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Chemical constituents and bioactivity of Teucrium pilosum

长毛香科科化学成分及生物活性研究



全 文 :长毛香科科化学成分及生物活性研究
牟明月1,4,张前军1,康文艺3,皮科2,陈青1,姚蓉君1
(1.贵州大学 化学化工院,贵州 贵阳 550025;2.贵州大学 精细化工研究开发中心,贵州 贵阳 550025;
3.河南大学 天然药物研究所,河南 开封 475004;4.贵州茅台酒股份有限公司,贵州 仁怀 564501)
[摘要] 目的:研究长毛香科科化学成分及生物活性。方法:采用各种色谱法分离,运用多种波谱技术和X衍射鉴定结
构;利用体外DPPH微量抗氧化模型、α葡萄糖苷酶抑制模型和纸片扩散法进行抑菌活性筛选。结果:从长毛香科科醋酸乙酯
部位分离鉴定了8个化合物:三(十八酸)甘油酯(1),2,5二氧环戊酮(2),羊齿烯醇(3),Δ5,22豆甾烯醇(4),24去亚甲胆甾
5,22(E)二烯3β醇(5),α菠菜甾醇(6),3,4二羟基苯丙烯酸乙二醇单酯(7),3,4二羟基苯丙烯酸(8)。结论:化合物1~8
为首次从该属中分离得到。生物活性测试结果表明化合物3[IC50=(3763±345)mg·L
-1],6[IC50=(17892±499)mg·
L-1]和8[IC50=(4432±702)mg·L
-1]体外抑制 α糖苷酶抑制活性远高于对照 acarbose[IC50=(108127±123)mg·
L-1];化合物7[IC50=(481±096)mg·L
-1]和8[IC50=(416±011)mg·L
-1]抗氧化活性高于对照BHT[IC50=(3564±
036)mg·L-1]和BHA[IC50=(874±039)mg·L
-1];化合物5~8均对小麦赤霉病有明显的抑制活性;化合物5和8对番
茄灰霉病菌有明显抑制效果。
[关键词] 长毛香科科;甾醇;3,4二羟基苯丙烯酸;生物活性
[收稿日期] 20090421
[基金项目] 贵州省自然科学基金项目(黔科合字 J[2006]2008
号)
[通信作者] 张前军,教授。Tel:13007880021,Email:qianjunzhang@
126.com
[作者简介] 牟明月,硕士研究生,研究方向:天然产物与仿生农药
研究
  唇形科Labiatae香科科属植物长毛香科科 Teu
criumpilosum(Pamp.)CYWuetS.Chow又名毛薄
荷、铁马鞭,主要分布于浙江、江西、湖北、湖南、广
西、四川、贵州等地,味辛,微苦,性凉,具有清热解
毒、发表散寒、健脾利湿等功效[1]。民间用于治疗
风热感冒、咽喉肿痛、痄腮等症[2]。文献研究未见
该植物的化学成分报道。为系统地研究其有效成
分,作者对黔产长毛香科科的化学成分及生物活性
进行研究,从醋酸乙酯部位分离得到8个化合物,所
有化合物均为首次从该属植物中分离得到。生物活
性测试结果表明化合物3[IC50=(3763±345)mg
·L-1],6[IC50=(17892±499)mg·L
-1]和 8
[IC50=(4432±702)mg·L
-1]体外抑制 α糖苷
酶抑 制 活 性 远 高 于 对 照 acarbose[IC50 =
(108127±123)mg·L-1];化合物 7[IC50 =
(481±096)mg·L-1]和8[IC50=(416±011)
mg· L-1]抗氧化活性高于对照 BHT[IC50 =
(3564±036)mg·L-1]和 BHA[IC50=(874±
039)mg·L-1];化合物5~8均对小麦赤霉病有明
显的抑制活性;化合物5和8对番茄灰霉病菌有明
显抑制效果。
1 材料
X4数字显示显微熔点测定仪(温度计未校正,
北京泰克仪器有限公司);JOELECX500型 500
MHz核磁共振仪(TMS为内标);HPMS5973质谱
仪;UV2000(UNICO)。柱色谱用硅胶及高效薄层
硅胶板均为青岛海洋化工厂出品。SephadexLH20
(GE公司);α葡萄糖苷酶(Sigma公司),对硝基苯
基αD吡喃葡萄糖苷(PNPG,Sigma公司),磷酸盐
缓冲液(pH68),阿卡波糖(Sigma公司),DPPH
(Sigma公司),BHA(Sigma公司),PG(Sigma公
司)。
长毛香科科采自贵州省贵阳市,经贵阳医学院
陈德媛教授鉴定为唇形科香科科属植物长毛香科科
T.pilosum的全草,标本(No060701)存于贵州大学
