全 文 ：鸡内金的分子鉴定研究
曲萌１，崔继春２，董志恒１，张丽华１，王冰梅１，张吉林１，李才２
（１北华大学 医学部，吉林 吉林 １３２０１３；２吉林化工二院，吉林 吉林 １３２００１）
［摘要］ 目的：建立一种简便、实用、准确的鸡内金药材 ＤＮＡ分子标记鉴定方法，从而为建立鸡内金真伪鉴别方法
奠定基础。方法：从 Ｇｅｎｂａｎｋ数据库下载家鸡及３种常见伪内金源动物的 ｍｔＤＮＡ细胞色素 ｂ基因序列，经同位置序列
比较，遵循引物设计原则选择一个差异点较多的片段，设计 ＰＣＲ引物（引物１，２），并使用该引物分别扩增家鸡、３种伪
内金源动物，４种非伪内金源动物的 ＤＮＡ。结果：所设计的引物只扩增家鸡 ＤＮＡ，而不扩增其他动物 ＤＮＡ。结论：该引
物具有特异性，可用于鸡内金药材的鉴定。
［关键词］ 鸡内金；ＰＣＲ扩增；线粒体 ＤＮＡ；种属特异性引物
［收稿日期］ ２００９０３１６
［基金项目］ 吉林省教育厅课题（吉教合字２００６第自５２号）
［通信作者］ 曲萌，主要从事分子生物学研究，Ｔｅｌ：（０４３２）
６６０５０３９，Ｅｍａｉｌ：ｄｚｈｑｍ＠ｄｚｈｃｏｍｃｎ
鸡内金（ｃｏｒｉｕｍｓｔｏｍａｃｈｉｕｍｇａｌｉ）为雉科鸡的
干燥沙囊胃内壁，具有健胃消食的作用，可用于
食积不消、呕吐泻痢、小儿疳积、食欲不振、积滞
腹胀、遗尿等，还可用于治疗慢性肝炎［１］。此外，
还有学者报道鸡内金具有降脂、抗凝等作用［２］，
是临床的常用药，且价格便宜，但由于其来源不
易，故市场上常有假货、伪货出现。伪品来源主
要有两类，一类为腐竹或质轻的豆制类伪品，通
过性状特征可鉴别，另一类为鸭、鹅的内金，通过
理化性状不易鉴别，且目前缺少鸡内金的鉴别标
准，给药检工作带来很大困难。
近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，
以药材基因型特征为鉴定指标的分子生物学鉴
别方法以其准确可靠的特点在中药鉴定中得到
了迅速发展［３］，但现在国内此领域的研究还仅限
于一些名贵药材，如鹿茸［４］、虎骨［５］、龟甲［６］等，
而对于常用、低价、易混、难鉴定中药材的分子水
平鉴定研究还未见报道。本研究通过对鸡内金
原动物家鸡及伪品内金源动物家鸭、家鹅等线粒
体 ＤＮＡ的序列分析，寻找家鸡特异性片段，设计
合成特异性引物以用于鸡内金鉴别，为构建鸡内
金真伪鉴定试剂盒奠定基础。
１ 材料
１１ 动物 鸡、鸭、鹅、鸽购买后宰杀取肝脏、心
脏、肌肉及内金，猪、牛、羊、狗的肝脏直接采自
市场。
２ 方法
２１ ＤＮＡ的提取 采用常规酚氯仿抽提法从
肝脏、心脏及肌肉组织样品中提取总 ＤＮＡ，参照
文献提取鸡、鸭、鹅、鸽的 ｍｔＤＮＡ［７］。
２２ 引物的设计与合成 根据家鸡与其他伪品内
金来源的原动物家禽ｍｔＤＮＡ细胞色素ｂ基因序列的
差异，及引物设计有关原则，设计２对引物，即引物１，
２和３，４，由大连宝生物工程有限公司合成，其序列为
Ｐｒｉｍｅｒ１： ５′ＧＣＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴ３′，
Ｐｒｉｍｅｒ２： ５′ＧＧＧＡＧＡＡＴＡＧＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＡＧＧＡ３′；
Ｐｒｉｍｅｒ３：５′ＡＴＴＣＴＧＡＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＴ３′，Ｐｒｉｍｅｒ４：５′
ＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴ３′。
前１对为对家鸡 ｍｔＤＮＡ细胞色素 ｂ基因扩增
的特异性引物，扩增片段为 ２６２～７４２ｂｐ，长度为
４８１ｂｐ；后１对为家禽ｍｔＤＮＡ细胞色素 ｂ基因扩增
的通用引物，扩增片段为４２０～７７６ｂｐ，长度为３５７
ｂｐ；同时合成引物Ｌ１４７２４，Ｈ１５１４９［８］，作为各种动物
ｍｔＤＮＡ扩增的通用引物，其序列为 Ｌ１４７２４：５′
ＧＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＧＴＴＧ３′，Ｈ１５１４９：５′ＣＴＣＡ
ＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＣＡ３′。
２３ ＰＣＲ扩增条件 反应总体积为 ３０μＬ，内含
１×ｂｕｆｅｒ（购自华美生物工程公司），模板 ＤＮＡ约
５０～１００ｎｇ，４种ｄＮＴＰ２００μｍｏｌ·Ｌ－１；ＴａｑＤＮＡ聚
合酶２Ｕ；引物 １０ｐｍｏｌ·Ｌ－１，１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ８３），５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ；２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
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第３４卷第２４期
２００９年１２月
