全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 3 期 2012 年 3 月

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基于 ITS2 序列的羌活及其混伪品的 DNA 条形码鉴定
孙稚颖 1，陈士林 2*，姚 辉 2，宋经元 2
1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193
摘 要：目的 对羌活及其混伪品进行分子鉴定，以确保该药材的质量以及临床疗效。方法 利用 PCR 测序法，对样品进
行核基因 ITS2 片段扩增并双向测序，所得序列经 CodonCode Aligner 拼接后，用软件 MEGA 4.0 进行相关数据分析，并构建
邻接（NJ）树。利用已建立的 ITS2 数据库及其网站预测 ITS2 二级结构。结果 羌活与宽叶羌活 ITS2 序列长度均为 228 bp，
二者种内平均 K2P（Kimura-2-parameter）遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均 K2P 遗传距离；由所构建的系统聚类
树图可以看出，羌活与宽叶羌活均表现出了单系性，而同时又与其他混伪品明显分开；比较 ITS2 二级结构发现，羌活基原
植物与其混伪品在 4 个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2 序列作为 DNA 条形
码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。
关键词：羌活；DNA 条形码；ITS2；分子鉴定；遗传距离
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)03 - 0568 - 04
Identification of Notopterygii Rhizoma et Radix and its adulterants using DNA
barcoding method based on ITS2 sequence
SUN Zhi-ying1, CHEN Shi-lin2, YAO Hui2, SONG Jing-yuan2
1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China
2. Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Institute of
Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract: Objective To discriminate Notopterygii Rhizoma et Radix and its adulterants, and secure the quality and clinical curative
effect of this medicinal material. Methods The second internal transcribed spacer (ITS2) of ribosomal DNA was amplified and
sequenced by bidirectional sequencing of PCR products. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed by
using CodonCode Aligner. Phylogenetic study was performed using software MEGA 4.0 in accordance with Kimura-2-parameter
(K2P) model, and the phylogenetic tree was constructed by using the neighbor-joining (NJ) method. The ITS2 secondary structure was
predicted using ITS2 web server. Results The length of ITS2 sequence of Notopterygium incisum and N. franchetii was 228 bp. Their
mean intraspecific genetic distance (K2P distance) was far lower than their mean interspecific genetic distance with the adulterants. In
the cluster dendrogram, both N. incisum and N. franchetii showed monophyletic, and simultaneously distinguished from their
adulterants. To compare the ITS2 secondary structure between the origin plant of Notopterygii Rhizoma et Radix and its adulterants, we
noticed that it was obviously distinguished from the adulterants in terms of number, size, position of loop, and the angle of helix
exsertion. Conclusion ITS2 barcode could be used to identify Notopterygii Rhizoma et Radix and its adulterants effectively, and then
provide important molecular evidence for the authentication of germplasm rescouces and clinic safety of medicinal use.
Key words: Notopterygii Rhizoma et Radix; DNA barcoding; ITS2; molecular identification; genetic distance

羌活 Notopterygii Rhizoma et Radix 是我国传统
中藏羌医药体系中的常用重要药材，具有解表散寒，
祛风除湿、止痛的功效。用于风寒感冒、头痛项强、
风湿痹痛，肩背酸痛等症。《中国药典》2010 年版
记载其来源为伞形科植物羌活 Notopterygium
incisum Ting ex H. T. Chang 或宽叶羌活 N.
franchetii H. de Boiss. 的干燥根茎和根[1]。羌活与宽
叶羌活均为我国高原分布的特有种，由于近年来羌
活野生资源采挖处于无序状态，致使主要以营养繁
殖的羌活野生资源处于严重的威胁之下，1987 年羌

