全 文 ：增多,扩增片段大小集中在 250~ 2 000 bp; 在新鲜
样品中扩增较弱的片段, 尤其是一些大片段, 在干燥
样品中基本扩增不出来, 而在新鲜样品中扩增较强
的片段在干燥样品中依然能有效扩增。这是由于绞
股蓝作为中草药, 入药前的加工步骤造成了 DNA
不同程度的降解。这也进一步说明要利用 RA PD
技术鉴定中药材, 要考虑到新鲜药材和干药材
RAPD 指纹图谱的差别。若是想将 RAPD 标记转
化 为 sequence character ized ampl if ied regions
( SCA R)标记, 应针对是新鲜药材和干药材共有的
特异条带。
王培训[ 13]等在利用 RAPD技术对南北五味子
进行鉴别的研究中发现, 以醋制南五味子为模板, 各
条引物的 PCR产物电泳图谱见不到 PCR产物。在
中药过程炮制中某些需要经过高达 150 的高温处
理,导致 DNA 严重降解且 DNA 双链分子之间形成
共价键,从而得不到 PCR产物。而新鲜绞股蓝只需
干燥后即可入药,其干药材的 DNA 降解程度较轻,
在本研究所采用的 17份绞股蓝干燥样品中, 均可得
到 PCR产物。
在后续研究中, 我们首先将针对此段 DNA 序
列设计特异引物, 将其转化为稳定的 SCAR标记,
增加扩增结果的稳定性和可重复性,从而将此特异
DNA 片段应用于绞股蓝的鉴定。
致谢:广西药用植物园凌征柱研究员、广西中医药
研究院何开家研究员为本研究鉴定并提供部分样品。
参考文献:
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究 [ J] 中药新药与临床药理, 2002, 13( 2) : 9899
毛钩藤和无柄果钩藤的 ITS序列分析研究
朱 爽1 ,周 林1 , 黄楷鸿1 , 黄宏靓1 ,高晓霞2 ,曾常青3 *
( 1 广东药学院生命科学与生物制药学院,广东 广州 510006; 2 广东药学院药科学院, 广东 广州 510006;
3 广东药学院中药学院, 广东 广州 510006)
摘 要:目的 以核糖体转录间隔区( rDNA IT S)序列为分子标记, 对钩藤属的 2 种常用中药材毛钩藤 Uncaria
hirs ute和无柄果钩藤 U sessilif ructus 进行遗传分析,阐明钩藤属内不同种间的分子系统发育关系。方法 通过改
良 CT AB 法对毛钩藤和无柄果钩藤进行总 DNA 提取, 利用通用引物对 rDNA IT S 序列进行 PCR扩增, RFLP 分析
和序列测定,用 PAUP软件进行系统发育分析,构建最大简约树。结果 获得毛钩藤和无柄果钩藤的限制性内切
酶( Msp !& H ae ∀ )酶切图谱以及 rDNA ITS 区的完整序列,其序列长度均为 718 bp。结论 通过基于 rDNA
ITS 序列进行 RFLP分析、序列测定和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对钩藤属植物进行准确的分子鉴
定,为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学依据。
关键词:毛钩藤; 无柄果钩藤; IT S 序列
中图分类号: R284 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10169605
#1696# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100308 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30800227)作者简介:朱 爽( 1977 ∃ ) ,男,讲师。 Tel/ Fax: ( 020) 39352201 Email: w en chengji@ yahoo com cn
* 通讯作者 曾常青 T el/ Fax: ( 020) 39352181 Em ail: gdz cq@ 163 com
ITS Sequence analysis of Uncaria hirsute and Uncar ia sessilif rutus
ZHU Shuang
1
, ZHOU Lin
1
, HUANG Kaihong 1 , HUANG Hongliang 1 ,
GAO Xiaox ia2 , ZENG Changqing3
( 1 Schoo l o f L ife Science and Biopharmacolog y, Guangdong Pharmaceutical University, Guang zhou 510006, China
2 School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guang zhou 510006, China; 3 Schoo l
of Chinese Mat eria Medica, Guangdong Pharmaceutical U niversit y, Guang zhou 510006, China)
Abstract: Objective In order to clarify the phylo genet ic r elat ionships betw een the dif ferent species of
