全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 15 期 2013 年 8 月

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基于 ITS2 条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别
陈贝贝 1，宋经元 2，姚 辉 2，韩正洲 1*，仰铁锤 1，邢建永 1
1. 华润三九医药股份有限公司 研发中心，广东 深圳 518110
2. 中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 利用 ITS2 条形码鉴别两面针药材及其混伪品，为两面针药材鉴定提供新方法。方法 采用 PCR 法扩增 ITS2
（转录第二间隔区）序列，双向测序后运用 CodonCode Aligner、MEGA 软件进行数据处理，构建系统聚类树（NJ 树）。结果
两面针药材及其混伪品基因组 DNA 降解明显，但不影响 ITS2 条形码的 PCR 扩增和测序，ITS2 条形码序列分析表明种内与
种间遗传距离具有较大差异，基于 ITS2 条形码构建 NJ 树可鉴别两面针药材及其混伪品。结论 ITS2 条形码适用于两面针
药材及其混伪品的鉴别，为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法；为两面针基原研究提供重要的分子鉴定证据；同时为
DNA 条形码技术应用于其他根、茎类中药材的鉴定提供了示范作用。
关键词：ITS2；两面针；PCR 扩增；DNA 条形码；分子鉴定
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)15 - 2150 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.15.022
Identification of Zanthoxyli Radix and its adulterants using ITS2 barcoding
CHEN Bei-bei1, SONG Jing-yuan2, YAO Hui2, HAN Zheng-zhou1, YANG Tie-chui1, XING Jian-yong1
1. Research Center, China Resources of Sanjiu Medical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518110, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective ITS2 barcoding was used to discriminate Zanthoxyli Radix and its adulterants to ensure the quality and clinical
safety of this Chinese materia medica. Methods The internal transcribed spacer 2 (ITS2) regions were amplified and sequenced
bi-directionally. Then the obtained sequences were assembled using the CodonCode Aligner. The ITS2 regions were obtained using the
hidden Markov model (HMM)-based annotation methods. The genetic distances of the ITS2 regions were computed in accordance with
the kimura 2-parameter (K2P) model and Neighbor-joining (NJ) phylogenetic trees were constructed using MEGA5.0. Results The
length of ITS2 sequences of the plants in Zanthoxyli Radix and its adulterants were between 224 and 227 bp. Their mean intraspecific
genetic distance (K2P distance) was lower than their mean interspecific genetic distance with the adulterants. The NJ trees showed that
the roots of Zanthoxyli Radix could be easily distinguished from its adulterants. Conclusion ITS2 barcode could be used to identify
the roots of Zanthoxyli Radix and its adulterants effectively, and provide the important molecular evidence for the authentication of
germplasm resources.
Key words: ITS2; Zanthoxyli Radix; PCR amplification; DNA barcoding; molecular identification

《中国药典》2010 年版[1]收载两面针来源于芸
香科植物两面针 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.
的干燥根，两面针为岭南地区常用中药，能行气止
痛、活血化瘀、通络祛风，主治跌打损伤、风湿麻
痹、牙痛、胃痛、毒蛇咬伤，外用治汤火烫伤。两
面针需求量巨大，野生资源逐年减少；同时由于环
境、地域的差异，两面针药材来源混杂[2]，混伪品
较多、真伪难辨，造成了药材质量不稳定，难以保
证临床用药的安全、稳定和有效，很大程度上制约
了相关产业现代化的进程，因此建立科学的鉴定方

