全 文 ：超临界 ＣＯ２萃取灵芝子实体中麦角甾醇的实验研究
宋师花１，３，贾晓斌１，２，陈彦１，２，王丽静３，封亮３
（１．江苏省中医药研究院 中药新型给药系统重点实验室，江苏 南京 ２１００２８；
２．国家中医药管理局 名医名方适宜剂型重点研究室，江苏 南京 ２１００２８；
３．江苏大学 药学院，江苏 镇江 ２１２０１３）
［摘要］　目的：探讨超临界ＣＯ２流体萃取灵芝子实体中麦角甾醇的可行性。方法：用ＨＰＬＣ测定麦角甾醇的含量，采用正
交试验优化超临界ＣＯ２流体萃取灵芝子实体中麦角甾醇的工艺条件。结果：超临界ＣＯ２流体萃取麦角甾醇的最佳工艺条件：
萃取压力２０ＭＰａ，萃取温度４５℃，夹带剂（９５％乙醇）用量为１０ｍＬ·ｇ－１，萃取时间１５ｈ。结论：超临界ＣＯ２流体具有极性
可调的优势，可有效萃取灵芝中的麦角甾醇。
［关键词］　灵芝；麦角甾醇；超临界ＣＯ２萃取；正交试验；ＨＰＬＣ
［收稿日期］　２００８１２０６
［基金项目］　江苏省公益项目（ＢＭ２００７７０１）
［通信作者］　陈彦，Ｔｅｌ：（０２５）８５６３７８０９，Ｅｍａｉｌ：ｙｃｈｅｎ２０２＠ｙａｈｏｏ．
ｃｏｍ．ｃｎ
　　麦角甾醇是灵芝中一种重要的甾醇类成分，具
有广泛的药理活性［１２］。目前，对灵芝中三萜和多糖
类成分的研究已经较为广泛、深入［３４］，但对其中的
甾醇类成分如麦角甾醇的研究却较少，所以有必要
对灵芝中麦角甾醇进行深入的研究，故本研究从灵
芝中麦角甾醇的提取工艺这个方面进行深入研究。
虽然曾有报道用醇回流提取灵芝中麦角甾
醇［５］，加压溶剂提取、微波辅助提取、超声波等方
法［６８］提取其他真菌中的麦角甾醇，但却未见用超临
界ＣＯ２萃取法提取灵芝子实体中麦角甾醇的报道。
本研究对超临界ＣＯ２萃取法提取灵芝中麦角甾醇的
进行了细致、科学的研究，以期为麦角甾醇的提取提
供一种全新、可靠、可行的方法。
１　材料
ＨＡ２２１４０（５０）２５型超临界萃取装置（江苏南
通华安超临界萃取有限公司）；Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液
相色谱仪 （包括：在线脱气机，四元梯度泵，自
动进样器，恒温柱温箱，ＤＡＤ检测器，Ａｇｉｌｅｎｔ
１２００化学工作站）；１／１０万电子天平 （ＭＥＴＴＬＥＲ
ＴＯＬＥＯＲ公司）。
灵芝子实体为江苏盐城神农保健食品有限公司
惠赠，经中国科学院微生物研究所文华安研究员鉴
定为赤芝Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ的干燥子实体；麦角甾
醇（大连医海生物科技有限公司，批号２００８０５２５）；
甲醇为色谱纯；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
２　方法与结果
２．１　麦角甾醇的含量测定方法
２．１．１　色谱条件　ＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８柱（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ），流动相甲醇，流速 １０ｍＬ·ｍｉｎ－１，
检测波长２８２ｎｍ，柱温３０℃，进样量１０μＬ。麦角
甾醇对照品和提取物的ＨＰＬＣ图，见图１。
Ａ．对照品；Ｂ．样品；１．麦角甾醇。
图１　麦角甾醇对照品和灵芝超临界提取物ＨＰＬＣ图
２．１．２　标准曲线的绘制　精密称取麦角甾醇对照
品５９７ｍｇ，置１０ｍＬ量瓶中，甲醇溶解并定容，制
成质量浓度为０５９７ｇ·Ｌ－１的麦角甾醇对照品储备
液。吸取麦角甾醇对照品储备液适量，分别制成质
量浓度为 ００４９８，００９９５，０１４９２，０１９９０，
０２４８８，０２９８５ｇ·Ｌ－１的麦角甾醇对照品溶液。
吸取麦角甾醇对照品溶液１０μＬ进样，测定其峰面
积。以麦角甾醇含量为横坐标（Ｘ），峰面积积分值
为纵坐标（Ｙ），绘制标准曲线，得回归方程 Ｙ＝
１３４１７Ｘ－６１５４，ｒ＝０９９９９，麦角甾醇在０４９８～
２９８５μｇ呈良好的线性关系。
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第３４卷第１４期
２００９年７月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
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２．１．３　精密度试验　精密吸取质量浓度为００９９５
ｇ·Ｌ－１的麦角甾醇对照品溶液，按“色谱条件”项下
色谱条件重复进样６次，峰面积值的 ＲＳＤ０８３％，
表明仪器精密度良好。
２．１．４　稳定性试验　取同一供试品溶液，在０，２，
４，８，１２，２４ｈ时间点进样分析，记录峰面积值，麦角
甾醇峰面积值的ＲＳＤ１４％，表明供试品溶液在２４
ｈ内稳定。