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Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００９
ＭｇＣｌ２。引物１，２：９５℃ ５ｍｉｎ；９４℃ １ｍｉｎ，６１℃ １
ｍｉｎ，７２℃ ２ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。引物
３，４：退火温度为６０℃，其他参数同引物１，２。引物
Ｌ１４７２４，Ｈ１５１４９：退火温度为５５℃，其他条件同引
物１，２。
２４ ＰＣＲ产物检测 扩增产物经１％的琼脂糖凝
胶电泳，在 ＵＶＰ凝胶图像分析系统上检测、成像。
然后用上海华舜生物工程有限公司的 ＰＣＲ产物纯
化试剂盒纯化凝胶回收产物，送至大连宝生物工程
有限公司进行测序。
２５ ＰＣＲ产物碱基序列比较分析 从 Ｇｅｎｂａｎｋ下
载家鸡相应序列，运用ＷｄｎａｓｉｓＶ２５软件，与测序结
果进行同源性比较。
３ 结果
３１ 从肝脏中提取 ＤＮＡ和扩增结果 从鸡、猪、
牛、羊、狗的肝脏提取 ＤＮＡ并用通用引物 Ｌ１４７２４，
Ｈ１５１４９进行扩增后，均得到阳性产物，证明ＤＮＡ提
取成功（图１）。
ＭＭａｒｋｅｒ；１牛；２猪；３鸡；４羊；５狗；６阴性对照（双蒸水）。
图１ 通用引物Ｌ１４７２４，Ｈ１５１４９扩增
同时，使用特异引物１，２对上述ＤＮＡ样品及家
鸡心、鸡肉等另３个组织样本 ＤＮＡ提取物进行扩
增。结果显示，仅有家鸡的样品得到阳性扩增产物，
其余物种均为阴性（图２）。此结果表明，引物１，２
为家鸡ｍｔＤＮＡ的特异性扩增引物，且对于来自于不
同个体和不同组织的ＤＮＡ具有同样的扩增效果。
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１牛；２猪；３羊；４鸡肉；５狗；６鸡肝；７，８鸡心；
９阴性对照（双蒸水）。
图２ 特异引物１，２对肝脏ＤＮＡ扩增
３２ 家禽肝脏中提取 ｍｔＤＮＡ及扩增结果 从家
鸡、家鸭、家鹅及鸽子的肝脏中提取 ｍｔＤＮＡ，分别用
通用引物３，４（图３）和特异引物１，２（图４）进行扩
增。从图３可见均得到阳性扩增产物，证明 ｍｔＤＮＡ
提取成功。而图４仅家鸡样品有阳性产物，其他家
禽均为阴性，进一步证明引物 １，２对家鸡具有特
异性。
ＭＭａｒｋｅｒ；１鸡；２鸭；３鸽；４阴性对照（双蒸水）；５鹅。
图３ 通用引物３，４对肝脏ｍｔＤＮＡ扩增
ＭＭａｒｋｅｒ；１阴性对照（双蒸水）；２鸡；３鸭；４鸽；５：鹅。
图４ 特异引物１，２对肝脏ｍｔＤＮＡ扩增
３３ ＰＣＲ产物碱基序列比较分析结果 按上述方
法ＰＣＲ扩增后纯化产物，经测序得到有效序列３３５
ｂｐ。从Ｇｅｎｂａｎｋ下载家鸡相应Ｃｔｙｂ序列，运用 Ｗｄ
ｎａｓｉｓＶ２５软件，与测序结果进行比较，同源性
１００％。
４ 讨论
从试验结果可看出，引物１，２对家鸡ＣｔｙｂｍｔＤ
ＮＡ的 ＰＣＲ扩增具有特异性，且对于来自鸡心、鸡
肉、鸡肝等不同个体、不同组织的 ＤＮＡ样品扩增结
果稳定。ＰＣＲ产物序列比较结果进一步证明引物
１，２作为家鸡 ＣｔｙｂｍｔＤＮＡ特异性片段的扩增引物
设计合理，特异性高。
引物３，４是针对市场上伪鸡内金来源的原动物
家鸭、家鹅等家禽，根据 ＣｔｙｂｍｔＤＮＡ碱基序列比较
的基础上所设计的家禽通用引物，此引物扩增结果
既可作为ｍｔＤＮＡ提取及扩增成功的对照，又可进行
鸡内金的真伪鉴别，即当特异性片段及通用片段的
扩增均为阳性时是真品鸡内金；特异性片段为阴性，
通用片段为阳性时是伪品鸡内金；特异性片段及通
用片段的扩增均为阴性时则说明受检药材 ＤＮＡ降
解严重，需更换抽样。
引物 Ｌ１４７２４，Ｈ１５１４９为多种动物 ＣｔｙｂｍｔＤＮＡ
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的通用引物，与自设计的家禽通用引物结合使用，作
为ＤＮＡ提取及扩增成功的对照，可以避免由于
ＤＮＡ提取或ＰＣＲ扩增过程中的技术失误所造成的
结果判断错误。
本研究中所建立的鸡内金特异性片段的检测方
法进行鸡内金真伪的鉴别除具有特异性强、灵敏度
高外，还具有简便快速、低成本、高实用性等特点。
由于个体中所有的细胞都具有相同的基因组 ＤＮＡ，
故可用本研究中所得的特异性引物、家禽通用引物
对鸡内金的真伪进行鉴定，用于实际药检工作中。
［参考文献］
［１］ 李泽鸿，陈丹，李振华鸡内金中氨基酸及营养元素含量测定
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［２］ 郭晓军，冯继光，胡克杰，等鸡内金降脂、抗凝及改善血液流
变学作用的实验研究［Ｊ］中医药信息，２０００，４：６８
［３］ 唐双炎，傅文生物新技术的发展推动中药鉴定技术的变革
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［４］ 唐双焱，傅文，陈永久，等中药材鹿茸的分子分类学鉴定研
究［Ｊ］中国药学杂志，２００２，３７（４）：２５８
［５］ 华育平、张琼、徐艳春，等虎物种特异性鉴定的 ＰＣＲ方法研
究［Ｊ］兽类学报，２００４，２４（２）：１０３
［６］ 刘忠权，王义权，周开亚中药材整甲的位点特异性ＰＣＲ鉴定
研究［Ｊ］中草药，２００１，３２（８）：７３６