收稿日期：2011-07-18
基金项目：卫生行业科研专项（200802043）；北京市科技计划项目（D08080203640901）
作者简介：孙稚颖（1971—），女，副教授，博士，研究方向为药用植物资源与系统分类。E-mail: szyww@126.com
*通讯作者 陈士林 E-mail: slchen@implad.ac.cn
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活与宽叶羌活已被国务院《中国野生药材资源保护
管理条例》列为三级保护物种（渐危种）[2]。目前，
应用羌活的中（藏）成药有 200 余种，用药需求量
非常大，随着资源的短缺，伪劣药材常有出现，据
报道[3-4]羌活伪品主要为蓼科植物虎杖 Reynoutria
japonica Houtt.的干燥根茎和根、蔷薇科植物地榆
Sanguisorba officinalis L. 的干燥根、伞形科心叶棱
子芹Pleurospermum rivulorum (Diels) M. Hiroe.及林
当归 Angelica sylvestris L. 的干燥根或根茎。为了全
面控制和提升羌活药材质量，有必要对羌活及其混
伪品的鉴别进行深入研究。
关于羌活的鉴别研究，国内外报道较少，仅见
性状鉴别和显微鉴别等[5-6]。DNA 条形码是利用基
因组中一段公认标准的 DNA 片段来对物种进行准
确鉴定的新技术[7-8]，是当今生物分类和鉴定的研究
热点和方向，该技术简便高效，不受样品的形态性
状以及研究者的专业水平限制，避免了主观人为的
判断和客观条件的影响，能真实地反映中药材的本
来面貌，适用于对其进行真伪鉴定[9-10]。目前，药
用植物的 DNA 条形码虽未最终确定，但作为候选
序列的 ITS2 片段以其特有的优势被广泛关注[11-18]。
该片段一般较短，有利于对发生降解的样品进行扩
增[19]，同时 ITS2 片段在物种水平的变异较快，有
更多的突变位点以区分不同的物种[20]，此外，ITS2
序列能够与保守的 5.8 S 和 28 S 区段形成特定的茎
环二级结构，从而具有鉴别物种的分子形态特征。
本研究利用 ITS2 条形码对羌活及其混伪品进行了
比较研究，旨在为该药材的质量控制、临床安全用
药及合理开发利用提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 材料
样品经中国医学科学院药用植物研究所林余
霖副研究员鉴定，凭证标本保存于中国医学科学院
药用植物研究所。实验样品及来自 GenBank 所下载
序列，见表 1。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 样品均为硅胶干燥叶片，取样约
10 mg，用 DNA 提取研磨仪（Retsch MM 400，德
国）研磨 1 min 后，利用植物 DNA 提取试剂盒
（Tiangen Biotech Co.，中国）提取总 DNA。
1.2.2 PCR 扩增及测序 扩增、测序引物一致，
正向为 5’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向为
5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。PCR 反应体
积为 25 μL，反应体系及扩增程序参照 Chen 等[11]
的研究方法。PCR 扩增产物经纯化后，使用 ABI
3730XL 测序仪双向测序。
1.2.3 数据处理 测序峰图利用 CodonCode
Aligner V 3.0（CodonCode Co.，美国）校对拼接，
去除引物区，获得严格一致性序列。对于网上所获
得的 ITS 序列，使用基于隐马尔可夫模型的 HMMer
注释方法去除两端 5.8 S 和 28 S 区段获得 ITS2 间
隔区序列[21]。然后，将所有序列用软件 Molecular
表 1 样品来源
Table 1 Source of samples
编 号 样 品 采集地 标本号 GenBank 号
1 羌活 N. incisum 四川省康定县新都桥镇麦巴村康定（栽培） PS2005MT01 JF755942
2 羌活 N. incisum 四川省道孚县各卡村（野生） PS2005MT02 JF755946
3 羌活 N. incisum 四川省康定县折多山（野生） PS2005MT03 JF755947
4 羌活 N. incisum 未知 未知 DQ278168
5 羌活 N. incisum 未知 未知 EU236180
6 羌活 N. incisum 未知 未知 GQ379335
7 宽叶羌活 N. franchetii 四川省康定县姑咱镇羊厂沟（栽培） PS1215MT02 JF755943
8 宽叶羌活 N. franchetii 四川省道孚县各卡村（野生） PS1215MT03 JF755947
9 宽叶羌活 N. franchetii 四川省阿坝州小金县（野生） PS1215MT04 JF755944
10 宽叶羌活 N. franchetii 未知 未知 GQ379334
11 宽叶羌活 N. franchetii 未知 未知 AY038222
12 心叶棱子芹 Pleurospermum rivulorum 未知 未知 AY038219
13 林当归 A. sylvestris 未知 未知 U78474
14 虎杖 R. japonica 未知 未知 FJ514494
15 虎杖 R. japonica 未知 未知 EU808015
16 虎杖 R. japonica 未知 未知 AF040071
17 地榆 S. officinalis 重庆中药研究院药用植物园 PS1073MT01 GQ434648
18 地榆 S. officinalis 中国医学科学院药用植物研究所 PS1073MT04 GQ434649
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Evolutionary Genetics Analysis 4.0 分析比对并基于
Kimura-2-parameter（K2P）双参数模型进行遗传距
离等分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树。利用
bootstrap（1 000 次重复）检验各分支的支持率。
2 结果与分析
2.1 羌活基原植物与其混伪品 ITS2 序列种内种间
比较
羌活基原植物羌活与宽叶羌活 ITS2 间隔区序
列长度均为 228 bp，具有 1 个 PolyG 和 1 个 PolyA
结构，GC 量分别为 59.7%和 59.2%。羌活种内不同
来源样品 6 条序列比对后，长度为 228 bp，参照其
consensus 序列，在 160 bp 位点处，有 T-C 碱基变
异，其余位点碱基无差异，基于 K2P 双参数模型计
算遗传距离，羌活的种内平均 K2P 为 0.002；种内
最大 K2P 为 0.004。宽叶羌活 ITS2 序列 5 条，序列
比对后长度为 228 bp，有两位点碱基差异，参照其
consensus 序列，在 44 bp 处，为 A-C 颠换，在 144
bp 处，为 C-G 碱基转换。宽叶羌活的种内平均 K2P
为 0.007，种内最大 K2P 为 0.018。
羌活基原植物与其各混伪品种间序列进行比对
后，长度为 236 bp，ITS2 序列间存在较多的变异位
点。其中基原植物羌活与其余各混伪品种间平均
K2P 距离为 0.497，种间最小 K2P 距离为 0.221；宽
叶羌活与其余各混伪品种间平均K2P距离为 0.504，
种间最小 K2P 距离为 0.202。
2.2 聚类分析
基于 ITS2 序列，利用 MEGA4.0 构建的 NJ 系
统聚类树（图 1）显示，羌活基原植物羌活与宽叶
羌活不同来源样品聚在一支，表现出单系性，其混
伪品也各自聚为一支，通过 NJ 树图可以明显看出，
羌活能够与其混伪品区分开。
2.3 羌活及其混伪品 ITS2 序列二级结构
根据Koetschan等[22]建立的 ITS2数据库及其网
站预测羌活及其混伪品的 ITS2 二级结构（图 2），
由图可以看出，所有物种的二级结构均为一个中心
环（主环）及 4 个螺旋区构成，每个螺旋上又有大
大小小、或多或少的茎环结构。通过比较羌活与宽
叶羌活的 ITS2 二级结构发现，二者的差异较小，主
要存在于螺旋 I 区和 IV 区，羌活比宽叶羌活在这两
区均多一茎环。而羌活与宽叶羌活与其混伪品的
ITS2 二级结构差异较大，除螺旋 II 区各物种较一致
外，在其余 3 个螺旋区，茎环数目、大小、位置以
及螺旋发出时的角度均各有不同，因此，依据 ITS2

