全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 14期 2016年 7月

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基于单向灌流法的葛根素羧甲基壳聚糖微球肠吸收特性研究
刘诗雨，柏希慧，董林娟，王昌利*，宋 逍*
陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046
摘 要：目的 考察葛根素羧甲基壳聚糖微球的在体肠吸收特性。方法 采用大鼠在体单向灌流法，以 HPLC 法测定葛根
素的量，分别考察不同灌流体积流量、药物质量浓度、肠段对药物吸收的影响，并对比了葛根素原料药及载药微球的吸收特
性。结果 灌流体积流量对葛根素的吸收速率常数（Ka）和表观渗透系数（Papp）有显著性影响（P＜0.05）；葛根素的质量
浓度对 Ka和 Papp无显著性影响（P＞0.05）；葛根素在空肠和回肠的 Ka 和 Papp无显著性差异，但均显著大于在十二指肠处的
值（P＜0.05）；载药微球在空肠的 Ka 和 Papp 值显著高于葛根素原料药（P＜0.05）。结论 葛根素羧甲基微球中葛根素的吸
收机制为被动扩散，其在空肠和回肠段吸收较好，羧甲基壳聚糖作为载体能显著提高葛根素的吸收。
关键词：葛根素羧甲基壳聚糖微球；葛根素；单向肠灌流；重量法；吸收速率常数；表观渗透系数
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)14 - 2488 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.016
Study on rat small intestinal absorption features of puerarin loaded
O-carboxymethyl chitosan microspheres based on single pass perfusion method
LIU Shi-yu, BAI Xi-hui, DONG lin-juan, WANG Chang-li, SONG Xiao
Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China
Abstract: Objective To study the rat intestinal absorption characteristic of puerarin loaded O-carboxymethyl chitosan (CMCS)
microspheres in situ. Methods Single-pass intestinal perfusion (SPIP) model was used for rat in situ and HPLC to determine the
concentration of puerarin. The effects of different perfusion rate, drug concentration, and intestinal segments on intestinal absorption
were investigated, and the absorption characteristics of the puerarin and puerarin loaded O-CMCS microspheres were compared.
Results Perfusion rate had significant effect on the absorption rate constants (Ka) and the apparent absorption coefficient (Papp) (P <
0.05); The concentration of puerarin in perfusate had no significant effect on Ka and Papp (P > 0.05); Ka and Papp of drug loaded
microspheres in jejunum and ileum showed no significant difference, but they were significantly higher than that in duodenum (P <
0.05); The drug loaded microspheres and puerarin had the significant difference in Ka and Papp in jejunum (P < 0.05). Conclusion The
absorption mechanism of puerarin in the microspheres is passive diffusion, puerarin is absorbed well in jejunum and ileum, and
puerarin loaded O-CMCS microspheres can significantly improve the absorption of puerarin.
Key words: puerarin loaded O-carboxymethyl chitosan microspheres; single-pass intestine perfusion; gravimetric method; absorption
rate constants; apparent absorption coefficient

