全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 12期 2014年 6月

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• 药理与临床 •
阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2 细胞增殖及其细胞色素 P450 酶的影响
汤 浩 1*，高庆剑 2，陆 铖 2，屈坤鹏 1，闵光涛 3
1. 甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000
2. 宁夏医科大学药学院 药理系，宁夏 银川 750000
3. 兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000
摘 要：目的 观察阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2细胞中细胞色素 P450同工酶 1A1、3A4（CYP1A1、CYP3A4）的作用特点。
方法 采用MTT比色法测定不同质量浓度阿魏酸和异阿魏酸对体外培养人肝癌 HepG2细胞增殖的影响；采用流式细胞术测
定阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2细胞周期的影响；实时定量 PCR技术检测阿魏酸和异阿魏酸处理后 CYP1A1、CYP3A4 mRNA
的表达；Western blotting检测 CYP3A4蛋白表达。结果 作用 48 h后，阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2细胞均有抑制作用，且
有明显的剂量依赖关系；阿魏酸和异阿魏酸（50 μg/mL）均阻滞 HepG2 细胞周期于 G2/M 期；阿魏酸和异阿魏酸在不同作
用质量浓度下均是 CYP1A1、CYP3A4 mRNA的抑制剂；50 μg/mL阿魏酸和异阿魏酸处理细胞 48 h后，CYP3A4蛋白表达
均明显低于对照组，相比于对照组，阿魏酸和异阿魏酸的表达量分别为 0.57、0.39。结论 阿魏酸和异阿魏酸均能抑制 HepG2
细胞的增殖，其机制之一是影响细胞周期使其阻滞于 G2/M期，能够抑制药物代谢酶 CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表达，同
时抑制 CYP3A4的蛋白表达，但作用程度差别较大，可能与其羟基和甲氧基异构有关。
关键词：阿魏酸；异阿魏酸；HepG2细胞；细胞周期；药物代谢酶
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)12 - 1726 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.12.014
Effects of ferulic acid and isoferulic acid on proliferation of HepG2 cells and its
cytochrome P450 enzymes
TANG Hao1, GAO Qing-jian2, LU Cheng2, QU Kun-peng1, MIN Guang-tao3
1. Gansu Provincial People’s Hospital, Lanzhou 730000, China
2. Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, China
3. Affiliated First Hospital, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract: Objective To observe the action characteristics of ferulic acid and isoferulic acid on cytochrome P450 isoenzymes1A1 and 3A4
(CYP1A1, CYP3A4) in HepG2 cells. Methods MTT colorimetry was used to investigate the effects of ferulic acid and isoferulic acid at
different concentration on the proliferation of in vitro cultured HepG2 cells. Flow cytometry was used to determine the effects of ferulic acid
and isoferulic acid on cell cycle of human liver HepG2 cells; The expression of CYP1A1 and CYP3A4 mRNA was tested by real time
quantitative PCR technology after drug treatment and then CYP3A4 protein expression was detected by protein immunoblot method
(Western blotting). Results HepG2 cells were inhibited by ferulic acid and isoferulic acid after 48 h action, with a clear dose-response
relationship; Two drugs (50 μg/mL) blocked HepG2 cell cycle in G2-M phase; All of the concentration (100, 50, and 25 μg/mL) of the two
drugs were CYP1A1 and CYP3A4 mRNA inhibitors; After cells were disposed by the two kinds of drugs (50 μg/mL) with 48 h, protein
expression was significantly lower than that in the control group; And compared with the control group, the expression amounts of ferulic
acid and isoferulic acid were 0.57 and 0.39. Conclusion The proliferation of HepG2 cells is inhibited by the two drugs, and the cell cycle
was arrested at G2/M phase, which that may be one of its mechanisms, so as to inhibit the mRNA expression of CYP1A1 and CYP3A4 . At
the same time, both of them could inhibit the protein expression of CYP3A4, as well as the effect degree of difference is bigger, which may
be associated with its hydroxyl and the methoxyl isomerisation.
Key words: ferulic acid; isoferulic acid; HepG2 cells; cell cycle; drug metabolism enzymes

