全 文 ：图 2 银杏内酯注射液的对照指纹图谱
Fig 2 HPLCReference fingerprint
of Ginkgolide Injections
种色谱柱, Thermo Hyper sil ODS ( 250 mm 4 6
mm, 5 m) (美国 T hermo HypersilKeystone 公
司) ; Luna C18 ( 250 mm 4 6 mm, 5 m) (美国
Phenomenenex 公司) ; Zorbax SB C8 ( 250 mm 4 6
mm, 5 m) (美国 Agilent公司)进行实验筛选, 比
较分离度、峰型和柱效,结果 T hermo Hypersil ODS
( 250 mm 4 6 mm, 5 m)色谱柱较为适合。
流动相的选择: 选用不同比例的水/甲醇/四氢
呋喃体系和异丙醇/水体系洗脱,峰分离度不好;用
不同比例的水/甲醇体系洗脱, 分离度和峰型不佳;
故选用甲醇/乙酸铵水溶液体系为流动相,经试验确
定了溶剂比例,峰型、分离度、柱效均满意。
参考文献:
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正交设计优选竹节参总皂苷微波提取工艺的研究
欧阳丽娜1, 2 ,李兰林1, 3 ,吴 雪1, 3 ,向大位1, 3 , 孙晓博1, 3 , 向大雄1, 3 *
( 1 中南大学湘雅二医院 中药与天然药物研究室, 湖南 长沙 410011; 2 岳阳市一人民医院 药剂科, 湖南 岳阳 414000;
3 中南大学药学院, 湖南 长沙 410013)
摘 要:目的 优选竹节人参总皂苷的微波提取工艺。方法 利用紫外分光光度法测定竹节参中总皂苷, 运用正
交试验设计,以总皂苷转移率为考察指标, 筛选最佳微波提取工艺; 并将其与加热回流提取法及超声提取法进行比
较。结果 微波提取竹节人参总皂苷的最佳提取工艺参数为: 乙醇体积分数 80% ,微波功率 400 W, 料液比 1! 18,
提取 4 次,每次提取 5 min。在此条件下,竹节人参总皂苷的转移率高达 97 77%。结论 微波提取工艺具有效率
高、时间短、能耗低、环保等优点, 为竹节人参总皂苷的工业化生产和新药开发提供了参考。
关键词:竹节人参; 总皂苷;微波提取; 正交设计;含量测定
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 10163904
竹节参为五加科植物竹节参 Panax j ap onicus
C A Mey 的干燥呈竹鞭状根茎, 广泛分布于日
本及中国西南至中部地区 [ 1] ,存在羽叶三七、狭叶竹
节参及珠子参等变种[ 2]。其性温、味甘、微苦, 具有
滋补强壮,散瘀止痛, 止血祛痰等功效[ 3] ,兼具我国
北药人参和南药三七的功用, 享有∀土家族神参#的
美誉。现代药理学研究表明,竹节参中研究最多、功
效最显著的为皂苷类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗
∃1639∃中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100227 基金项目:湖南省中医药科研计划项目( 2009062)作者简介:欧阳丽娜( 1984 % ) ,女,湖南岳阳人,主要从事药物新资源与新剂型的开发。
T el : ( 0731)5292093 Email: ouyan glina410@ 126 com
* 通讯作者 向大雄 T el: ( 0731) 5292093 Email: xiangdax ion g@ 163 com
肿瘤以及降血糖等药理活性 [ 48]。微波作为天然产
物提取中一种非常有发展潜力的新型技术, 具有快
速、溶剂用量少、提取率高、成本较低、环保等许多优
点,引起广泛关注[ 911]。为此, 本实验拟采用正交设
计方案,以总皂苷转移率为指标,优选出竹节人参总
皂苷微波提取的工艺参数,并将其与加热回流法、超
声提取法进行比较研究, 以期为竹节人参总皂苷的
工业化生产和新药开发提供实验依据。
1 仪器与试药
SPECORD50型紫外可见分光光度计(德国耶
拿分析仪器股份公司) ,恒温水浴锅(上海医疗器械
五厂) , M et tler 分析天平, RE52 % 98 旋转蒸发仪
(上海亚荣生化仪器厂) , NJL07 % 3 型微波提取器
(南京杰全微波设备有限公司) , KQ3200型超声波