化学化工学院化学系。
2 提取分离
取长毛香科科全株(30kg),干燥,粉碎,75%乙
醇冷浸3次,每次10d,减压回收溶剂,得浸膏。将
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浸膏分散于水,依次用醋酸乙酯、正丁醇萃取,得醋
酸乙酯部分,正丁醇部分。醋酸乙酯部分拌样后上
硅胶柱色谱,用石油醚醋酸乙酯(100∶1~0∶1)梯度
洗脱得到A~E5个部分。A部分拌样上硅胶柱色
谱,用石油醚醋酸乙酯(20∶1)洗脱得到白色蜡状固
体,抽滤后用石油醚重结晶得到化合物1(22mg);B
部分上硅胶柱色谱,用石油醚醋酸乙酯(15∶1)洗脱
得到化合物2(860mg),3(146mg);C部分上硅胶
柱色谱,用石油醚醋酸乙酯(10∶1)洗脱得到白色针
晶,用石油醚醋酸乙酯重结晶得到化合物 4(132
mg);D部分上硅胶柱色谱,用石油醚醋酸乙酯(8∶
1)洗脱得到化合物 5(42mg);E部分上硅胶柱色
谱,用石油醚醋酸乙酯(5∶1)洗脱,重结晶依次得到
化合物6(88mg),7(250mg)和8(180mg)。
3 结构鉴定
化合物1 白色蜡状粉末,mp74~75℃。EI
MSm/z283,267,256,239,155,137,99,89,85,71,
57,41;1HNMR(CDCl3,500MHz)δ:087(9H,t,
C18,C′18,C″18H),088(6H,m,C17,C′17,C″17H),
125~128(78H,s,C416,C′416,C″416H),161
(6H,m,C3,C′3,C″3H),232(6H,t,J=75,75
Hz,C2,C′2,C″2H),430(2H,dd,J=78,24Hz,α
H),436(2H,dd,J=78,28Hz,γH),541(1H,
m,βH);13CNMR(CDCl3,125MHz)δ:625(α,γ
C),705(βC),1753(C1′),1736(C1,1″),342
(C2,2″),297~298(C3~15,3~15′,3~15″),
249(C16,16′,16″),228(C17,17′,17″),142(C
18,18′,18″)。与文献[3]报道的三棕榈酸甘油酯波
谱数据相似,只是1HNMR在125~128H质子的
总数多12个,13CNMR在297~298多6个,由以
上数据鉴定为三(十八酸)甘油酯(glyceryltristear
ate)。
化合物2 无色柱状晶体,mp38~40℃。EI
MSm/z88[M]+,73,69,43,29,26;1HNMR
(CDCl3,500MHz)δ:460(2H,s,C2,C3H);
13C
NMR(CDCl3,125,MHz)δ:1557(C1),648(C2,
3)。根据以上波谱数据鉴定为2,5二氧环戊酮(2,
5dioxolanone)。
化合物3 白色粉末,mp199~200℃。EIMS
m/z426[M]+,411,393,265,341,273,259,241,
215,187,149,137,119,95,81;1HNMR(CDCl3,500
MHz)δ:074(63H,d,J=126Hz,2×CH3),081
(6H,s,2×CH3),086,088,096,106(each3H,
s,4×CH3),320(1H,m,C3H),529(1H,m,C11
H)。以上数据与文献[45]中报道的羊齿烯醇一
致,故判断化合物3为羊齿烯醇(fernenol)。
化合物4 白色针晶(石油醚醋酸乙酯),mp
153~155℃。EIMSm/z412[M]+,397,379,314,
300,271,255,231,225,181,175,119,95,93,66,55,
31;1HNMR(CDCl3,500MHz)δ:351(1H,m,C3
H),470(1H,dd,J=88,156Hz,C23H),510
(1H,dd,J=88,154Hz,C6H),535(1H,d,J=
56Hz,C22H);
13CNMR(CDCl3,125MHz)δ:373
(C1),317(C2),719(C3),424(C4),1384
(C5),1218(C6),320(C7),320(C8),502
(C9),373(C10),212(C11),398(C12),424
(C13),569(C14),244(C15),317(C16),
568(C17),121(C18),194(C19),403(C
29),212(C21),1373(C22),1293(C23),513