收稿日期：2013-11-28
基金项目：甘肃省技术研究与开发专项计划（1105TCYA024）；兰州市科技计划项目（2010-1-72）
*通信作者 汤 浩，女，副主任药师，硕士生导师，从事医院药学和中药新药开发研究。Tel: (0931)8281682 E-mail: gsyy-th@sina.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 12期 2014年 6月

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人体内主要药物代谢酶是细胞色素 P450
（CYP）超家族[1]，其中 CYP1A1、CYP3A4是体内
重要的药物代谢酶[2]，CYP1A1 作为药物评价致癌
性的重要指标[1]，CYP3A4 是预测药物敏感性的模
型[3]。由于 CYP3A4 酶是人体内一类非常重要的
CYP代谢酶，临床 60%的药物都要经其代谢转化[3]，
而且许多药物也是其诱导剂或抑制剂。
阿魏酸（ferulic acid）和异阿魏酸（isoferulic
acid），两者结构相似，为一对同分异构体[4]，是一
种植物来源的酚酸[5]，是阿魏、当归、升麻和川芎
等中药的主要成分之一[6-7]，是以桂皮酸为母核的酚
酸类成分的代表[8]。阿魏酸具有广泛的药理学作用，
如抗肿瘤、抗氧化、解毒、保肝等作用，是一种多
靶点的抗肿瘤天然药物，且性质稳定、毒性低[9]。
阿魏酸和异阿魏酸细胞给药后对 CYP 的影响目前
尚未见文献报道，HepG2细胞具有典型肝癌细胞的
一系列恶性特征[10-11]，保留了一系列生物转化过程
中的 I相和 II相酶，是研究和评价防治肝癌药物的
较理想模型，本实验采用肝癌细胞 HepG2 给药模
型，观察给药后 HepG2 细胞的生长以及细胞中
CYPlA1、CYP3A4的活性变化，考察阿魏酸和异阿
魏酸对 CYP同工酶 CYP1A1和 CYP3A4的影响。
1 材料和方法
1.1 主要药品与试剂
阿魏酸（110773-201012）和异阿魏酸（111698-
201103）均购自中国食品药品检定研究院，质量分
数≥98%，用二甲基亚砜（DMSO）助溶。新生牛
血清购自 PAA 公司；噻唑蓝（MTT，美国 Sigma
公司）。反转录 qPCR RT Master Mix购自 Toyobo
公司；TaKaRa RNAiso Plus购自宝生物工程（大连）
有限公司；实验所用引物用 Primer Premier 5.0软件
设计，委托上海生工生物工程有限公司合成，
CYP3A4抗体购自 Santa Cruz 公司。
1.2 仪器
超净台、细胞培养箱、梯度 PCR测定仪（购自
PCR公司），ABI7500实时荧光 PCR、高速低温离
心机（Sigma公司），超声波裂解仪 VCX750（美国
SONICS公司）。
1.3 细胞
细胞株人肝癌细胞 HepG2为本实验室保存。将
HepG2细胞加入至含 10%新生牛血清、100 U/mL青
霉素、100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基中，置于
37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中孵育传代培养。
1.4 MTT 方法检测细胞增殖抑制率
取对数生长期 HepG2细胞接种于 96孔板中，
1×104个/孔，16 h后加入含不同质量浓度阿魏酸和
异阿魏酸的培养基，药物终质量浓度为 6.25、12.5、
25、50、100、150、200 μg/mL，各质量浓度设 3
个复孔，设正常生长细胞为对照组。各组细胞置
37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱内培养 48 h后，
每孔加入 20 μL的MTT（5 mg/mL），继续培养 4 h
后弃培养基，每孔加入 DMSO 150 μL震荡溶解 10
min。在酶联免疫检测分析仪上于波长 490 nm处测
定吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率，以 3 次
平行实验数据为最终结果。
增殖抑制率＝1－A 实验 / A 对照
1.5 细胞周期测定
取对数生长期细胞接种于 1次性细胞培养瓶，
1×106个/瓶，培养 16 h后，加入终质量浓度为 50
μg/mL的阿魏酸和异阿魏酸的培养基，继续培养 48
h 后，参照文献方法[12]进行操作，用流式细胞仪分
析细胞周期分布。
1.6 对HepG2细胞中CYP1A1和CYP3A4 mRNA
表达的影响
1.6.1 分组 实验组：阿魏酸和异阿魏酸质量浓度
分别为 25、50、100 μg/mL；对照组：正常细胞生
长组；阳性对照组：酮康唑[13]质量浓度分别为 25、
50、100 µg/mL。
1.6.2 RNA的提取和 cDNA的合成 细胞接种于 1
次性细胞培养瓶，16 h后弃培养基，用 PBS清洗 2
遍，加入含不同质量浓度阿魏酸和异阿魏酸的培养
基，作用 48 h。用 RNAiso Plus试剂盒提取 RNA，
RNA溶解于 15 μL RNse-free H2O中，5 μL用于测
定 RNA的纯度，8 μL用于反转录。用紫外分光光
度计测 A260、A280，2.1≥A260/A280≥1.8 合格，计算
总 RNA纯度及浓度。反转录体系为 5×RT Master
Mix 2 μL，酶混合物 0.5 μL，引物混合物 0.5 μL，
RNA 1 μL，无 RNA酶水 6 μL，反转录总体积 10 μL。
反转录的条件为 37 ℃、15 min，98 ℃、5 min，反
转录产物−20 ℃保存。
1.6.3 实时荧光 PCR反应 将反转录产物 10倍稀
释后作为 PCR 反应模板，PCR 的反应体系：1 μL
稀释液，上下游引物 10 μmol/L（表 1）各 1 μL，2×
SYBR Green I 12.5 μL，添加高压灭菌的三蒸水至终
体积 25 μL，混匀。反应条件：起始 95 ℃、5 min，
扩增时 95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、45 s循
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 12期 2014年 6月