清洗器(昆山市仪器超声有限公司)。
人参皂苷 Re 对照品(中国药品生物检定所产
品,批号为 7549204) , 其他乙醇、甲醇、正丁醇、香
草醛、高氯酸、冰醋酸均为分析纯。竹节参药材购于
湖北恩施圣丰药业,经中南大学湘雅药学院生药教
研室李劲平副教授鉴定为竹节参的根茎, 生药中含
总皂苷为 124 32 mg/ g。
2 方法与结果
2 1 总皂苷的测定
2 1 1 检测波长的选择:人参皂苷 Re 和样品溶液
在 400~ 700 nm 波长扫描。人参皂苷 Re对照品溶
液和竹节参样品溶液显色后的吸收光谱基本一致,
在 552 nm处有最大吸收, 故选择人参皂苷 Re 为对
照品,并选用 552 nm 作为测定波长。
2 1 2 溶液的制备:精密称定人参皂苷 Re对照品
10 12 mg , 加甲醇溶解, 定容至 10 mL, 得 1 012
mg/ mL 溶液。精密称定干燥的竹节参粉末(过 30
目筛) 20 g,分别按所设置的工艺参数进行提取, 滤
过,合并提取液,定容至 500 mL。精密量取其中 50
mL,挥干溶剂,残渣用 20 mL 水分次转移至分液漏
斗中, 用石油醚萃取 2~ 3 次, 每次 20 mL, 弃去醚
层,水层再用水饱和的正丁醇萃取 5 次, 每次 20
mL,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤 2次,
每次 30 mL, 最后将正丁醇液减压回收, 蒸干, 残渣
用甲醇溶解,滤过并定容至 50 mL。
2 1 3 标准曲线的制备: 用 20~ 200 L 可调微量
取样器吸取制备好的人参皂苷 Re 对照品溶液 40、
80、120、160、200 L 于 10 mL 具塞试管中, 70 & 水
浴蒸干,于每个试管中加新配制的 5%香草醛冰醋
酸溶液 0 2 mL,高氯酸 0 8 mL,摇匀,置 60 & 水浴
上加热 15 m in,流水冷却,准确加入冰醋酸 5 mL,摇
匀,以分光光度计在 552 nm 波长测定吸光度值。
以质量为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制标准曲线,
得回归方程 Y = 0 004 6 X - 0 001 3, R2 = 0 999
7, 表明人参皂苷 Re 在40 48~ 202 40 g 与吸光度
的线性关系良好。
2 1 4 精密度试验:精密吸取 5份人参皂苷 Re对
照品溶液 120 L,按标准曲线的制备项下的方法测
定吸光度值,计算 RSD值为 0 75%。
2 1 5 稳定性试验: 精密吸取人参皂苷 Re 对照品
溶液 120 L,按标准曲线的制备项下的方法,分别在
0、10、20、30、40、50、60、90、120 min测定吸光度值,计
算 RSD值为 1 42% ,说明在 90 min内基本稳定。
2 1 6 重现性试验: 取 5份竹节参粉末各 2 00 g,
制备供试品溶液, 每份取 50 L, 测定吸光度值, 计
算质量分数的 RSD值为 1 51%。
2 1 7 加样回收率试验:分别吸取一定量的样品溶
液,加入适量人参皂苷 Re 对照品溶液,按标准曲线
的制备项下的方法测定其吸光度, 计算其回收率为
100 46%, RSD值为 1 06%。
2 1 8 样品测定:用 20~ 200 L 可调微量取样器
吸取提取纯化后样品 50 L,置于 10 mL 具塞试管
中, 70 & 水浴蒸干,于每个试管中加新配制的5%香
草醛冰醋酸溶液 0 2 mL,高氯酸 0 8 mL, 摇匀,置
60 & 水浴上加热 15 min, 流水冷却, 准确加入冰醋
酸 5 mL,摇匀, 以分光光度计在400~ 800 nm扫描,
在 552 nm 波长处有最大吸收,记录吸光度值, 计算
竹节人参总皂苷质量浓度。
2 2 单因素试验:以溶剂体积分数、微波功率、料液
比、提取时间及提取次数作为影响竹节人参皂苷转
移率的单因素,各因素设置 4个不同的水平,分别对
20 0g 竹节参药材进行提取工艺考察, 找出不同因
素的适宜范围。
2 2 1 溶剂体积分数对皂苷提取效果的影响: 为了
研究溶剂体积分数对竹节人参皂苷提取效果的影
响,本试验设置了 4个不同的溶剂体积分数,分别为
40%、60%、80%、95%乙醇。提取功率为 300 W,温
度控制在 40~ 80 & , 料液比为 1 ! 18,每个样品提