Uncaria Schred, genet ic analysis w as carr ied out for Uncar ia hi rsute and U sessil i f r uctus by using the rD
NA ITS sequence as molecular mar ker Methods T otal DNA was ex t racted w ith modified CTAB method
and thereby rDNA ITS regions w ere amplif ied w ith common pr imer s T he rDNA IT S amplicon w as charac
terized by RFLP, sequencing and phylog enet ic analy ses using PAU P by maximum parsimony Results
The M sp ! and H ae ∀based RFLP pat ter ns of rDNA ITS from U hir sute and U sessil if rctus were ob
tained, w her e the resultant entire sequences o f rDNA IT S region w ere bo th 718 bp Conclusion Based on
molecular biolo gy methods of rDNA IT S sequence analysis, accurate molecular identif icat ion could be per
formed on tradit ional Chinese medicinal material plants in Uncar ia Schred and pr ovide mo lecular evidence
fo r taxonomy and ident if ication of dif ferent species in Uncar ia Schred
Key words: Uncar ia hir sute Hav il ; Uncar ia sessil if ructus Roxb. ; IT S sequence
钩藤为茜草科钩藤属植物, 主要分布于我国广
西、贵州、云南、广东等西南地区, 为中医常用药, 药
用历史悠久, %中国药典&2005年版规定钩藤为茜草
科植物钩藤Uncar ia r hynchop hy l la ( M iq ) Jack、
大叶钩藤 U macr op hy l la Wall、华钩藤 U sinen
sis ( Oliv ) Havil、毛钩藤 U hir sute Havil 和无
柄果钩藤 U sessil if ructus Roxb 5种药材。化学
成分研究表明, 钩藤中主要有效成分为生物碱,但不
同种的药效成分有明显的差别 [ 1]。目前, 中药钩藤
的分类鉴定主要依据形态学、组织学和化学成分等
传统分析方法, 由于这些方法的局限性,钩藤药材在
市场上的分类鉴定比较混乱, 在药材使用上存在互
混、互代、以次充好等现象, 影响了用药的安全性和
有效性 [ 2]。为了更安全、准确地使用钩藤属中药材,
有必要运用分子生物学技术进一步对钩藤属种间进
行鉴定。分子生物学技术已在药用植物的分子系统
发育分析中广泛地应用[ 35] ,但对钩藤属植物的资源
调查和种间分子鉴定等基础研究工作还少有报道,
仅有陶刚曾对贵州中药材钩藤属植物进行分子鉴定
并归类到属[ 67]。本研究采用分子生物学技术,以核
糖体转录间隔区( rDN A ITS)序列为分子标记, 对
钩藤属 2种常用中药材毛钩藤和无柄果钩藤 rDNA
IT S序列进行限制性片段长度多态性( restr ict ion
fragment length polymorphism, RFLP)分析和序列
测定,构建其系统发育树,从遗传本质上对钩藤属 2
种常用中药材的分类地位和种间鉴定提供分子证据。
1 材料来源与鉴定
实验用的毛钩藤 Uncar ia hir sute Havil 采自
广东肇庆鼎湖山中科院树木园, 无柄果钩藤
U sessi li f r uctus Roxb 采自广东广州华南植物园,
均由广东药学院曾常青教授提供并鉴定。采集新鲜
的叶片, 48 h内进行钩藤总 NDA 提取,或直接放进
含有硅胶的密封袋中快速干燥备用。
2 仪器和试剂
PCR 仪型 号为 A pplied Biosystems ( 2720
T hermal cycler PCR) , HH ∃ 1 数控恒温水浴锅,
T P ∃ 402电子分析天平, SW ∃ CJ ∃ 1F 清洁工作
台, SPX 智能型生化培养箱, TGL ∃ 16G 系列离心
机, BG ∃ SubMIDI水平电泳仪, Tanon ∃ 4100全自
动数码凝胶图像分析系统。
引物由上海生工生物工程公司合成, DNA 凝胶
回收试剂盒 (上海碧云天 Beyot ime 公司) , SYBR
Green I电泳染料(北京百泰克生物技术有限公司) ,
pMD18T Vector、rTaq 酶、限制性内切酶(大连宝生
物工程有限公司 TaKaRa ) ,其余试剂均为分析纯。
3 方法
3 1 改良 CTAB法提取总 DNA: 称取 0 5 g 的新
鲜叶片,放进预冷的研钵中,加入适量的液氮并研磨