(C24),320(C25),212(C26),190(C27),
254(C28),123(C29)以上数据与文献[6]报
道的数据一致,故鉴定为 Δ5,22豆甾烯醇(stigmasta
5,22dien3βol)。
化合物5 白色粉末,mp136~138℃。EIMS
m/z370[M]+,355,352,337,300,285,271,255,
231;1HNMR(CDCl3,500MHz)δ:070(3H,s,C18
H),084(6H,d,J=68Hz,C25,C26H),104(3H,
s,C19H),094(3H,d,J=66Hz,C21H),353
(1H,m,C3H),509(1H,d,J=98Hz,C22H),
535(1H,d,J=86Hz,C23H);
13CNMR(CDCl3,
125MHz)δ:290(C1),319(C2),718(C3),
406(C4),1423(C5),1217(C6),317(C7),
320(C8),572(C9),270(C10),244(C11),
568(C12),424(C13),211(C14),502(C
15),244(C16),397(C17),121(C18),131
(C19),396(C20),195(C21),1409(C22),
1273(C23),268(C24),211(C25),226(C
26)以上数据与文献[78]报道的数据一致,故鉴
定为24去亚甲胆甾5,22(E)二烯3β醇[24nor
cholesta5,22(E)dien3βol]。
化合物6 白色粉末,mp163~164℃。EIMS
m/z412[M]+,379,363,271,81,55,41;1HNMR
(CDCl3,500MHz)δ:060(3H,s,C19CH3),081
(3H,s,C27H),101(3H,d,J=68Hz,CH3),
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352(1H,m,C3H),520(1H,brs,C7H),4,70
(1H,dd,J=154,88Hz,C23H)。以上数据与文
献[910]中报道的α菠菜甾醇一致,故确定为 α菠
菜甾醇(αspinasterol)。
化合物7 黄色粉末。EIMSm/z224[M]+,
180,163,134,117,89,77,63,51;1HNMR(CDCl3,
500MHz)δ:329(1H,m,OHH),377(2H,m,C2′
H),421(2H,m,C1′H),627(1H,d,J=155Hz,
C8H),675(1H,d,J=86Hz,C5H),692(1H,
dd,J=22,76Hz,C6H),701(1H,d,J=23Hz,
C2H),756(1H,d,J=160Hz,C7H)。
13CNMR
(CDCl3,125MHz)δ:1264(C1),656(C1′),
1137(C2),598(C2′),1483(C3),1457(C
4),1152(C5),1216(C6),1455(C7),1138
(C8),1680(C9)以上数据与文献[11]中报道
的3,4二羟基苯丙烯酸乙二醇单酯一致,故确定为
3,4二羟基苯丙烯酸乙二醇单酯[ethyleneglycol
mon(3,4dihydroxyphenyl)acrylate]。
X衍射分析:黄色片状晶体(CHCl3),通过X射
线单晶衍射确证了其结构,该化合物 C11H12O5属于
三斜晶系,空间群为P1,其中a=51213(13),b=
8404(2),c=13054(3),α=99035(9),β=
101236(9),γ=106163(10),晶胞体积 V=5158
(2)nm,晶胞内分子数Z=2,Dcalc=1444g·cm
-3,
R1=00439,wR1=01225,R2=00518,wR2=
01287。见图1。
图1 化合物7的分子结构立体投影图
  化合物8 黄色粉末。EIMSm/z180[M]+,
163,145,134,117,89,77,63,51;1HNMR(CDCl3,
500MHz)δ:620(1H,d,J=161Hz,C8H),675
(1H,d,J=80Hz,C5H),691(1H,dd,J=22,
76Hz,C6H),701(1H,d,J=23Hz,C2H),751
(1H,d,J=161Hz,C7H)。
13CNMR(CDCl3,125
MHz)δ:1265(C1),1137(C2),1481(C3)
1457(C4),1152(C5),1215(C6),1455(C