取 3次,每次 3 m in,平行操作 3份, 测定, 计算总皂
苷的 平 均 转 移 率 分 别 为 42 73%、54 16%、
85 35%、32 48% ,结果表明 80%乙醇为最佳。
2 2 2 提取功率对皂苷提取效果的影响:为了研究
提取功率对竹节人参皂苷提取效果的影响,本试验
设置了 4个不同的提取功率,分别为 200、300、400、
∃1640∃ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
500 W。提取条件为体积分数为 80%乙醇, 温度控
制在 40~ 80 & , 料液比为 1 ! 18, 每个样品提取 3
次,每次 3 min, 平行操作 3份, 测定, 计算总皂苷的
平均转移率分别为 78 71%、85 56%、84 92%、
82 53%, 结果表明提取功率为 300 W为最佳。
2 2 3 料液比对皂苷提取效果的影响:为了研究料
液比对竹节人参皂苷提取效果的影响, 本试验设置
了 4个不同的料液比,分别为 1! 10、1! 14、1 !18、
1!22。提取条件为微波 300 W, 温度控制在 40~
80 & ,乙醇体积分数为 80% ,每个样品提取 3次, 每
次 3 min,平行操作 3份, 测定, 计算总皂苷的平均
转 移 率 分 别 为 82 72%、84 11%、85 47%、
85 96%, 结果表明料液比对实验影响不明显, 综合
考虑生产成本及操作可行性等因素, 选取 1 ! 18 为
最佳料液比。
2 2 4 提取时间对皂苷提取效果的影响: 为了研究
提取时间对竹节人参皂苷提取效果的影响,本试验设
置了 4个不同的提取时间,分别为每次提取 2、3、4、5
min。提取条件为微波 300 W, 温度控制在 40~ 80
& ,乙醇体积分数为 80%,料液比为 1!18, 每个样品
提取 3次,平行操作 3份,测定,计算总皂苷的平均转
移率分别为 7964%、85 32%、87 85%、89 48%, 结
果表明提取时间以每次提取5 min为宜。
2 2 5 提取次数对皂苷提取效果的影响: 为了研究
提取次数对竹节人参皂苷提取效果的影响,本试验设
置了 4个不同的提取次数, 分别为提取 1、2、3、4次。
提取条件为微波300 W,温度控制在 40~ 80 & , 乙醇
体积分数为 80%, 料液比为 1! 18,每个样品提取 5
min,平行操作 3份,测定,计算总皂苷的平均转移率
分别为 5329%、78 67%、89 54%、97 32%, 结果表
明提取次数以 4次时转移率最大,但是提取 3次时转
移率亦可达到85%以上,综合考虑成本、时间因素,简
化操作流程,一般选择提取 3次。
2 3 正交试验:以单因素试验结果为参考, 对乙醇
体积分数、提取功率、提取时间及提取次数进行 4因
素 3水平正交试验(表 1)。以总皂苷转移率为指标,
通过 L9 ( 34 )正交试验确定最佳提取条件。准确称取
干燥的竹节参粉末(过 30目筛) 20 g,浸渍 12 h 后,分
别按表 2的试验条件进行微波提取,每个试验条件平
行做 3份,滤过,合并滤液,转移至500 mL量瓶中,加
水稀释至刻度,摇匀,精密吸取 50 mL,测定各次提取
液中总皂苷的质量浓度,计算其平均转移率(转移率=
提取物中总皂苷质量/原药材中总皂苷质量 100%)。
结果及极差分析见表2,方差分析见表 3。
表 1 因素水平
Table 1 Factors and levels
水平 因 素
A 乙醇体积分数/ % B微波功率/ W C提取时间/ m in D 提取次数/次
1 40 300 3 2
2 60 400 4 3
3 80 500 5 4
表 2 L9 ( 34 )正交试验设计方案及结果
Table 2 Design and results of L9 ( 34 ) orthogonal test
试验号 A B C D 平均转移率/ %
( n= 3)
1 1 1 1 1 3643 ∋ 0 87
2 1 2 2 2 4821 ∋ 1 38
3 1 3 3 3 6945 ∋ 0 73
4 2 1 2 3 7356 ∋ 1 32
5 2 2 3 1 5826 ∋ 0 81
6 2 3 1 2 5333 ∋ 1 34
7 3 1 3 2 8942 ∋ 0 96
8 3 2 1 3 9457 ∋ 1 39
9 3 3 2 1 7229 ∋ 0 99
K 1 154 09 199 41 184 33 166 98
