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枸杞多糖对人肝癌细胞 HepG2 生长的影响及其分子机制
黄 霞,肖丙秀* ,赵军伟,毛 芳,姚 吉,郭俊明
(宁波大学医学院, 浙江 宁波 315211)
摘 要:目的 探讨枸杞多糖 ( L y cium barbarum po ly saccharides, LBP) 对人肝癌细胞 HepG2 生长的影响及可能
机制。方法 人肝癌 HepG2 细胞用 100~ 1 000 mg / L LBP 处理 1~ 5 d, 分别用 MTT 方法、流式细胞术检测细胞
增殖、细胞周期和细胞凋亡。用 West ern blo tting 分析周期蛋白 ( cy clin) 和周期蛋白依赖性激酶 ( cy clin-dependent
kinase, CDK ) 表达的变化。结果 LBP 以质量浓度依赖方式抑制肝癌细胞的生长,阻滞细胞在 G0 / G1期,并诱导
细胞凋亡;其分子机制为引起 cyclin D、cyclin E 和 CDK2 蛋白表达下降。结论 LBP 抑制人肝癌细胞 H epG2 增
殖的机制包括阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡。
关键词:枸杞多糖; 肝癌细胞; 细胞增殖; 细胞周期; 细胞凋亡
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1501-03
枸杞 L y cium bar bar um L. 是我国传统的滋补
中药,它含有多种营养成分和微量元素,具有滋补肝
肾、益精明目、促进造血、调血脂等功效。枸杞多糖
( L y cium barbar um po lysaccharides, LBP) 是枸杞
中主要的生物活性成分, 具有广泛的药理作用,如增
强机体免疫力、延缓衰老等 [ 1]。近几年研究表明,
LBP 可抑制人肺癌[ 2] 、宫颈癌[ 3] 、前列腺癌[ 4] 和白
血病[ 5] 等多种肿瘤细胞的生长。肝癌是我国常见的
肿瘤,但 LBP 能否抑制肝癌细胞生长及其可能机
制,尚未完全阐明。本研究主要探讨 LBP 对人肝癌
细胞 HepG2 生长的影响及其机制,为 LBP 临床应
用提供依据。
1 材料与方法
1 1 材料: LBP 购自上海融禾医药科技发展有限
公司[ 6] , M TT 购自美国 Sigma 公司, RPM I 1640 培
养液购自美国生命技术公司, 人肝癌 HepG2 细胞
购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库,细胞
周期和细胞凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公司。
1 2 细胞培养: HepG2 细胞在 37 、含 5% CO2
的培养箱中培养, RPM I 1640 培养液含有 10% 小
牛血清、50 U/ mL 青霉素和 50 g / mL 链霉素。选
择对数生长期细胞用于实验,细胞分别用 100、200、
400、800、1 000 mg/ L LBP 处理[ 6] , 对照组为不含
LBP 的培养液。
1 3 MT T 法测定细胞生长情况:以每孔 1 5 104
个将细胞接种入 96 孔板, 24 h 后分别加入不同质
量浓度的 LBP 处理 1~ 5 d,每个质量浓度设 8个平
行孔。待处理时间达到要求时, 将 15 L MTT ( 5
mg/ mL) 加入到培养孔中继续培养 4 h, 再小心加
入 150 L 二甲基亚砜 ( DM SO )。水平摇床震荡
1501中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-15 基金项目:宁波大学大学生科研创新计划 ( SRIP-2009) ; 宁波大学创新性开放实验建设项目 ( Cxxkf2008-066)作者简介:黄 霞( 1987 ) ,女,四川人,本科生,主要从事抗癌药物研究。T el: ( 0574) 87600759 E-mail: xiaob ingxiu@ nbu . edu. cn
* 通讯作者 肖丙秀
10~ 15 min, 用酶标仪 (美国 Labsy stems 公司) 检
测 490 nm 波长处吸光度 ( A ) 值, 计算细胞存活率。
实验重复 3次。
细胞存活率= ( A 实验 / A对照 ) 100%
1 4 流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡: 将