成粉末。按每 1 g 样品加入 5 mL 的 65 预热
CTA B裂解液( 4% CT AB, 100 mmol/ L T ris # Cl,
25 mmol/ L EDTA , 1 4 mo l/ L N aCl, 2% 巯基乙
醇, 1% PV P, pH 8 0) , 每 1 mL 混合液分装到 1 5
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mL Eppendorf 管中, 充分混匀; 65 温浴 2 h(每隔
15~ 20 min 颠倒振荡 1 次) ,离心 5 m in( 12 000 ∋
g, 4 ) ,取上清液, 用等体积的 T ris饱和酚抽提 2
次,酚氯仿异戊醇 ( 25 ( 24 ( 1) 和氯仿异戊醇
( 24( 1) 各抽提 1 次, 离心 10 m in ( 12 000 ∋ g, 4
) , 取上清液, 先加入 NaAc( pH 5 2) ,使溶液终质
量分数为 0 3 mo l/ L ,再加入 2 5倍体积的无水乙
醇, - 20 沉淀 1 h, 吸出 DNA 至 1 5 mL 的 Ep
pendorf管中, 用 70%冷乙醇 1 mL 漂洗 2 次, 无水
乙醇洗涤 1次,干燥后溶于 50 L 无菌 T E 缓冲液
中, - 20 保存备用。
3 2 PCR扩增: 选择扩增植物 rDNA IT S 序列的
通用引物[ 89] ITS5( 5)GGAAGTAAAAGT CGT AA
CAAGG3)) 和 IT S4 ( 5) T CCT CCGCTT AT T
GAT ATGC3))对钩藤总 DNA 进行 rDNA ITS 序
列的扩增。在 20 L 的 PCR反应体系中含有 10 ∋
Buffer 2 L (含 MgCl2 , 2 5 mmol/ L ) , dNT P ( 10
mmo l/ L ) 0 4 L, 引物量为 10 pmol, rT aq ( 5 U /
L) 0 2 L, 约50 ng的模板 DNA ,其余体积以无菌
超纯水补足。PCR 扩增条件为: 95 预变性 3
min, 94 变性 1 m in, 52 退火 50 s, 72 延伸 50
s, 35个循环, 72 延伸 10 m in。
3 3 PCR产物的纯化、连接及转化: PCR 扩增产物
采用 DNA 凝胶回收试剂盒进行割胶回收。钩藤
rDNA ITS序列的 PCR扩增产物(大约 720 bp)从
1%的琼脂凝胶中割胶纯化。纯化产物连接到
pMD18TVecter,连接产物转化到 Escher ichia col i
JM 109感受态细胞, 进行氨苄青霉素选择和蓝白斑
的筛选。
3 4 菌落 PCR及酶切分型: 含有插入片段的单克
隆用引物对 ITS5和 IT S4进行菌落 PCR。PCR 产
物接着用来进行限制片段长度多态性 ( RFLP) 分
析,分别用 2种限制性内切核酸酶(M sp !和 H ae
∀) 37 恒温水浴 1 5 h。酶切 DNA片段用 2%琼
脂糖凝胶电泳分离, 经 SYBR Green 染色后, 用
Tanon4100全自动数码凝胶图像分析系统扫描成
相,得到 DNA 带型图谱进行比较分析电泳结果。
35 测序及序列分析: 挑取单克隆菌液送交华大基
因科技股份有限公司进行测序。测序得到的序列通
过与国际基因数据库( GenBank)中已有的 ITS 区序
列进行比较分析,得到该序列大概的分子系统发育关
系。DNA 序列之间的比较分析通过 Bioedit 软件完
成。通过 Clustal ∗程序(版本 1 8)进行序列的比对。
应用 PAUP 软件 (版本 4 0b10) , 使用最大简约法
( max imum parsimony, MP)计算及构建系统进化树,
用 Bootst rap值(1 000 bootst raps)检验系统树上各节
点的置信水平。使用 Treeview 查看。
4 结果与讨论
4 1 钩藤总 DNA 的提取结果: 用 50 L TE 回溶
钩藤的总 DNA, 取 3 L 总 DNA 样品, 用 SYBR
Green !染色 10 mim 后进行 1%琼脂糖凝胶电泳,
凝胶成像系统记录结果见图 1。可以看出, 2 个总
DNA 样品主带清晰,片段完整性好。
1Marker ( DL 2 000)
2无柄果钩藤
3毛钩藤
1Marker ( DL 2 000)
2U sessi l if ruc tus
3U hi r su te
图 1 总 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total DNA samples
4 2 钩藤 rDNA ITS 序列 PCR扩增结果:以提取
的总 DNA 为模板, 模板浓度按 1、10、102、103、104
倍的梯度稀释后进行 rDNA ITS 序列 PCR 扩增。
模板浓度梯度扩增结果表明,可进行钩藤 rDNA ITS
序列 PCR扩增的模板浓度范围在1 ∋ 102 ~ 1 ∋ 104。
在最佳模板浓度下,钩藤 rDNA ITS 序列 PCR
扩增产物的 1%琼脂糖凝胶电泳结果见图 2。可知,
钩藤 rDNA IT S序列 PCR产物主条带清晰,非特异
扩增条带少, 大小约为 718 bp。由此可见, 在最佳
的模板浓度下,可以减少钩藤中生物碱等抑制物对
PCR的不利影响。
4 3 酶切分型结果: 如图 3 所示, 泳道 1和 4分别
