种植、
初加工方法、合理贮藏起到指导作用。实验室后期
拟根据临床实际，结合药理模型，探索上述有机酸
对木瓜药效的贡献，建立多指标的质量-效应评价体
系，为全面揭示木瓜的药效作用物质基础提供依据。
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