HepG2 细胞接种于 50 mL 培养瓶中 24 h 后,加入
不同质量浓度的 LBP 处理 48 h, 胰酶消化后用
PBS漂洗, 调整细胞浓度为 1 106个/ mL。70% 乙
醇固定过夜, RNase A 作用, 810 L 碘化丙啶 ( PI)
作用 15 m in 以上。用 Calibur 流式细胞仪 (美国
BD 公司) 分析细胞周期的分布。细胞凋亡的检测
按照 BD公司 A nnexin V-FITC 凋亡检测试剂盒说
明书进行。
1 5 Western blot ting 检测: 将对照组和 4个不同
质量浓度 ( 200、400、800、1 000 mg/ L ) LBP 处理
48 h 的细胞分别提取蛋白质, 然后按照文献方法 [ 7]
检测细胞周期相关蛋白的表达差异。
1 6 统计学分析: 实验数据以 x s 表示, 采用
SPSS 软件包 13 0 对组间差异进行单因素方差
分析。
2 结果
2 1 人肝癌 HepG2细胞生长情况观察:显微镜下
观察到,对照组细胞生长快、贴壁情况好、细胞形态
规则、密度高;而 LBP 处理组的细胞呈不同程度的
不规则形态、贴壁细胞数量少、密度低, 高质量浓度
组可见培养瓶内悬浮死细胞。
2 2 LBP 抑制肝癌细胞的生长: M TT 结果表明,
LBP 对人肝癌 HepG2 细胞有明显抑制作用。LBP
质量浓度越大对细胞生长的抑制程度越大, 呈现时
间-剂量依赖方式抑制肝癌细胞的生长 ( P< 0 05、
0 01、0 001)。结果见图 1。
1-对照组 2~ 6- 100、200、400、800、1 000 m g L - 1 LBP
1-cont rol group 2 6-100, 200, 400, 800, and 1 000
mg L- 1 LBP
与对照组比较: * P < 0 05 * * P< 0 01 * * * P < 0001
* P< 0 05 * * P< 0 01 * * * P< 0 001 v s con tr ol group
图 1 LBP 对 HepG2 肝癌细胞生长的影响 ( x s, n= 8)
Fig. 1 Effect of LBP on growth of hepatocellular
carcinoma HepG2 cells (x s, n= 8)
2 3 LBP 使肝癌 HepG2 阻滞在 G0 / G1期:为阐明
LBP 抑制 HepG2细胞生长的机制,分析其对细胞
周期的影响。400、800 mg/ L LBP 使 G0 / G1期的细
胞明显增加 ( P< 0 05、0 01) ,见表 1。
表 1 LBP 对 HepG2 细胞周期的影响 (x s, n= 3)
Table 1 Effect of LBP on cell cycle of HepG2 cells
( x s, n= 3)
LBP/
( mg L- 1 )
细胞周期比例/ %
G0 / G 1 S G2 / M
0(对照) 70 71 0 34 26 28 1 20 3 01 0 23
200 71 27 0 63 24 42 1 52 4 31 0 65
400 73 12 0 45* 17 82 1 24* * 9 06 0 42
800 78 82 0 58* * 20 27 0 64* * 0 91 0 29*
与对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s cont rol g rou p
2 4 LBP 对细胞周期相关蛋白表达的影响: 由于
细胞周期受到周期蛋白 ( cyclin) 和周期蛋白依赖
性激酶 ( cyclin-dependent kinase, CDK) 的精确调
控,为探讨 LBP 阻滞细胞周期的分子机制,相关调
控蛋白的表达情况采用 Western blot t ing 技术进行
了分析。结果显示,当肝癌细胞被 800、1 000 mg / L
LBP 处理后, cyclin D、cyclin E 和 CDK2 的表达水
平下降 ( P< 0 05) ;其他低质量浓度未见明显的影
响,见表 2。
表 2 LBP 对 HepG2 细胞周期调控相关蛋白表达的影响
( x s, n= 3)
Table 2 Effect of LBP on related- protein expression
of cell cycle regulators in HepG2 cells
( x s, n= 3)
LBP/
( mg L- 1 )
平均吸光度
cyclin D cyclin E CDK2