２．１．５　重复性试验　取同一样品，平行制备６份供
试品溶液，按“色谱条件”项下色谱条件进行测定，
麦角甾醇峰面积值的ＲＳＤ０８９％，表明该方法重复
性良好。
２．１．６　加样回收率试验　取已测得麦角甾醇含量
的灵芝超临界ＣＯ２萃取液样品溶液６份，分别与麦
角甾醇对照品溶液等量混合，测定麦角甾醇的含量，
计算回收率，平均回收率 １０２１５％，ＲＳＤ１７％
（ｎ＝６），见表１。
表１　麦角甾醇加样回收率（ｎ＝６）
测得量
／μｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
９２７４ １０１２９ 　 　
９３４７ １０２７６ 　 　
９４３５ １０４５１
１０２１５ １７２
９３８１ １０３４２ 　 　
９２５６ １００９３ 　 　
９２００ ９９８０ 　 　
　　注：样品中量均为４２３μｇ；加入量均为４９８μｇ。
２．１．７　样品测定　取灵芝子实体超临界ＣＯ２萃取液
样品，过０４５μｍ微孔滤膜，取续滤液，分别进样１０
μＬ，按上述色谱条件进行分析，计算麦角甾醇的含量。
２．２　超临界ＣＯ２萃取试验方法与结果
２．２．１　萃取方法　采用单釜萃取的方法对麦角甾醇
进行萃取，萃取压力、萃取温度、夹带剂（９５％乙醇）用
量按照表２条件进行正交试验；设定分离釜Ｉ压力为
７ＭＰａ，温度为５０℃；分离釜Ⅱ压力为４ＭＰａ，温度３６
℃；萃取装置内ＣＯ２流量控制在３０Ｌ·ｈ
－１。
超临界ＣＯ２萃取麦角甾醇流程：将灵芝子实体
粉碎，过１２目筛，取１００ｇ装入萃取釜中，打开 ＣＯ２
钢瓶，同时调节萃取釜、分离釜 Ｉ、分离釜 Ｉ温度达
设定温度，然后加压至设定压力，调节 ＣＯ２流量，使
超临界ＣＯ２流体在设定的压力、温度下进行萃取循
环，当达到试验设定的萃取时间后，从分离釜Ｉ和分
离釜Ⅱ出料口接收萃取液，合并分离釜 Ｉ和分离釜
Ｉ萃取液，定容至５００ｍＬ，即得灵芝子实体超临界
ＣＯ２萃取液样品，备用。
２．２．２　正交试验设计　经过预试验，采用正交试验
的方法来确定最佳萃取条件，根据影响超临界流体萃
取的各种因素条件，拟定出３因素３水平表，采用
Ｌ９（３
４）正交表安排试验，见表２。在所选的各因素水
平条件下，萃取１５ｈ时的麦角甾醇含量能达到萃取
３ｈ时的９５％，所以选择萃取时间为１５ｈ。
表２　正交试验因素水平
水平
Ａ
萃取压力
／ＭＰａ
Ｂ
萃取温度
／℃
Ｃ
夹带剂用量
／ｍＬ·ｇ－１
１ １０ ３５ ００
２ １５ ４５ １０
３ ２０ ５５ ３０
２．２．３　正交试验结果及分析　选用 Ｌ９（３
４）正交表
安排试验，以麦角甾醇的含量为试验考察指标，试验
结果见表３。
表３　超临界流体萃取正交试验 ｍｇ·ｇ－１　
Ｎｏ． 麦角甾醇 Ｎｏ． 麦角甾醇
１ ０６７１ ６ ０９０８
２ ０８００ ７ ０９４０
３ ０６５２ ８ ０９３９
４ ０９２７ ９ ０８９８
５ ０９３５ 　 　
　　从正交试验结果可知，麦角甾醇的最佳萃取工
艺应是Ａ３Ｂ２Ｃ２，即萃取压力２０ＭＰａ，萃取温度为４５
℃，夹带剂（９５％乙醇）用量为１ｍＬ·ｇ－１，萃取时间
为１５ｈ；影响萃取的因素大小为 Ａ＞Ｂ＞Ｃ；但直观
分析并不能反映这些因素对萃取的影响是否具有显
著性，为此进行方差分析，见表４。
表４　灵芝子实体超临界流体萃取方差分析
方差来源 偏差平方和 Ｐ
Ａ ００９４ ＜００５
Ｂ ０００８
Ｃ ０００２
Ｄ（误差） ００００ ２　
　　注：ｆ＝２。
由表４可见，因素 Ａ即萃取压力对麦角甾醇的
含量具有显著性影响（Ｐ＜００５），因素 Ｂ，Ｃ对麦角
甾醇含量无显著性影响。
２．２．４　正交试验的补充试验　由于因素 Ａ即萃取
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压力对萃取有显著影响，为考察在大于２０ＭＰａ的萃
取压力下，是否会增加麦角甾醇含量，又补充萃取压
力为２５ＭＰａ的试验。试验条件为萃取压力为 ２５
ＭＰａ，温度为４５℃，夹带剂用量为１ｍＬ·ｇ－１，萃取
时间为１５ｈ。结果麦角甾醇为０９６６ｍｇ·ｇ－１，与
上述条件 Ａ３Ｂ２Ｃ２下０９６３ｍｇ·ｇ
－１没有显著差异。
因此，超临界ＣＯ２萃取麦角甾醇最佳条件可以定为
Ａ３Ｂ２Ｃ２，即萃取压力为２０ＭＰａ，萃取温度为４５℃，
夹带剂（９５％乙醇）用量为１ｍＬ·ｇ－１，萃取时间为
１５ｈ。
２．２．５　验证试验　为进一步考察优选工艺的可靠
性及稳定性，取３份药材，每份１００ｇ，按上述最佳萃
取条件进行试验。试验结果表明，在最佳萃取条件
下，萃取的麦角甾醇分别为０９６３，０９６５，０９６２ｍｇ
·ｇ－１，所以该最佳条件工艺可靠稳定。
２．３　超临界 ＣＯ２流体萃取与醇回流提取麦角甾醇
的含量比较
文献曾经报道［１］用正交试验法优选乙醇加热
回流法提取灵芝子实体中麦角甾醇的最佳提取工
艺，试验表明最佳提取条件为：加入１０倍的溶剂量，