葛根 Puerariae Lobatae Radix 为豆科植物野葛
Pueraria lobata (Willd.) Ohwi 的干燥根，具有解肌
退热、透疹、生津止渴、升阳止泻之功效[1]。葛根
所含成分复杂，其中葛根素（puerarin）为主要有效
成分，具有增加冠脉血流量、降低血压、降低心肌
耗氧量等药理活性，临床上常用来治疗心脑血管疾
病[2-4]。但是葛根素存在水溶性和脂溶性均较差、体
内生物半衰期短、口服生物利用度较低等缺陷，严
重限制了其临床应用。为了提高葛根素口服生物利
用度，前期研究中以羧甲基壳聚糖为载体成功制备
葛根素羧甲基壳聚糖微球[5]。本实验在此基础上，
采用大鼠在体小肠单向灌流模型对葛根素羧甲基

收稿日期：2016-01-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373944）；陕西省科技统筹创新工程计划项目（2012KTCQ03-13）
作者简介：刘诗雨（1992—），男，硕士研究生，主要从事中药新剂型与新技术研究。Tel: 18710881673 E-mail: 1048575653@qq.com
*通信作者 王昌利（1958—），男，教授，主要从事中药新剂型与新技术研究。Tel: 13239103433 E-mail: wcl3433@163.com
宋 逍（1979—），男，博士，副教授，主要从事天然药物纯化及新剂型的研究。Tel: 15319015083 E-mail: songxiao1999@sohu.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 14期 2016年 7月

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壳聚糖微球的小肠吸收特性进行考察，以期为葛根
素口服制剂的研究提供必要生物药剂学依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，质
量分数≥98%，批号 110752-201506）；葛根素原料
药（陕西昂煦生物科技有限公司，质量分数为 98%，
批号 20150215）；葛根素羧甲基壳聚糖微球（实验
室自制）；乌拉坦（上海山浦化工有限公司）；
Kreb-ringer’s 营养液（K-R 液，pH 6.8，每毫升含
NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4
0.32 g、MgCl2 0.02 g、葡萄糖 1.40 g）；甲醇（色谱
纯，上海阿达玛斯试剂有限公司）；水为蒸馏水。
1.2 仪器
UltiMate3000 液相色谱仪（ Thermo Fisher
Scientific）；BT100-1F 型蠕动泵（保定兰格恒流泵
有限公司）；KH-400-KDE 型高功率数控超声波清洗
器（昆山禾创超声仪器有限公司）；AR1140 万分之
一天平（梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）；
BT125D 万分之一天平（德国赛多利斯集团）；HH-2
型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；
X1 型高速离心机（Gene Company Limited）。
1.3 动物
雄性 SD 大鼠，体质量（250±20）g，由第四
军医大学实验动物中心提供，动物许可证号 SCXK
（军）2011024。
2 方法与结果
2.1 葛根素微球的制备[5]
称取 0.5 g 羧甲基壳聚糖加至水 20 mL 中，制成
2.5%的羧甲基壳聚糖溶液。称取等量的葛根素，加至
上述溶液中，搅拌至溶解，得水相。量取 120 mL 液
体石蜡，搅拌下加入 7.2 mL Span-80，得油相。将水
相缓慢滴加到油相中，室温下乳化 30 min 后，缓慢滴
加 1 mL 25%戊二醛并搅拌使微球完全固化。固化结束
后将乳液 1 788×g 离心 10 min，弃去上层液体，所得
葛根素羧甲基壳聚糖微球（以下简称葛根素微球）用
石油醚多次洗涤后于 60 ℃减压干燥 12 h。所得微球
载药量、包封率和平均粒径分别为（25.73±0.15）%、
（51.47±0.31）%和（78.80±0.71）μm（n＝3）。
2.2 葛根素的定量测定
2.2.1 色谱条件[6] Thermo Hypersil GOLD C18 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（25∶
75）；检测波长 250 nm；体积流量 1.0 mL/min；柱
温 30 ℃；进样量 10 μL。
2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取葛根素对照
品 10.24 mg，置 100 mL 量瓶中，用 K-R 液溶解稀
释至刻度，制成质量浓度为 102.4 mg/L 的葛根素对
照品储备液。
2.2.3 含药肠灌流液的配制 精密称取葛根素微
球适量于 K-R 液中，超声溶解，0.45 μm 微孔滤膜
滤过，即得。
2.2.4 专属性试验 取空白肠灌流液、对照品溶
液、含药肠灌流液分别按照“2.2.1”项下条件测定，
记录色谱图。如图 1 所示，葛根素保留时间约为 8.8
min，空白肠灌流液在此保留时间处无吸收峰，表
明杂质对测定无干扰，分析方法的专属性良好。




图 1 专属性考察色谱图
Fig. 1 HPLC of specificity investigation
