全 文 ：HPLC法测定丁香酚与大鼠血浆蛋白的结合率
杨晓宁1 ,禹玉洪1 ,李 　阳1 ,李雪春2
①
(11 亚宝药业集团股份有限公司研究院 ,北京 　102200 ; 21 北京迈康斯德医药技术有限公司 ,北京 　102206)
摘 　要 :目的 　研究丁香酚与大鼠血浆蛋白的结合。方法 　采用大鼠血浆平衡透析法 , HPLC 法测定透析袋两侧溶
液中丁香酚的质量浓度 ,计算丁香酚的血浆蛋白结合率。结果 　丁香酚在质量浓度为 144162、28192、5178μg/ mL 时
与血浆蛋白结合率分别为 52143 %、58160 %、61149 %。丁香酚具有中等强度的血浆蛋白结合率。结论 　HPLC 法测
定丁香酚与血浆蛋白结合率试验具有简便、快速、灵敏与选择性高的特点。
关键词 :丁香酚 ;蛋白结合率 ;高效液相色谱
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 032391203
　　丁桂儿脐贴是针对儿童常见病 ,高发病腹泻腹
痛的防治用药 ,由丁香、肉桂、荜茇组成 ,临床疗效
好。丁香是本品的君药 ,其所含挥发油具有抗菌、抗
病毒、局麻、镇痛、清除氧自由基等作用[1 ] ,而其挥发
油中丁香酚约占 80 %。本实验采用平衡透析法研
究丁香酚与大鼠血浆的蛋白结合率[2 ] ,为进一步开
展丁桂儿脐贴中丁香酚的药动学研究提供参考。
1 　仪器与材料
Agilent 1200 高效液相色谱仪 ; T GL —16 G 高
速离心机 (上海安亭科学仪器厂) ; Vortex —5 涡旋
混合器 (金坛市盛蓝仪器制造有限公司) ;半透膜 (直
径 217 cm ,长 10 cm ,美国 Solarbio 公司) 。
丁香酚对照品购自中国药品生物制品检定所 ,
批号 07252200209 ;内标物对羟基苯甲酸甲酯对照
品购自中国药品生物制品检定所 ,批号 1002782
200402 ;乙腈 (色谱纯 ,美国霍尼韦尔公司) ,超纯水 ,
其他试剂均为分析纯。
Wistar 大鼠 ,180～220 g ,雌雄并用 ,由北京维
通利华实验动物技术有限公司提供 ,合格证号 :
SCXX(京) 200720001。
2 　方法与结果
211 　溶液的配制
21111 　对照品溶液的制备 :精密称取丁香酚对照品
36116 mg ,置 10 mL 量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇
匀 ,即得。
21112 　内标溶液的配制 :取对羟基苯甲酸甲酯
14180 mg ,精密称定 ,置 100 mL 量瓶中 ,加甲醇溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 148100μg/ mL 内标溶液。
21113 　透析液的配制 :取磷酸二氢钾 2172 g ,氯化钠
818 g ,加入 011 mol/ L 氢氧化钠溶液适量 ,调节 p H
值至 714 ,补水至 1 000 mL ,即得 0102 mol/ L 磷酸盐
缓冲液 (内含 0115 mol/ L 氯化钠) ,作为透析液。
212 　色谱条件 :Agilent Zorbax Eclip se XDB2C18色
谱柱 (150 mm ×416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈 (A)2
011 %磷酸溶液 (B) ,梯度洗脱 ,0 →20 min (A20 % →
80 %) ,20 →30 min (A80 % →20 %) ;检测波长为 260
nm ;进样量 :10μL 。理论板数按丁香酚峰计算应不
低于 1 500。见图 1。
A2丁香酚对照品和内标　B2空白血浆　C2丁香酚对照品和内标的磷酸盐溶液　D2丁香酚对照品和内标的血浆溶液　12内标　22丁香酚