收稿日期：2012-11-19
基金项目：广东省教育部产学研结合项目（2009B090300202）
*通信作者 韩正洲（1964—），男，汉族，高级工程师，硕士研究生，研究方向为中药资源可持续开发利用及新药研究。
Tel: (0755)29066805 E-mail: gulf@999.com.cn
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法是保证两面针质量亟需解决的问题。
传统的中药鉴定主要采用性状鉴定，该方法简
便、直接，但主观性强，其准确性取决于鉴定者的
经验。近年来，随着分子生物学技术在中药学领域
的渗透与发展，基于 DNA 分子标记技术的分子鉴
定方法成为中药 4 大鉴定方法（基原鉴定、性状鉴
定、显微鉴定、理化鉴定）的重要补充[3]，得到不
断的发展与应用。
目前有关两面针鉴别方面的研究少见报道，
鉴别手段主要基于性状及显微鉴别 [4-6]，分子鉴
定尚未见报道。DNA 条形码（DNA barcoding）
是在 DNA 分类学基础上首先由加拿大动物学家
Paul Hebert 提出的，他是利用一段标准 DNA 序列
作为标记实现快速、准确和自动化的物种鉴定方
法。ITS2 序列是目前首推的作为植物鉴别的 DNA
条形码之一，Chen 等[7]通过对 753 个属 4 800 个
种内的 6 600 个药用植物样本的研究表明，ITS2
在种水平的鉴定效率达到 92.7%，因此推荐其作
为药用植物的标准条形码。Luo 等 [8]以芸香科 72
属 192 种 300 个样本为研究对象，通过对热点
候选条形码（matK、rbcL、psbA-trnH、rpoC1、
ycf5、ITS2、ITS）的筛选研究表明，ITS2 条形
码具有良好的 PCR 效率和测序成功率，在所考
察的序列中具有最大种间变异和最小种内变
异，且二者存在显著差异，具有最高的物种鉴
定成功率。
1 材料与方法
1.1 材料
不 同 产 地 的 两 面 针 Zanthoxylum nitidum
(Roxb.) DC.，其混伪品有毛叶两面针 Z. nitidum
(Roxb.) DC. var. tomentosum Huang、单面针 Z.
dissitum Hemsl、飞龙掌血 Toddalia asiatica Lam.及
竹叶花椒 Z. armatum DC. 4 个种，两面针样品 12
份，混伪品样品 12 份，共 24 份样品由华润三九
医药股份有限公司提供，经广西中医药研究所赖
茂祥研究员鉴定，信息见表 1。
表 1 样品来源
Table 1 Sources of samples
编号 名称 拉丁名 采集地 部位 GenBank 号 编号 名 称 拉丁名 采集地 部位GenBank 号
广西大塘 JX393933
JX393935
5 毛叶两面针 Z. nitidum var.
tomentosum
广西金秀 根 JX393930
JX393918
JX393913 JX393926
1 两面针 Zanthoxylum nitidum 根
广东平远 JX393929 6 飞龙掌血 Toddalia asiatica 广西崇左 根 JX393931
JX393916 JX393917
2 两面针

根
JX393919 JX393921
广东电白 JX393934 7 单面针 Z. dissitum 湖南麻阳 根 JX393927
JX393923 JX393925
3 两面针

根
JX393922 JX393914
广东平远 JX393928 8 竹叶花椒 Z. armatum 广西天峨 根 JX393932
JX393915 JX393936
4 两面针