7),1142(C8),1697(C9)。化合物8与7的质
谱、氢谱和碳谱对比:化合物 8的分子离子峰为
180,化合物7的分子离子峰为224,化合物8的氢
谱在35~45没有峰出现,化合物8的碳谱在60
附近有2个 C信号而化合物7没有,其余信号峰完
全一致。故推断化合物 8为 3,4二羟基苯丙烯酸
(E)3(3,4dihydroxyphenyl)acrylicacid)。
4 活性研究
4.1 体外抑制 α葡萄糖糖苷酶活性 按文献
[12],以PNPG为底物,阿卡波糖(acarbose)作为阳
性对照测定体外抑制 α葡萄糖苷酶的活性。反应
体系:0112mL磷酸钾缓冲液(pH68),加入
0020mL02U·mL-1 αglucosidase,0008mL
DMSO,37℃恒温15min后加入0020mL00025
mol·L-1PNPG,37℃恒温反应 15min。再加入
0080mL02mol·L-1的 Na2CO3溶液,于405nm
波长下测A值。酶活力单位定义:37℃,pH68条
件下,每分钟水解底物所产生0001mol对硝基苯
酚的酶量,规定为一个酶活力单位(U)。
结果用百分抑制率(I%)和半数抑制浓度(IC50
值)进行评价。I%按下面公式计算:
I%=[1(A样品 -A样空)/(A阴性 -A空白)]×100%
初筛浓度为50mg·L-1,并对初筛抑制率大于
50%的化合物进行复筛,筛选结果如下表1。
表1 α糖苷酶活性筛选结果
化合物 I% 是否复筛 IC50/mg·L-1
3 8714 + 3763±345
4 1754 - -
6 5065 + 17892±499
7 683 - -
8 7758 + 4432±702
  注:初筛质量浓度为 50mg·L-1,阳性对照 acarboseIC50为
(108127±123)mg·L-1。
4.2 抗氧化活性试验 按文献[13]的方法进行抗
氧化活性筛选,按照最佳实验条件,即DPPH的浓度
为200μmol·L-1,加入量为 0175mL,反应 20
min。取001mL样品加入0175mLDPPH甲醇溶
液(200μmol·L-1),混匀,20min后测定515nm处
A值;结果用 Trolox(等价抗氧化能力)当量 TEAC
(troloxequivalentantioxidantcapacity水溶性维生素
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E等价抗氧化能力)表示。由公式1计算自由基清
除率:
DPPHradicalscavengingrate(%)=[(Acontrol-Asample)/
Acontrol]×100                 (式1)
式中,Acontrol为 DPPH本身在测定波长的吸收
度,Asample为样品对 DPPH作用后的吸收度数值(除
去样品自身吸收)。
选用Trolox,PG,BHA和BHT为阳性对照,其筛
选结果如下表2。
表2 抗氧化DPPH法筛选结果
样品

/%
是否
复筛
IC50
/mg·L-1
TEAC
/μmol·g-1
Trolox - - 11343±099 1
PG - - 309±059 1468214
BHA - - 874±039 519096
BHT - - 3564±036 2355182
3 1277 - - -
5 152 - - -
7 9036 + 481±096 943864
8 9058 + 416±011 1090243
  注:Trolox,PG,BHA,BHT为阳性对照,初筛质量浓度为 mg·
L-1(终浓度5405mg·L-1)。
4.3 抑菌活性试验 按文献[14]的纸片扩散法进
行抑菌试验,对化合物5~8进行小麦赤霉病、玉
米斑枯病、番茄灰霉病菌抑制活性筛选,测量抑菌
圈的直径 d(cm),对产生明显抑菌圈 (d>10
cm)的化合物视为有明显抑菌活性。其初筛结果
如下表3。
表3 抑菌活性筛选结果 cm
化合物 小麦赤霉病 玉米斑枯病 番茄灰霉病菌
5 21 - 21
6 18 - -
7 11 - -
8 15 - 15
  注:“-”表示无抑菌作用,初筛质量浓度为1g·L-1。
4.4 讨论
化合物3[IC50=(3763±345)mg·L
-1]和8
[IC50=(4432±702)mg·L
-1]α糖苷酶抑制活
性最好,其次为化合物 6[IC50 =(17892±
499)mg·L-1];化合物7[IC50=(481±096)mg
·L-1]和化合8[IC50=(416±011)mg·L