A2eugenol reference substance and internal standard 　B2blank plasma 　C2phosphatic buffer added eugenol reference substance and internal
standard 　D2blank plasma added eugenol reference substance and internal standard 　12internal standard 　22eugenol
图 1 　大鼠血浆蛋白结合率的 HPLC色谱图
Fig. 1 　HPLC Chromatograms of protein binding rate in plasma of rats
·193·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
①收稿日期 :2009210215　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :杨晓宁 (1977 —) ,女 ,北京人 ,在职硕士 ,工程师 ,中药室项目经理 ,从事研究方向为中药复方新药研发。
Tel : (010) 89705573 　E2mail :yn3528 @yahoo1com1cn
213 　样品处理
21311 　血浆样品的处理 :取大鼠血浆 200μL ,加入
内标溶液 50μL 、011 mol/ L 盐酸溶液 50μL ,加甲
醇 015 mL 沉淀血浆蛋白 ,涡旋混合 30 s ,以 12 000
r/ min 离心 5 min ,取上清液 ,即得。
21312 　透析液样品的处理 :取透析外液 200μL ,加
入内标溶液 50μL 、011 mol/ L 盐酸溶液 50μL ,加
入甲醇 015 mL ,涡旋混合 30 s ,以 12 000 r/ min 离
心 5 min ,取上清液 ,即得。
214 　线性关系考察[3 ]
21411 　丁香酚在血浆中的标准曲线 :取丁香酚的储
备液适量 ,用甲醇稀释成系列对照品溶液 ,取 200
μL 空白血浆 6 份 ,分别加入丁香酚的系列对照品溶
液 50μL ,配成相当于 723111、144162、28192、5178、
1116、0123μg/ mL 的血浆样品 ,按血浆样品的处理
项下方法操作 ,取 10μL 进样分析。以丁香酚与内
标的峰面积比值对质量浓度进行线性回归 ,计算回
归方程为 Y = 01 001 6 X + 01001 1 , r = 01999 9 ,线
性范围为 0123～723111μg/ mL 。
21412 　丁香酚在透析液中的标准曲线 :取丁香酚的
储备液适量 ,用甲醇稀释成系列对照品溶液 ,取 200
μL 空白磷酸盐缓冲液 6 份 ,分别加入丁香酚的系列
对照品溶液 50 μL ,配成相当于 723111、144162、
28192、5178、1116、0123 μg/ mL 的透析液样品 ,照
透析液样品的处理项下方法操作 ,取 10μL 进样分
析。以丁香酚与内标的峰面积比值对质量浓度进行
线性回归 ,计算回归方程为 Y = 01001 7 X - 01009 ,
r = 01999 5 ,线性范围为 0123～723111μg/ mL 。
215 　准确度试验 :分别在空白血浆、透析液中加入
丁香酚对照品溶液 ,使其质量浓度分别为 144162、
28192、5178μg/ mL ,每个质量浓度平行作 6 份 ,按
样品处理项下方法操作 ,进行 H PL C 分析 ,以当日
的标准曲线计算丁香酚实测值 ,计算相对回收率 (相
对回收率 = C实测 / C理论 ×100 %) 。结果血浆高、中、
低 3 个质量浓度的相对回收率分别为 100110 %、
97174 %、103102 % , RSD 分别为 3163 %、4142 %、
5149 %。透析液高、中、低 3 个质量浓度的相对回收
率分别为 97186 %、98107 %、99188 % , RSD 分别为
1111 %、2144 %、2153 %。
216 　精密度试验[4 ]
21611 　日内精密度试验 :分别在空白血浆、透析液