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表 1 PCR 反应引物及序列
Table 1 Primer and sequence used in real-time PCR reaction
基因 序列
GAPDH 正向引物：GAGTCAACGGATTTGGTC
反向引物：GACAAGCTTCCCGTTCTC
CYP1A1 正向引物：GGCGTTGTGTCTTTGTAAACCA
反向引物：AGGTAGGAACTCAGATGGGAC
CYP3A4 正向引物：CTGTGTGTTTCCAAGAGAAGT
反向引物：TGCATCAATAATTTCCTCCTG

环 40 次，溶解曲线分析。以 GAPDH 为内参，进
行 PCR扩增产物的实时定量分析。
1.6.4 数据分析 实时定量 PCR数据采用比较阈值
法进行相对定量分析。计算方法：目的基因诱导或
抑制倍数＝2－∆∆Ct，Ct值是热循环仪中荧光达到阈值
循环数，∆∆Ct＝实验组∆Ct（目的基因 Ct－内参基因
Ct）－对照组∆Ct（目的基因 Ct－内参基因 Ct）。
1.7 Western blotting 分析
将对照组和 3个不同质量浓度（25、50、100
μg/mL）阿魏酸和异阿魏酸处理 48 h后的细胞分别
提取蛋白，然后以 GAPDH为内参，按照文献方法[14]
检测 CYP3A4蛋白的表达差异。
1.8 统计学分析
所有数据用 SPSS 17.0统计学软件进行统计学
分析，数据均用 ±x s表示，采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 对 HepG2 细胞增殖的影响
MTT实验结果表明，随着阿魏酸和异阿魏酸质
量浓度的增加，对 HepG2细胞的增殖抑制率升高，
呈剂量依赖关系。质量浓度在 50 µg/mL时，2种药
物的抑制率相同。质量浓度低于 50 µg/mL时，异阿
魏酸对HepG2细胞的抑制能力比阿魏酸强，但质量
浓度高于 50 µg/mL时，则呈相反趋势。阿魏酸和异
阿魏酸的 IC50值分别为 66.64、83.69 μg/mL。见图 1。
2.2 对 HepG2 细胞周期的影响
流式细胞仪测定结果表明，与对照组比较，阿
魏酸和异阿魏酸均使HepG2细胞周期G2/M期发生
了明显阻滞，见表 2。阿魏酸和异阿魏酸使 G0/G1
期和 S期细胞数比例略微升高，而使 G2/M期比例
显著降低。特别是阿魏酸阻滞 G2/M 期，细胞数比
例相比于对照组降低了 13.53%。
2.3 对HepG2细胞中CYP1A1和CYP3A4 mRNA
表达的影响
PCR实验结果显示，相比于对照组，阿魏酸和