是用核酸限制性内切酶 M sp !对无柄果钩藤和毛
钩藤rDNA IT S序列 PCR 扩增产物进行消化后得
到的 RFLP 带型图谱, 可以明显地把这两种钩藤区
分开。同样地,泳道 2和 5分别是用核酸限制性内
切酶 H ae ∀对无柄果钩藤和毛钩藤 rDNA ITS 序
列 PCR扩增产物消化后得到的RFLP 带型图谱,也
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1无柄果钩藤
2毛钩藤
3M ark er ( DL 2 000)
1U sessil i f r uctus
2U hi rsut e
3M ark er ( DL 2 000)
图 2 最佳模板浓度条件下 PCR扩增结果
Fig 2 PCR Amplification with optimal template
concentration
1无柄果钩藤( Msp ! )
2无柄果钩藤( H ae ∀ )
3Marker ( DL 2 000)
4毛钩藤( Msp ! )
5毛钩藤( H ae ∀ )
1无柄果钩藤( Msp ! )
2无柄果钩藤( H ae ∀ )
3Marker ( DL 2 000)
4毛钩藤( Msp ! )
5毛钩藤( H ae ∀ )
图 3 毛钩藤和无柄果钩藤 rDNA ITS序列片段的 RFLP型
Fig 3 Msp! and Hae ∀based RFLP pattern of rDNA ITS
from U hirsute and U sessilif ructus
可以把这 2种钩藤区分开。由此可见, 对毛钩藤和
无柄果钩藤 rDNA ITS 序列进行 RFLP 分析可以
进行种间的鉴别。
4 4 ITS 序列编号: 每个样品挑取 3 个单克隆测
序,获得毛钩藤和无柄果钩藤 rDNA ITS 序列的长
度均为 718 bp。提交到 GenBank 数据库中的序列
编号 GU937110和 GU 93711。
4 5 钩藤 rDNA IT S序列的系统发育树构建:把毛
钩藤和无柄果钩藤的 rDNA IT S 序列分别与 Gen
Bank 中已有的 rDNA IT S序列进行比较分析,得到
与这两条序列相近的钩藤属其他种的序列。采用最
大简约法分析, 并以 N auclea subdi ta ( AJ346876)
和 N . xanthoxy lon ( AJ346877)为外类群建立一棵
最大简约树(图 4)。
图 4 毛钩藤和无柄果钩藤的最大简约树
Fig 4 MP Phylogenetic tree based on ITS sequences
from U hirsute and U sessilif ructus
从图 4可以看出, 毛钩藤和无柄果钩藤与 Gen
Bank中已有的钩藤 U r hynchphy l la ( AJ346900)
与华钩藤 U sinensis ( FJ980386)聚类成为一支,其
中无柄果钩藤和毛钩藤这一枝的支持强度为 64%,
并且毛钩藤和无柄果钩藤 rDNA IT S 序列通过
Clustal ∗比对和 Bioedit 计算, 它们之间的相似性
为 96 6% ,再结合 RFLP 酶型分析的结果, 可见应
用 rDNA IT S序列来进行钩藤属中药材种间鉴定是
准确可靠的。另外,在图 4中毛钩藤与 GenBank中
已有的钩藤 U r hynchop hy l la ( AJ346900)与华钩
藤 U sinensis ( FJ980386) 这一枝的支持强度达
88%,由此可见, 从遗传分析的角度,毛钩藤与钩藤
和华钩藤的亲缘关系更近。
rDNA IT S序列是用来研究药用植物种内变异
和种间、近缘属间分子系统关系的重要分子标记之
一[ 1 0] ,本研究测定了%中国药典&中钩藤入药的 2种
常用中药材(毛钩藤和无柄果钩藤) r DNA IT S 序
列,并结合 GenBank中已有的钩藤属 rDNA IT S序
列,构建了相对完整的钩藤属植物分子系统发育树,
从而为钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位
提供理论依据。由于从 GenBank 中可以获取的钩
藤属植物 rDNA ITS区序列仍然有限, 后续还要加
大对钩藤属各个种的 rDNA IT S 区序列的资源调
查,最终构建一棵完整的钩藤属各个种的系统发育
关系树,为钩藤属植物的种间进行有效鉴定提供分
子理论依据。
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决明种子硬实及萌发特性研究
张春平1 ,何 平1 * ,杜丹丹1 ,喻泽莉1 ,韦品祥1 , 胡世俊2
( 1 西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室,
重庆 400715; 2 中国科学院昆明植物研究所, 云南 昆明 650204)
摘 要: 目的 通过对决明种子硬实和萌发特性的研究, 找到打破种子硬实、提高种子萌发率的适宜条件。方法
观察种子外部形态,对决明种子长宽、千粒质量、净度、硬实率、含水量和吸水率进行测定,通过研磨、预先冷冻和热
水处理,找到破除种子硬实的方法, 考察不同温度、不同质量浓度化学物质对种子萌发率的影响。结果 决明种子
含水量为 10 43% , 未经处理的种子吸水率为 45 82% ,经过研磨处理和浓硫酸处理的种子吸水率分别为 154 2%、