中加入丁香酚对照品溶液 ,使其质量浓度分别为
144162、28192、5178μg/ mL ,每个质量浓度平行作
6 份 ,按样品处理项下方法操作 ,进行 HPL C 分析 ,
每个样品进样 3 次 ,在一天内用同台仪器和当日的
标准曲线测定并计算日内精密度。结果血浆高、中、
低 3 种质量浓度的 RSD 值分别为 0140 %、0159 %、
4158 % ;透析液高、中、低 3 种质量浓度的 RSD 值分
别为 0153 %、0146 %、4191 %。
21612 　日间精密度试验 :同 21611 项下方法制备血
浆样品及透析液样品 ,每种质量浓度 6 份 ,每份进样
3 次 ,连续 3 d 用同一台仪器及当日标准曲线进行测
定并求算日间精密度 ,结果血浆高、中、低 3 种质量
浓度的 RSD 值分别为 3127 %、2107 %、0182 % ;透
析液高、中、低 3 种质量浓度的 RSD 值分别为
4169 %、0160 %、3129 %。
217 　稳定性试验
21711 　短期稳定性试验 :分别在空白血浆、透析液
中加入丁香酚对照品溶液 ,使其质量浓度分别为
144162、28192、5178μg/ mL ,每个质量浓度平行作
6 份 ,按样品处理项下方法操作 ,样品于室温下保
存 ,分别于 0、2、6、10、16、24 h 进行 HPL C 分析。以
当日标准曲线计算 ,结果血浆高、中、低 3 个质量浓
度的 RSD 值分别为 0157 %、2115 %、3179 % ;透析
液高、中、低 3 个质量浓度的 RSD 值分别为
0148 %、2130 %、4140 % ,表明该样品在室温下 24 h
内稳定。
21712 　长期稳定性试验 :同 21711 项下方法制备
高、中、低 3 个质量浓度的血浆样品及透析液样品 ,
每个质量浓度作 1 份 ,样品于 - 20 ℃保存 ,分别于
0、1、2、3、4、6 d 取出解冻 ,按样品处理项下操作 ,进
行 HPL C 分析。以当日标准曲线计算 ,结果血浆 3
个质量浓度的 RSD 值分别为 3173 %、1108 %、
3136 % ;透析液 3 个质量浓度的 RSD 值分别为
1120 %、0119 %、2147 % ,表明该样品在 - 20 ℃冷藏
稳定。
218 　提取回收率试验 :取空白血浆 200μL ,按血浆
药物质量浓度配成 144162、28192、5178 μg/ mL 3
种血浆样品 ,按样品处理项下操作 ,取 10μL 进行
HPL C 分析 ;另取空白血浆 200μL ,不加丁香酚对
照品 ,按样品处理项下操作 ,吸取全部离心所得上清
液 ,分别加入丁香酚对照品溶液 ,使其质量浓度分别
为 144162、28192、5178 μg/ mL , 取 10 μL 进行
HPL C 分析 ,计算提取回收率。结果 3 个质量浓度
血浆样品的提取回收率分别为 84138 %、91107 %、
92192 %。
219 　血浆蛋白结合率的测定[ 5 ,6 ] :将管状透析袋一
端用线结扎使不漏液 ,用移液管精密量取大鼠血浆
·293· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月
样本 1 mL 加入透析袋中 ,另一端折叠并用线结扎
袋口 ,袋内保留少量空气 ,使透析袋能悬浮在透析液
中。将透析袋置于盛有 10 mL 透析液的广口瓶中 ,
调节袋内外液面高度 ,使保持同一水平 ,透析袋不要
靠着玻璃壁 ,以免影响透析效果。加入丁香酚对照
品溶液适量 , 使透析外液的质量浓度分别为
144162、28192、5178μg/ mL ,最后用封口膜封住瓶
口。到达平衡时间后 ,吸出袋外少量透析液 ,加等量
10 %高氯酸溶液 ,检查有无血浆蛋白漏出。若袋外
透析液蛋白检查阳性 ,则该样本作废。取出透析袋 ,
用滤纸吸干附着于袋外壁上的透析液 ,取出血浆样
品。分别精密吸取血浆样本 200 μL 、袋外透析液
200μL ,按样品处理项下操作 ,分别测定透析袋内、