与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below
图 1 阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2 细胞增殖的影响
( ± = 3x s n, )
Fig. 1 Effects of ferulic acid and isoferulic acid on proliferation
of HepG2 cells ( ± = 3x s n, )
表 2 阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2 细胞周期的影响
( ± = 3x s n, )
Table 2 Effects of ferulic acid and isoferulic acid on cell
cycle of HepG2 cells ( ± = 3x s n, )
组别 ρ /
(μg·mL−1)
细胞周期分布 / %
G0/G1 S G2/M
对照 — 65.91±0.43 12.30±0.59 21.79±0.25
阿魏酸 50 78.83±0.72* 12.81±1.25* 8.26±0.57**
异阿魏酸 50 70.51±0.39* 15.72±1.06** 13.77±0.26**

异阿魏酸（100、50、25 μg/mL）均明显抑制 HepG2
细胞中 CYP1A1和 CYP3A4 的 mRNA表达，异阿
魏酸比阿魏酸抑制作用更强。尤其是在低质量浓度
25 µg/mL时，相比于阿魏酸，异阿魏酸对 CYP1A1
和 CYP3A4 mRNA的抑制能力均超过 3倍。阳性对
照酮康唑（25、50、100 µg/mL）对 CYP1A1 和
CYP3A4 mRNA均表现出普遍而强烈的抑制作用，
见表 3。
2.4 对 CYP3A4 蛋白表达的影响
Western blotting检测 50 μg/mL的阿魏酸和异
阿魏酸处理 48 h后 HepG2细胞内 CYP3A4蛋白表
达水平的变化。阿魏酸和异阿魏酸的 CYP3A4蛋白
表达量分别为对照组 CYP3A4蛋白表达量的 0.57、
0.39。结果显示 CYP3A4蛋白表达均明显低于对照
组（P＜0.05）。见图 2。
3 讨论
MTT实验结果表明 6.25～200 μg/mL阿魏酸和
增
殖
抑
制
率
/
%

70
60
50
40
30
20
10

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
ρ / (μg·mL−1)
阿魏酸
异阿魏酸
**
** **
**
**
**
**
**
** ** **
** *
**
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表 3 阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2 细胞中 CYP1A1 和
CYP3A4 mRNA 表达的影响 ( ± = 3x s n, )
Table 3 Effects of ferulic acid and isoferulic acid on CYP1A1
and CYP3A4 mRNA expression in HepG2 cells
( ± = 3x s n, )
组别
ρ /
(μg·mL−1)
mRNA相对表达量（以对照组为
CYP1A1 CYP3A4
对照 — 1.00 1.00
阿魏酸 25 −0.55* −0.33**
50 −1.02** −1.14**
100 −0.87** −1.08**
异 阿 魏

25 −1.79** −2.77**
50 −1.94** −1.72**
100 −1.89** −1.41**
酮康唑 25 −6.14* −5.43**
50 −8.36* −7.19**
100 −11.07* −10.86**