［７］ 孙杰，赵宗胜，李大全，等一种改进的禽类线粒体ＤＮＡ提取
方法［Ｊ］生物技术，２００３，１３（４）：１７
［８］ ＫｏｃｈｅｒＴＤ，ＴｈｏｍａｓＷ Ｋ，ＭｅｙｅｒＡＤｙｎａｍｉｃｓｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ＤＮＡｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎａｎｉｍａｌｓ：Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈｃｏｎ
ｓｅｒｖｅｄｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９８９，８６：６１９０
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｉｕｍｓｔｏｍａｃｈｉｕｍｇａｌｉｂｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｘｏｎｏｍｙ
ＱＵＭｅｎｇ，ＣＵＩＪｉｃｈｕｎ，ＤＯＮＧＺｈｉｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｉｈｕａ，ＷＡＮＧＢｉｎｇｍｅｉ，ＺＨＡＮＧＪｉｌｉｎ，ＬＩＣａｉ
（ＭｅｄｉｃａｌＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｅｉｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ１３２０１３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｏｆＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｉｕｍ
ｓｔｏｍａｃｈｉｕｍｇａｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＣｙｔｂｍｔＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＧａｌｕｓｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａａｎｄｔｈｒｅｅｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｏｆｐｏｕｌｔｒｙｗｅｒｅｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍ
Ｇｅｎｂａｎｋ．ＳｐｅｃｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｃｙｔｂｇｅｎｅｓ．ＰＣＲｔｅｓｔｓｗｅｒｅ
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅＤＮＡｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＧ．ｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ，ｔｈｒｅｅｏｔｈｅｒｐｏｕｌｔｒｙｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃｍａｍｍａｌａｎｉｍａｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｏｆＧ．ｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａｃｏｕｌｄｏｎｌｙａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｃｙｔｂｍｔＤＮＡｏｆＧ．ｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓａｒｅｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｔｏＧ．ｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａｍｔＤＮＡａｎｄｃａｎｕｓｅｄｔｏｄｉｓｃｅｒｎＣｏｒｉｕｍｓｔｏｍａｃｈｉｕｍｆｒｏｍｔｈｅｆａｌｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｏｒｉｕｍｓｔｏｍａｃｈｉｕｍｇａｌｉ；ＰＣＲ；ｍｔＤＮＡ；ｓｐｅｃｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ
［责任编辑 吕冬梅］
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第３４卷第２４期
２００９年１２月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２４
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００９