2.2.5 线性关系考察 精密量取对照品储备液 1、
2、4、6、8、10 mL 置 10 mL 量瓶中，K-R 液稀释
至刻度，配制成质量浓度分别为 10.24、20.48、40.96、
61.44、81.92、102.40 mg/L 的系列对照品溶液，0.45
μm 微孔滤膜滤过，取续滤液 10 μL 进样，记录峰
面积，以质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为
纵坐标，进行线性回归，得回归方程 A＝0.754 C＋
0.725（r＝0.998 9），表明葛根素在 10.24～102.4
mg/L 线性关系良好。
2.2.6 精密度试验 取质量浓度为 40.96、61.44、
81.92 mg/L 的葛根素对照品溶液，于 1 日内连续测
定 5 次，连续测定 5 d，考察日内精密度和日间精
密度。结果日内精密度 RSD 分别为 3.29%、1.69%、
1.34%；日间精密度 RSD 分别为 2.34%、1.49%、
0.99%，结果表明该方法的精密度良好。
空白肠灌流液
对照品溶液
含药肠灌流液
0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
t/min
葛根素
葛根素
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2.2.7 重复性试验 按“2.2.5”项下方法制备葛根
素质量浓度分别为 40.96、61.44、81.92 mg/L 的对
照品溶液各 3 份，分别进样，记录峰面积并计算
RSD。结果 RSD 分别为 1.73%、1.35%、1.18%，结
果表明该方法的重复性良好。
2.2.8 稳定性试验 用空白肠灌流液配制 40.96
mg/L 的葛根素对照品溶液各 3 份，37 ℃水浴锅中
孵育 4 h，每隔 1 h 取样检测，计算葛根素峰面积的
RSD 分别为 0.53%、0.40%、0.66%，表明葛根素在
肠灌流液中 4 h 内稳定。
2.2.9 加样回收率试验 精密移取对照品储备液，
用空白肠灌流液稀释得高、中、低（20.48、40.96、
61.44 mg/L）3 个质量浓度的对照品溶液，按“2.2.1”
项下色谱条件检测，记录峰面积，计算平均回收率。
结果表明，葛根素在高、中、低 3 个质量浓度下的
回收率分别为 99.85%、98.13%、98.08%，结果表
明该方法的回收率良好。
2.3 大鼠在体肠灌流实验
2.3.1 实验步骤 实验前用含药肠灌流液将管道
饱和一段时间，直至出液口药液中与含药肠灌流液
中葛根素质量浓度相等，以消除实验过程中管路对
药物的吸附作用。选取实验前禁食过夜（自由饮水）
的大鼠，ip 20%乌拉坦溶液（1.0 g/kg）麻醉并固定。
沿腹中线剪 3～4 cm 的开口，打开腹腔，分离出待
考察肠段，取约 10 cm 于两端切口，用预热至 37 ℃
的生理盐水缓慢地将肠内容物冲洗干净，于切口处
插管，结扎。将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖
保湿，红外灯下保温。进液口用已知质量的装有含
药灌流液的小瓶灌流，出液口处用另一已知质量的
小瓶收集流出液，每隔 15 min 迅速更换 1 次灌流液
小瓶和收集液小瓶，称质量，计算灌入和收集的灌
流液质量，持续时间为 90 min（15 min×6）。实验
结束后，剪下被考察肠段，测量其长度（L）和横
截面半径（r）。
2.3.2 数据分析 本实验采用重量法对肠灌流液
流入和流出的体积进行校正，并计算药物吸收速率
常数（Ka）和表观渗透系数（Papp）。
Ka＝(1－CoutQout/CinQin)Q/πr2L
Papp＝[−Q×ln(CoutQout/CinQin)]/2πrL
Qin和 Qout分别为肠段灌入的灌流液和收集液的体积（mL，假
定灌流液和收集液的质量浓度为 1.0 g/mL），L 和 r 分别为灌流
肠段的长度（cm）和横截面半径（cm），Q 为灌流体积流量，
Cin和 Cout分别为灌流液和收集液的葛根素质量浓度（mg/L）
2.3.3 统计学分析 采用 SPSS 15.0 软件对数据进
行单因素方差分析（ANOVA），结果以 ±x s 表示，
组间差异比较采用 t 检验。
2.3.4 不同灌流体积流量下药物的肠吸收 将 15 只
大鼠随机分成 3 组，每组 5 只。精密称取葛根素微
球适量，用 K-R 液配制成葛根素质量浓度为 40 mg/L
的肠灌流液，方法同“2.3.1”项下，以回肠为灌流
部位，比较不同灌流体积流量（0.1、0.2、0.3 mL/min）
下葛根素的 Ka和 Papp值。随着体积流量的增大，葛
根素微球中的葛根素在回肠的 Ka和 Papp均显著增加
（P＜0.05）。可能由于灌流体积流量的增加，造成肠
壁细胞一定程度的脱落，使肠壁变薄，药物被动扩
散阻力变小，故药物吸收量增加。结果见表 1。
2.3.5 药物最佳吸收部位的考察 将 15 只大鼠随
机分成 3 组，每组 5 只。分别取以下肠段[7]：十二
指肠段自幽门 1 cm 处开始，空肠段自幽门 15 cm 处
开始，回肠段自盲肠上行 20 cm 处开始，各段均取
10 cm。方法同“2.3.1”项下，精密称取葛根素微
球适量，用 K-R 液配制成葛根素质量浓度为 40
mg/L 的肠灌流液，灌流体积流量为 0.2 mL/min，比
较葛根素在各肠段的 Ka 和 Papp 值。结果表明，葛
根素微球中葛根素在空肠和回肠段的 Ka 和 Papp 无
显著性差异，但均显著大于十二指肠的 Ka 和 Papp