0(对照) 0 610 0 043 0 554 0 046 0 607 0 027
200 0 623 0 054 0 560 0 146 0 611 0 042
400 0 602 0 035 0 548 0 073 0 612 0 014
800 0 435 0 072* 0 459 0 055* 0 431 0 048*
1 000 0 386 0 063* 0 358 0 087* 0 212 0 034* *
与对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01
* P < 0 05 * * P< 0 01 v s cont rol g rou p
2 5 LBP 诱导肝癌细胞凋亡:为了解 LBP 抑制肝
癌细胞生长的可能机制, 分析了其是否引起细胞凋
亡。流式细胞检测结果显示,高质量浓度 LBP 既可
引起肝癌细胞 HepG2 早期凋亡, 也可引起晚期凋
亡,见表 3。
3 讨论
受环境和饮食等因素的影响, 消化道肿瘤的发
病率居高不下。肝癌是我国较常见的恶性肿瘤之
一, 近年来其发病率呈现上升趋势。至今对肝癌尚
1502 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
表 3 LBP 诱导 HepG2 细胞凋亡的作用( x s, n= 3)
Table 3 Apoptosis effect induced by LBP on HepG2
cells ( x s, n= 3)
LBP/
(m g L- 1)
细胞周期比例/ %
早期凋亡 晚期凋亡
0(对照) 1 53 0 46 5 60 1 42
200 5 74 0 63 10 21 0 29
400 12 45 0 55* 14 03 0 74*
800 20 22 0 84* * 23 86 0 76* *
与对照组比较: * P< 005 * * P< 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 v s cont rol group
无有效的根治措施,寻找一种对肿瘤细胞有高效的
杀伤或抑制作用而又对正常细胞无毒性或有保护作
用的化疗药物显得比较重要和迫切 [ 2]。从具有滋补
功效的中草药中提取抗肿瘤成分引起了人们的广泛
关注,其中 LBP 就是代表性的一种[ 7] 。LBP 不仅
对机体细胞有较强的保护作用, 使受损的细胞恢复
正常功能;而且具有明显的抗肿瘤活性 [ 3]。研究发
现, LBP 对放射性治疗有明显的增敏和防护作用,
与抗癌药物联合应用可起到增效、减毒的效果 [ 6]。
为了探讨 LBP 对人类肝癌细胞的作用, 了解其
抗肿瘤机制,本实验应用不同质量浓度的 LBP 处理
人肝癌 H epG2 细胞。结果发现, LBP 对人肝癌细
胞呈剂量依赖方式的抑制作用。当 1 000 mg/ L
LBP 处理 HepG2 细胞 3 d 时, 细胞抑制率可达到
60% 以上。
由于许多中草药成分的抗癌机制是影响细胞周
期[ 6, 8] , 为此, 本研究重点考察了 LBP 对肝癌细胞周
期的影响机制。在细胞增殖过程中, G0 / G1期是准
备期,期间会合成相关的 RNA 和蛋白质。本研究
运用蛋白质印迹技术发现, LBP 明显抑制了肝癌细
胞 cyclin D、cyclin E 和 CDK2 的表达。在 G 0 / G 1
期,主要的细胞周期调控因子是 cyclin D、cyclin E
和 CDK2。cyclin E 结合 CDK2 后促进了细胞越过
G1 / S 期转折点 [ 9]。如果 cyclin E 和 CDK2 的表达
下降, 细胞将被阻止在 G0 / G1期。cyclin D 除在
G0 / G1期发挥作用外, 还具有癌基因的活性 [ 10]。因
此, LBP 引起肝癌细胞中 cyclin D、cyclin E 和
CDK2 表达的下降对于其抗癌活性的发挥起着重要
作用。
本研究同时还发现, LBP 可诱导肝癌细胞早期
凋亡和晚期凋亡。事实上, LBP 也可引起前列腺癌
细胞[ 4]和白血病细胞凋亡[ 5]。这说明, LBP 有较广
泛的抗癌谱, LBP 通过阻止细胞周期和诱导细胞凋
亡等方式抑制了多种肿瘤细胞的生长。
综上所述, LBP 通过调控细胞周期相关蛋白的
表达而阻止细胞周期的进行,同时诱导细胞凋亡,最
终抑制肝癌细胞的生长,说明 LBP 可能是一种新的
有应用前景的抗癌药物。
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