茎
JX393924 JX393920

1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 将切制后自然晾干的药材根或
茎，用酒精表面消毒后，切成薄片，取约 40 mg 用
DNA 提取研磨仪（Retsch MM400，Germany）研磨
3 min（30 次/s）后，用天根 plant genomic DNA kit [天
根生化科技（北京）有限公司] 提取样品 DNA。
1.2.2 PCR扩增及测序 PCR扩增选用通用引物，
2F（5’-ATGCGATACTTGGTGAAT-3’）， 3R（5’-
GACCCTTCTCCAGACTACAAT-3’）。PCR 反应体
系选用 2×EasyTaq PCR mix（北京全式金生物技术
有限公司），体系内含 2×EasyTaq PCR mix 12.5 μL，
ddH2O 5.5 μL，上下游引物各 1 μL（2.5 μmol/L）（北
京诺赛基因组研究中心有限公司)，总 DNA 5 μL。
PCR 扩增程序为：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，56 ℃、
30 s，72 ℃、45 s，40 个循环；72 ℃、10 min。PCR
产物送上海美吉生物技术有限公司北京办事处采用
PCR 引物双向测序。
1.2.3 序列分析 对测序得到的峰图利用
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CodonCode Aligner V4.0.3（CodonCode Co., USA）
进行比对和拼接，去除引物区。使用基于隐马尔可
夫模型的 HMMer 注释方法去除 5.8 S 和 28 S 区，获
得 ITS2 序列。将得到的序列利用 MEGA5.0 进行多
重比对，基于 Kimura-2-parameter（K2P）双参数模
型计算遗传距离，并用邻接法（neighbour-joining）
构建系统聚类树（NJ 树），同时以 bootstrap（自
展支持率 1 000 次）重复检验各分支的支持率。
2 结果与分析
2.1 药材 DNA 提取及 PCR 扩增
两面针药材 DNA 的提取效率较低，电泳结果
多呈弥散状，显示根、茎类药材基因组 DNA 降
解较明显。尽管如此，各样本 PCR 扩增效率却
很高，结果见图 1，两面针药材及其混伪品扩增
后均得到了大约 500 bp 大小的片段。这些 PCR
产物双向测序均获成功，经拼接后获得高质量的
序列，各序列使用基于隐马尔可夫模型的
HMMer 注释方法去除 5.8 S 和 28 S 区，获得 ITS2
条形码序列，经 MEGA 5.0 分析，各 ITS2 序列
的 GC 量为 70%～74%。
2.2 种内及种间变异
2.2.1 种内变异 两面针种内序列共 12 条，平均


M-Marker；C-空白对照；1～3-编号 1 两面针各样本；4～6-编号 2 两面针各样本；7～9-编号 3 两面针各样本；10～12-编号 4 两面针各样本；
13～15-毛叶两面针各样本；16～18-飞龙掌血各样本；19～21-单面针各样本；22～24-竹叶花椒各样本
M-Marker; C-blank control; 1－3-samples of No. 1 Zanthoxyli Radix; 4－6-samples of No. 2 Zanthoxyli Radix; 7－9-samples of No. 3 Zanthoxyli
Radix; 10－12-samples of No. 4 Zanthoxyli Radix; 13－15-samples of Z. nitidum var. tomentosum; 16－18-samples of T. asiatica; 19－21-samples of Z.
dissitum; 22－24-samples of Z. armatum
图 1 两面针药材及其混伪品 ITS2 条形码 PCR 扩增结果电泳图
Fig. 1 PCR amplification results of ITS2 sequence of plants in Zanthoxyli Radix and its adulterants
GC 量均为 74%。编号为 4 的两面针 ITS2 条形码
序列为 225 bp；编号为 1、2 的两面针的 ITS2 条形
码序列为 226 bp，编号为 3 的两面针 ITS2 条形码序
列为 227 bp。两面针种内共 7 个变异位点，编号为 4
的两面针变异位点最多。种内最大 K2P 值为 0.032 0，
平均 K2P 值为 0.015 9。
2.2.2 种间变异 两面针混伪品共有 12 条序列，
ITS2 条形码在 224～227 bp；毛叶两面针 ITS2 条形
码序列平均 GC 量为 71%、飞龙掌血为 74%、单面
针为 73%、竹叶花椒为 70%。两面针种间序列共有
24 条，含有 34 个变异位点，其中飞龙掌血变异位
点最多。两面针种间最小 K2P 值为 0.030，平均 K2P
值为 0.096。
2.3 两面针及其混伪品的 NJ 树
基于 ITS2 条形码，通过邻接法构建 NJ 树。从
图 2 中可以看出，不同来源的两面针与其混伪品单
面针、毛叶两面针、飞龙掌血以及竹叶花椒各占 1
个分支，表现出了很好的单系性，并且能够明显区
分开，可见 ITS2 条形码能够很好鉴定两面针药材及
其混伪品。毛叶两面针与编号为 4 的两面针在 NJ

图 2 基于 ITS2 条形码构建的两面针及其混伪品的 NJ 树
Fig. 2 NJ dendrogram of Zanthoxyli Radix and its adulterants
constructed based on ITS2 sequences
树上显示了较近的亲缘关系，支持率为 52%，但单
系性明显，且单系支持率为 97%。