-1]表
现出非常显著的抗氧化活性;化合物5~8均对小麦
赤霉病有明显的抑制活性,抑菌圈直径在11~21
cm。筛选的所有化合物对玉米斑枯病均无明显抑
制效果,化合物5和8对番茄灰霉病菌有明显抑制
效果,抑菌圈直径为21cm和15cm。
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第34卷第17期
2009年9月
                           
Vol.34,Issue 17
 September,2009
ChemicalconstituentsandbioactivityofTeucriumpilosum
MOUMingyue2,4,ZHANGQianjun1,KANGWenyi3,PIKe2,CHENQing1,YAORongjun1
(1.SchoolofChemistry&ChemicalEngineeringofGuizhouUniversity,Guiyang550025,China;
2.ResearchandDevelopmentCenterofFineChemicalsofGuizhouUniversity,Guiyang550025,China;
3.InstituteofNaturalProducts,HenanUniversity,Kaifeng475004,China;
4.MaotaiCo.Ltd.,Renhuai564501,China)
[Abstract] Objective:TostudythechemicalconstituentsandbioactivityofTeuriumpilosum.Method:Variouscolumnchro
matographictechniqueswereusedtoisolatetheconstituents.AcombinationofEIMS,NMRspectroscopyandXRaywereappliedto
identifythestructures.Theantimicroorganismwasaccomplishedbydiskdifusionmethod,theantioxidantactivitywasassayedbythe
DPPHmicroanalysismodelsandtheinhibitoryactivityofαglucosidasewasscreenedInvitro.Result:Eightcompoundswereisolated
andidentifiedas:glyceryltristearate(1),2,5dioxolanone(2),fernenol(3),stigmasta5,22dien3βol(4),24norcholesta5,22
(E)dien3βol(5),αspinasterol(6),(3,4dihydroxyphenyl)acrylate(7),3,4dihydroxyphenylacrylicacid(8).Conclusion:
Alcompoundshavebeenisolatedfromthegenusforthefirsttime.Compound3[IC50=(3763±345)mg·L
-1],6[IC50=
(17892±499)mg·L-1]and8[IC50=(4432±702)mg·L
-1]areofhigherinhibitoryαglucosidaseactivitythanthatof
acarbose[IC50=(108127±123)mg·L
-1].Compound7[IC50=(481±096)mg·L
-1]and8[IC50=(416±011)mg·
L-1]showedhigherantioxidantactivitythanthatofBHT[IC50=(3564±036)mg·L
-1]andBHA[IC50=(874±039)mg·
L-1].Compound58exhibitedinhibitoryactivityagainstFusariumgraminearum.Compound5and8showedinhibitoryactivityagainst
Botrytiscinerea.
[Keywords] Teucriumpilosum;sterol;3,4dihydroxyphenylacrylicacid;bioactivity
[责任编辑 王亚君]
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