图 1 基于 ITS2 序列构建的羌活及其混伪品的邻接树
Fig. 1 Dendrogram of Notopterygii Rhizoma et Radix
and its adulterants constructed with ITS2
sequences using NJ method

图 2 羌活及其混伪品的 ITS2 二级结构比较
Fig. 2 Comparison on ITS2 secondary structure between origin plants of Notopterygii Rhizoma et Radix and its adulterants

4 11 15
13 12 18
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二级结构，可以直观地将羌活药材及其混伪品鉴别。
3 讨论
羌活是经济价值较高、市场缺口较大的名贵中
药。本研究采集了羌活的正品来源羌活与宽叶羌活
以及各地混伪品，又从 GenBank 上下载了这些物种
的相关序列，利用目前被广泛认可的 DNA 条形码
ITS2 序列片段，对羌活及其混伪品进行鉴别，发现
羌活的基原植物羌活与宽叶羌活的 ITS2 条形码序
列长度均为 228 bp，羌活种内平均 K2P 距离（0.002）
远远小于其与混伪品的种间平均 K2P 距离（0.497）；
宽叶羌活种内平均 K2P 距离（0.007）也远远小于
其与混伪品的种间平均 K2P 距离（0.504），在基于
邻接法构建的系统聚类树中，羌活基原植物均表现
出了单系性，而同时又与其他混伪品明显区分开，
ITS2 二级结构又进一步显示了羌活基原植物与其
混伪品所具有的明显差异，因此，利用 ITS2 序列作
为 DNA 条形码，可以有效地鉴定羌活。
目前，羌活药材资源紧缺，由于羌活的生长环
境要求严格，生长周期长，随着药材用量的不断增
加，野生资源渐趋枯竭。因此，应加强引种栽培技
术研究，建立 GAP 基地，野生变家种，实现规范
化种植，是满足市场要求，缓解供需矛盾，保护野
生物种资源，保证药材质量的当务之急，其中研究
的第一步就是要对其进行种质种源的正确鉴定和筛
选，目前羌活与宽叶羌活已在四川阿坝州及康定等
地进行了栽培，本研究实验序列既有来自野生种也
有栽培种，其 ITS2 序列碱基基本无差异。综上所述，
ITS2 条形码不仅可以正确鉴定中药材羌活，而且在
其市场流通及引种驯化、栽培过程中也可起到重要
的监控作用。
致谢：中国医学科学院药用植物研究所向丽博
士为本研究采集样品。
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