K 2 185 15 201 04 194 06 190 96
K 3 256 28 195 07 217 13 237 58
R 34 06 1 99 10 93 23 53
表 3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P值
A 1 829 67 2 914 83 1 099 03 P< 0 01
B 6 35 2 3 17 3 81 P< 0 05
C 189 19 2 94 60 113 64 P< 0 01
D 859 20 2 429 60 516 10 P< 0 01
误差 22 47 27 0 83
F0 05 ( 2, 27)= 335 F 0 01( 2, 27) = 5 49
由表 2的极差可知,各因素对竹节人参总皂苷
转移率影响大小顺序为 A(乙醇体积分数) > D(提
取次数) > C(提取时间) > B(微波功率)。表 3的方
差分析表明,乙醇体积分数、提取次数及提取时间均
对竹节人参总皂苷转移率具有极显著影响,微波功
率对竹节人参总皂苷的转移率存在明显影响。从试
验结果来看,竹节人参总皂苷微波提取的最佳工艺
条件为 A 3B2C3D3 , 即乙醇体积分数为 80%, 微波功
率 400 W,每次 4 m in,提取 4次。
按上述最佳提取工艺进行 3批药材的验证试
验, 竹节人参总皂苷的转移率分别为 98 28%、
97 16%、97 87% , RSD为 0 58%, 表明本提取工艺
较为稳定可靠,且提取率较高。
2 4 不同方法提取竹节人参总皂苷工艺的比较:将
本实验优选的微波提取工艺与文献所优选出的加热
回流提取工艺及超声提取工艺进行比较, 进行不同
提取方法的优选。
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2 4 1 加热回流提取法: 取竹节参药材粉末 20 0
g,精密称定,加 10倍量60%乙醇溶液, 浸泡 2 h后,
加热回流提取 3次, 每次 3 h,滤过, 合并提取液, 减
压浓缩后定容至 500 mL, 测定, 计算总皂苷的转移
率为 80 51%。
2 4 2 超声提取法:取竹节参药材粉末 20 0 g, 精
密称定,置具塞锥形瓶中,按固液比 1 !20加入适量
乙醇,于 50 & 提取 4次, 每次提取 40 min, 滤过, 合
并提取液,定容至 500 mL,测定,计算总皂苷的转移
率为 94 81%。
2 4 3 微波提取法:取竹节参药材粉末 20 0 g, 精
密称定, 预先浸渍 2 h,按正交试验优选的工艺参数
进行微波提取, 滤过, 合并提取液,定容至 500 mL,
测定,计算总皂苷的转移率为 97 77%。
结果表明, 微波提取与加热回流提取及超声提
取比较,竹节人参总皂苷的转移率有所提高, 且提取
时间大大缩短了,相比较之下,微波提取竹节人参总
皂苷具有提取率高、时间短、能耗低等优点。
3 讨论
微波能在短时间内穿透竹节参细胞组织内部,
使其内部分子极化迅速升温, 达到提取效果。但在
提取过程中,因乙醇沸点较低,加之皂苷具有较强表
面活性,在加热时易产生大量泡沫。故应控制好温
度范围和时间, 避免浸提溶媒沸腾逸出和有效成分
随乙醇蒸气带出,从而影响其提取。
中药材含水量的多少, 直接影响到微波提取的
效果,药材细胞内含水量充足,才能吸收足够的微波
能,细胞壁才能被击破,细胞内容物才能够得以释放
出来, 故应注意预先浸渍。此外药材粒度对微波提
取也有一定的影响。充分考虑到微波提取工艺工业
化大生产的具体操作可行性,建议在提取前将人参
原药材粉碎成药材粗粉(过 16目筛) ,浸泡于提取溶
媒中 12 h,让药材粗粉充分接触溶媒且促进溶媒渗
透于药材粗粉细胞组织内部,产生有效的体积分数
梯度,以利于有效成分的浸出,提高提取效率。
本实验以竹节人参总皂苷的转移率为指标,优
选微波提取的最佳工艺为: 乙醇体积分数为 80%,
微波功率 400 W, 料液比 1 ! 18, 提取 4次, 每次提
取 5 min。相对加热回流工艺及超声提取工艺而
言,微波提取竹节人参总皂苷的工艺提取时间短,提
取含量高,可以降低生产成本, 提高提取效率,且较
环保,具有明显的优势。而且微波提取细粉不会出
现传统提取方法的糊化、堵塞等问题,适宜大生产。
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