在８０℃回流条件下，每次１５ｈ，提取３次。故取
１００ｇ上述灵芝粗粉，按照文献样品处理方法进行处
理，然后进行麦角甾醇的含量测定，结果表明醇回流
法提取的麦角甾醇为０９５４ｍｇ·ｇ－１，较超临界ＣＯ２
流体萃取法得到的麦角甾醇含量略低。
３　讨论
萃取压力是超临界流体萃取过程中的关键因素
之一，萃取压力增加则超临界流体的密度增大，从而
增强其溶解能力，提高萃取率。但从结果分析可知，
当压力增大到２０ＭＰａ以后，麦角甾醇的萃取量增加
不明显。这是因为压力增大到一定程度后，大部分
麦角甾醇被释放溶出到超临界流体中，再增大压力，
已失去意义，同时萃取压力增加会导致高压设备的
安全性隐患增大，因此萃取压力选择２０ＭＰａ为宜。
［参考文献］
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［５］　张萱，陈海霞，高文远．灵芝中麦角甾醇的提取工艺［Ｊ］．中国
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天然和人工虫草中的麦角甾醇、核苷及其碱基［Ｊ］．药学学报，
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Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｆｒｏｍｆｒｕｉｔｓｏｆ
Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍｕｓｉｎｇｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｔｉｏｎ
ＳＯＮＧＳｈｉｈｕａ１，３，ＪＩＡＸｉａｏｂｉｎ１，２，ＣＨＥＮＹａｎ１，２，ＷＡＮＧＬｉｊｉｎｇ３，ＦＥＮＧＬｉａｎｇ３
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｅｗＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆ
ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＥｆｅｃｔｉｖｅＰｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆＳｔａｔｅＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２８，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２０１３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＦＥ）ｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｓｆｒｏｍｔｈｅｆｒｕｉｔｓ
ｏｆＧａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｓ，ｔｈｅｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＲＰ
ＨＰＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐｒｅｓｓｕｒｅａｓ２０ＭＰａ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｔ４５℃，ｕｓｉｎｇｅｔｈａｎｏｌａｓｍｏｄｉｆｉｅｒｃａｒｉｅｒａｔ
ｔｈｅｖｏｌｕｍｅｏｆ１ｍＬ·ｇ－１，ａｎｄ１．５ｈｏｕｒｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳＦＥｈａｓｔｈｅｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙｏｆａｄｊｕｓｔａｂｌｅｐｏｌａｒｉｔｙ，ａｎｄｈａｓｔｈｅ
ａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｆｒｏｍｆｒｕｉｔｓｏｆＧａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ；ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ；ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎ；ＨＰＬＣ
［责任编辑　周　驰］
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第３４卷第１４期
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