图 2 阿魏酸和异阿魏酸对 HepG2 细胞内 CYP3A4 蛋白
表达的影响 ( ± = 3x s n, )
Fig. 2 Effect of ferulic acid and isoferulic acid on CYP3A4
protein expression in HepG2 cells ( ± = 3x s n, )
异阿魏酸均可抑制肝癌细胞 HepG2生长。细胞周期
在肿瘤的生长调控中具有重要的作用，通过改变细
胞周期来阻止肿瘤细胞的无限增殖越来越受到人
们的关注[15]。细胞周期的调节主要发生在 2个重要
阶段：G1/S期和 G2/M期，阿魏酸和异阿魏酸处理
HepG2 细胞，使 G2/M 期细胞显著降低，2 种药物
通过影响细胞周期而抑制细胞生长。
随着各类新药的广泛应用以及联合用药的增
多，药源性肝损伤的发生率逐年增高，药源性肝损
伤的发生与肝组织内 CYP450的高表达密不可分，
部分药物经 CYP450代谢产生反应性代谢产物，后
者可与肝细胞内大分子物质共价结合造成肝损伤。
近年来研究表明，阿魏酸可通过抑制肝组织细胞脂
质过氧化反应，对药源性肝损伤有保护作用，如可
以通过抑制CYP2E1活性进而抑制异烟肼和利福平
联合用药所导致的肝损伤[16]。本实验对比研究了阿
魏酸和异阿魏酸对 2种主要 CYP亚型的抑制效果，
阿魏酸对 CYP1A1 活性有轻微的抑制作用，对
CYP3A4活性有明显的抑制，异阿魏酸对 CYP1A1
和 CYP3A4的活性表现出明显的抑制。研究结果显
示，阿魏酸和异阿魏酸处理组明显降低了 CYP1A1
和 CYP3A4 mRNA 表达以及 CYP3A4蛋白水平，
提示抑制CYP1A1和CYP3A4过度表达是阿魏酸和
异阿魏酸保护肝损伤的机制之一，通过调节
CYP450 的功能来调节肝损伤的氧化代谢，减少自
由基的生成，减弱氧化应激损伤，从而起到一定的
保肝作用。
鉴于阿魏酸和异阿魏酸是同分异构体，可以从
结构上推测导致两者对 CYP450酶抑制作用差异较
大的原因。阿魏酸和异阿魏酸的药理活性基团，比
如双键和羧基的位置都一致，两者的区别仅在于酚
羟基和甲氧基异构，阿魏酸苯环上 C-3位是甲氧基、
C-4位是羟基，而异阿魏酸苯环 C-3位是羟基、C-4
位是甲氧基，结合实验结果，在代谢过程中可以推
测苯环 C-3位和 C-4位的羟基和甲氧基的氧化位置
可能是影响对 CYP抑制效果的主要因素。
综上所述，本实验研究了阿魏酸和异阿魏酸这
一对同分异构体对HepG2细胞周期和 2种 CYP450
酶的作用，证明阿魏酸和异阿魏酸对 CYP450酶系
的抑制作用，实验结果为中西药代谢相关性提供了
体外实验的数据支持。由 Lynch等[17]得出的结论可
知，药物对酶的抑制可增加药物的浓度，延长药物
作用时间，引起药物毒性反应的增加，因而此 2种
药物对代谢酶的研究有助于预知它们治疗肿瘤时
发生的不良反应。2 种药物在人体内是否也存在
CYP450 酶的诱导或者抑制作用，有待于进一步的
实验研究。在分子生物学技术推动下，药物代谢领
域的研究对临床个体化给药以及药物的相互作用
有极其重要价值。
CYP3A4
GAPDH
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

C
Y
P3
A
4/
G
A
PD
H

对照 异阿魏酸 阿魏酸
对照 异阿魏酸 阿魏酸
*
*
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