值（P＜0.05）。结果见表 2。
2.3.6 不同质量浓度条件下药物的肠吸收 将 15
表 1 不同体积流量下葛根素回肠吸收参数 ( x±s, n = 5)
Table 1 Absorption parameters of puerarin in ileum at
different flow rates ( x±s, n = 5)
体积流量/(mL·min−1) Ka/min−1 Papp/(×10−3 cm·min−1)
0.1 0.019 8±0.002 4 1.58±0.19
0.2 0.029 7±0.001 9* 2.39±0.16*
0.3 0.038 1±0.000 8*# 3.05±0.07*#
与 0.1 mL·min−1 比较：*P＜0.05；与 0.2 mL·min−1 比较：#P＜0.05
*P < 0.05 vs 0.1 mL·min−1; #P < 0.05 vs 0.2 mL·min−1
表 2 葛根素在不同肠段的吸收参数 ( x±s, n = 5)
Table 2 Absorption parameters of puerarin in various intestinal
segments on ( x±s, n = 5)
肠段 Ka/min−1 Papp/(×10−3 cm·min−1)
十二指肠 0.019 9±0.000 5 1.60±0.04
空肠 0.029 1±0.002 1& 2.33±0.17&
回肠 0.029 7±0.001 9& 2.39±0.16&
与十二指肠比较：&P＜0.05
&P < 0.05 vs duodenum
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只大鼠随机分成 3 组，每组 5 只。精密称取葛根素
微球适量，用 K-R 液配制成葛根素质量浓度为 20、
40、80 mg/L 的肠灌流液，以空肠为灌流部位，灌
流体积流量为 0.2 mL/min，比较不同质量浓度的葛
根素在空肠吸收的 Ka和 Papp值。结果表明高、中、
低 3 个质量浓度的肠灌流液中葛根素在空肠的 Ka
和 Papp 均无显著性差异（P＞0.05），表明葛根素在
空肠中的吸收无自身浓度抑制作用，主要以被动扩
散机制进入体循环。结果见表 3。
2.3.7 葛根素原料药与葛根素微球肠吸收的比较
将 10 只大鼠随机分成 2 组，每组 5 只。精密称取葛
根素原料药和葛根素微球适量，用 K-R 液分别配制
质量浓度为 40 mg/L 的含药灌流液，以空肠为灌流
部位，灌流体积流量为 0.2 mL/min，比较葛根素原
料药和葛根素微球在空肠的 Ka和 Papp值。结果表明
葛根素原料药和葛根素微球在空肠的 Ka和 Papp有显
著性差异（P＜0.05），葛根素微球的 Ka和 Papp值较
葛根素原料药显著增加，表明羧甲基壳聚糖作为载
体能显著提高葛根素的肠吸收。结果见表 4。
表 3 不同质量浓度葛根素在空肠中的吸收参数 ( x±s, n = 5)
Table 3 Absorption parameters of puerarin at different
concentration in jejunum ( x±s, n = 5)
ρ/(mg·L−1) Ka/min−1 Papp/(×10−3 cm·min−1)
20 0.027 6±0.002 0 2.21±0.16
40 0.029 1±0.002 1 2.33±0.17
80 0.030 7±0.001 7 2.45±0.13
表 4 葛根素和葛根素微球在空肠中的吸收参数 ( x±s, n = 5)
Table 4 Absorption parameters of puerarin and puerarin
loaded O-CMCS microspheres in jejunum ( x±s, n = 5)
药物 Ka/min−1 Papp/(×10−3 cm·min−1)
葛根素原料药 0.014 5±0.001 6 1.16±0.13
葛根素微球 0.029 1±0.002 1△ 2.33±0.17△
与葛根素原料药比较：△P＜0.05
△P < 0.05 vs puerarin
3 讨论
评价药物在肠道吸收的方法主要有在体法、离
体法和体内法。与离体法和体内法相比，在体法的
优势是保证了血液和淋巴液的供应。在体法又包括
在体循环法和单向灌流法，前者因长时间以较高体
积流量回流灌流液，对肠黏膜损伤较大，导致药物
吸收增加，使实测值与真实值之间存在较大偏差；
而后者以较低体积流量对某一肠段进行单向灌流，
实验条件接近体内肠道环境，与人体有良好的相关
性，故本实验采用单向灌流法[8-9]考察葛根素羧甲基
壳聚糖微球的小肠吸收特性。
药物吸收过程中，肠道不仅吸收药物，还吸收
或分泌水分，导致收集液体积发生变化，因此实验
必须对体积变化进行校正。目前，常用的体积校正
方法有酚红法和重量法。但在长时间的灌流过程
中，肠道对酚红存在一定程度的吸收，导致所测吸
收参数较真实值偏低，且酚红本身还可能干扰某些
化合物在肠道的转运和分析测定。而重量法通过灌
流前后的质量差和密度对灌流液体积进行校正，真
实反映肠道水分吸收情况，提高 Ka 和 Papp 的准确
度[10-11]。因此，本实验采用重量法对吸收前后灌流
液体积的变化进行校正。
实验结果表明，葛根素羧甲基壳聚糖微球在回肠
和空肠中吸收较好；微球中葛根素的吸收不受质量浓
度影响，主要以被动扩散机制进入体循环；以羧甲基
壳聚糖为载体制备的微球能显著提高葛根素的吸收。
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