159 7%。经过 98%浓硫酸处理 20 min 后的种子发芽率为 99 8% ,变温下( 25 、14 h/ 15 、10 h)种子萌发率为
98 7% , 200 mg / L GA3 和 200 mg/ L PEG 处理后的萌发率分别为 100%和 98 9% , 较高质量浓度的 NNA 和 6BA
对种子萌发具有明显的抑制效应。结论 种皮硬实是限制种子萌发的主要因素, 98%的浓硫酸浸泡 20 m in 可以较
好地打破决明种子硬实, 200 mg/ L GA 3 和 200 mg / L PEG 能在短时间内显著提高种子的萌发率, 最佳萌发温度为
25 , 14 h/ 15 , 10 h。
关键词:决明; 种子硬实;吸水率; 萌发率
中图分类号: R282 2 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10170006
Study on hardness and germination characteristic of Cassia obtusif olia seeds
ZHANG Chunping1 , HE Ping1 , DU Dandan1 , YU Zeli1 , WEI Pinx iang1 , HU Shijun2
( 1 Key Labo rato ry ( M inist ry o f Education) of Ecoenvir onments o f Three Go rges Reser voir Reg ion, Chongqing
Key Labor ator y of Plant Ecolog y and Resources Research for Three Go rges Reser vo ir Reg ion, School of L ife
Sciences, Southw est Univer sity, Chongqing 400715, China; 2 Kunming Institute of Botany, Chinese
Academy of Sciences, Kunming 650204, China)
Abstract: Objective T o break the seed hardness and improve the germ inat ion rate o f the Cassia
obtusi f ol ia seeds, hardness and germinat ion characterist ic of C obtusi f ol ia seeds w ere studied Methods
Several physio logical indexes like the w eights per thousand seeds, pure rate, hard r ate, content of mois
ture, and the rate of w ater absorpt ion w ere measured Methods o f soaking in hot w ater, pr efr eezing, im
mer sing seed in H 2SO 4 , and mechanical abrasion w ith coarse sand w er e used in the experiment A nd the
germinat ion r ate of C obtusi f ol ia seeds w as determ ined under differ ent temperatur e and dif ferent concen
t rat ion o f chem ist ry mat ter t reatment Results The content o f moisture in C obtusi f ol ia seeds w as
10 43%, the rate of w ater absorpt ion ( untreated) w as 45 82%, the rate of w ater absorpt ion t reated by
mechanical abrasion and H 2SO 4 were 154 2% and 159 7% , respect iv ely T he rate o f w ater abso rpt ion w as
99 8% by the t reatment of H 2SO 4 w ithin 20 min The germinat ion rate under the alter at ion tr eatment of
#1700# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100213 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30070080)作者简介:张春平( 1982 ∃ ) ,男,山东潍坊人,博士,主要从事植物资源学与植物分子生物学等方面的研究。
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* 通讯作者 何 平 T el: ( 023) 68254122 Email: heping196373@ 126 com