外丁香酚质量浓度 ,计算蛋白结合率 ,结果见表 1。
蛋白结合率 = (袋内血浆药物质量浓度 - 袋外透析液药
物质量浓度) / 袋内血浆药物质量浓度 ×100 %
表 1 　丁香酚在大鼠血浆中的蛋白结合率( n = 3)
Table 1 　Protein binding rates of eugenol in plasma
of rats ( n = 3)
丁香酚的质量浓度/ (μg ·mL - 1)
透析液浓度
袋内血浆
药物浓度
袋外透析液
药物浓度
蛋白结合
率/ %
1441 62 175114 ±111 65 82189 ±3113 52143 ±4171
281 92 41100 ±11 10 16197 ±0137 58160 ±0197
51 78 10165 ±01 22 4110 ±0111 61149 ±1178
2110 　平衡时间的确定[7 ] :在透析袋内以 1 mL 透
析液代替血浆 , 透析外液的质量浓度分别为
144162、28192、5178μg/ mL ,测定透析袋内外丁香
酚质量浓度 ,以当日标准曲线计算透析袋内外丁香
酚质量浓度 ,以二者质量浓度比值确定药物从袋内
外自由扩散达到平衡的时间。结果 40 h 袋内外溶
液中丁香酚的质量浓度相等 ,表明扩散 40 h 己达到
平衡 ,因此设定平衡透析时间为 40 h。结果见表 2。
表 2 　平衡时间的考察( n = 3)
Table 2 　Equilibrium time ( n = 3)
透析液浓度/
(μg ·mL - 1)
透析袋内外浓度比值
24 h 32 h 40 h
144162 01 72 0189 11 01
28192 01 78 0186 11 02
5178 01 75 0181 11 01
3 　讨论
平衡透析法的平衡温度一般可选在 37 ℃或4 ℃
恒温条件下测定。实验中发现在 37 ℃下样本达到平
衡时间较短 ,但是血浆被细菌污染 ,且丁香酚具有挥
发性 ,试验数据不准确 ,所以选择在 4 ℃下进行。
比较了甲醇、乙酸乙酯、盐酸溶液对血浆中丁香
酚的提取率 ,发现使用甲醇和盐酸溶液组合提取率
最高 ,处理方法简便 ,且测定无干扰。
本研究结果显示 , HPL C 法测定丁桂儿脐贴中
丁香酚与血浆蛋白结合率试验具有简便、快速、灵敏
与选择性高的特点。丁香酚与大鼠血浆蛋白具有中
等强度的蛋白结合率 ,在试验浓度范围内 ,蛋白结合
率与透析液的药物浓度无关。
参考文献
[ 1 ] 　彭宅彪 ,张琼光 ,代虹健 ,等 1 丁香酚的药理学研究进展 [J ]1
时珍国医国药 ,2006 ,17 (10) :2079220811
[ 2 ] 　刘　睿 ,谢跃生 ,潘桂湘 ,等1 药物血浆蛋白结合率测定方法的
研究进展 [J ]1 天津中医药 ,2007 ,24 (6) :52625281
[ 3 ] 　斯陆勤 ,李　高 ,陈　鹰 ,等1 高效液相色谱法测定美林洛尔与
人血浆蛋白的结合率 [J ]1 中国医院药学杂志 ,2006 ,26 (3) :
25322551
[ 4 ] 　曹露晔 ,陈子君 ,李云森 ,等1 高效液相色谱法研究蓝萼甲素与
大鼠血浆蛋白的结合率[J ]1 中草药 ,2007 ,38 (5) :69326951
[ 5 ] 　陈　奇1 中药药理研究方法学[ M ]1 第 2 版1 北京 :人民卫生
出版社 ,20061
[ 6 ] 　徐叔云 ,卞如濂 ,陈　修1 药理实验方法学 [ M ]1 第 3 版 1 北
京 :人民卫生出版社 , 20051
[ 7 ] 　刘　杨 ,林建阳 ,陈晓辉 ,等1 白藜芦醇衍生物 R T2B 与大鼠血
浆蛋白结合率的测定[J ]1 中国新药与临床杂志 ,2008 ,27 (6) :
40324061
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·393·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 3 期 2010 年 3 月