两面针 JX393935
两面针 JX393913
两面针 JX393919
两面针 JX393916
两面针 JX393933
两面针 JX393929
两面针 JX393934
两面针 JX393923
两面针 JX393922
两面针 JX393915
两面针 JX393924
两面针 JX393928
毛叶两面针 JX393930
毛叶两面针 JX393918
毛叶两面针 JX393926
竹叶花椒 JX393932
竹叶花椒 JX393936
竹叶花椒 JX393920
单面针 JX393927
单面针 JX393925
单面针 JX393914
飞龙掌血 JX393931
飞龙掌血 JX393917
飞龙掌血 JX393921
67
72
97
95
92 96
52
97
76
99
99
76
99
M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 C M
500 bp 500 bp
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3 讨论
3.1 两面针药材 DNA 提取与 PCR 扩增
市售的两面针药材选用的是原植物切制后晾干
的根切片。药材在切制、晾晒过程中长时间暴露于
自然环境下，温、湿度的差异会直接引起 DNA 内
磷酸二酯键的水解，且晾晒过程中由于外界微生物
的侵染也加剧了 DNA 的降解。另由于植物根中含
有丰富的次级代谢产物，容易与 DNA 结合形成共
沉淀，导致提取的 DNA 质量不高。此外，还存在
其他多种因素的影响，因此通常情况下药材 DNA
的提取效率较低。ITS2 在植物基因组内属于多拷贝
序列，利用本研究的引物扩增出序列大小约为 500
bp，因此较易扩增及测序。本研究中考察 DNA 提
取的起始药材样品量分别为 40、20 mg，结果显示
40 mg 起始量得到的 PCR 扩增效率较高，且测序成
功率好；20 mg 起始量的研究结果不理想。
两面针为根入药药材，长期生长于土壤环境中，
根中常会存在寄生真菌。ITS2 序列在植物及真菌中
广泛存在[9-10]，因此在 DNA 提取过程中须对药材进
行表面消毒。本研究中扩增得到的 ITS2 序列，均为
两面针或其混伪品的序列。
3.2 两面针与毛叶两面针的亲缘关系
《中国植物志》[11]中记载两面针有 2 个变种，
即两面针与毛叶两面针。其中对原变种两面针根据
形态差别分为 3 个类型，不同类型在分布上也有所
区别。经赖茂祥研究员鉴定本研究中编号为 04 的两
面针属于原变种第 1 类型，该类两面针与毛叶两面
针仅在被毛情况上存在一定差异。本研究中毛叶两
面针与编号为 4 的两面针在 NJ 树上显示了较近的
亲缘关系，且种间的最小 K2P 值（0.030）也产生
于这二者之间，提示该类两面针与两面针的变种即
毛叶两面针可能具有更为密切的关系。
3.3 ITS2 条形码用于两面针药材鉴定
两面针药用历史悠久，临床应用广泛[12-22]。但
由于连续大量采挖，致使目前两面针资源紧缺，且
《中国药典》及地方标准收载两面针来源复杂[2]，因
此混伪现象时有发生。传统两面针鉴定方法多为性
状鉴别及显微鉴别。《中国药典》2010 年版对两面
针的鉴别项采用的也是显微鉴别与薄层鉴别。DNA
条形码技术操作简便、易于实现，并且鉴定准确性
高、重复性好。陈士林课题组通过大量研究工作表
明 DNA 条形码候选序列 ITS2 在广泛的植物类群中
具有较好的鉴定结果[23-27]。本研究选用 ITS2 条形码
对两面针药材及其混伪品进行鉴别研究，研究表明
两面针药材及其混伪品的 ITS2 条形码具有较大差
异，基于 ITS2 构建的 NJ 树聚类分支明显，均表现
出明显的单系性；因此可有效区分两面针与其混伪
品。另外，每批样品至少重复 3 次，显示 ITS2 条形
码在多样本的基础上，通过多次 PCR 扩增实验均能
获得稳定的结果，因此能够为两面针药材的有效鉴
定提供依据。
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