全 文 :LCESIMS快速同时测定冬虫夏草中
主要核苷类成分
周菊峰1,黄兰芳2,3,郭方遒3
(1.湘南学院 化生系,湖南 郴州 423000;
2.衢州学院 化学与制药工程系,浙江 衢州 324000;
3.中南大学 化学化工学院,湖南 长沙 410083)
[摘要] 目的:建立同时快速测定冬虫夏草中腺嘌呤、腺苷和虫草素含量的方法。方法:LCESIMS法,采用选择性离子
检测(SIM)和电喷雾离子化(ESI),色谱条件为ShimadzuVPODS色谱柱;流动相为水甲醇甲酸(92∶7∶1),以甲醇为提取溶剂
和2氯腺苷为内标。结果:腺嘌呤线性回归方程为Y=007264X+000622,线性范围为08~1300mg·L-1,r=09987;腺
苷线性回归方程为Y=01597X+00146,线性范围为05~1245mg·L-1,r=09991;虫草素线性回归方程为Y=01942X+
00186,线性范围为 05~1285mg·L-1,r=09994;腺嘌呤、腺苷和虫草素的加标回收率分别为 9876%,9937%和
9926%。结论:方法灵敏、快速和选择性好,可用于同时快速测定冬虫夏草中腺嘌呤、腺苷和虫草素含量及质量控制。
[关键词] 冬虫夏草;核苷类物质;LCESIMS
[收稿日期] 20090220
[基金项目] 中国博士后科学基金项目(20060400887)
[通信作者] 黄兰芳,博士,教授。Tel:(0731)8879616,Email:
lf18huang@yahoo.com.cn
[作者简介] 周菊峰,副教授,从事分析化学的研究
冬虫夏草 Cordycepssinensis是我国传统名贵中
药材之一,系麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌
Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄于鳞翅目蝙蝠蛾
科Hepialidae昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体
的复合体[1],主要分布在我国青海、西藏、四川、
云南等高寒草甸区。冬虫夏草有调节人体免疫系统
活性、抗肿瘤活性、调节肾功能、恢复肝功能、抗
氧化活性、调节心血管功能等功效。自药理学研究
表明冬虫夏草所含的虫草素有抗肿瘤活性以后,冬
虫夏草的核苷类物质如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧
啶、腺苷、虫草素等已成为冬虫夏草研究的热
点[23],由于自然条件的限制,来源紧缺、价格昂
贵,市面上充斥很多伪劣产品,因此准确分辩冬虫
夏草的真伪非常重要,而核苷类是其重要的活性成
分,因而定量测定核苷类物质的含量有极其重要的
意义,且腺苷已被用作冬虫夏草的质控指标[1]。
测定冬虫夏草中腺苷等核苷类物质的含量,主要有
薄层 色 谱 法 (TLC)[45],高 效 液 相 色 谱 法
(HPLC)[68]和毛细管电泳法 (CE)[911],其中以
HPLC最适用,但该类方法灵敏度低、选择性差且
耗时过长。本文采用LCESIMS法同时测定冬虫夏
草虫体或子座中腺嘌呤、腺苷、虫草素的含量,为
冬虫夏草的质量评定提供了一种快捷、有效的检测
方法。
1 仪器与试药
ShimadzuLCMS2010(日本京都,含 LC10Advp
高压泵,FCV10Alvp低压梯度装置,DGU14A在线
脱气机,CTO10Avp柱温箱,SPDM10Avp二极管阵
列检测器,四极杆质谱仪;AB104S/A分析天平(瑞
士梅特勒公司,精度为01mg)。
腺嘌呤、腺苷、虫草素和内标2氯腺苷购于Sig
ma公司(St.Louis,MO,美国),甲酸为分析纯;色
谱纯甲醇购于江苏汉邦科学技术有限公司;冬虫夏
草购于长沙九芝堂、老百姓大药房和芝林大药房,经
湖南中医药研究院朱中冀副研究员鉴定,其产地分
别为青海省、西藏和四川省。
2 方法和结果
2.1 供试品溶液的制备 将于35℃烘干后的冬虫
夏草虫体或子座磨为粉末状,过20目筛后,精密称
取冬虫夏草虫体或子座100mg,加甲醇80mL,索氏
回流提取4h;提取液真空干燥后,加入2氯腺苷20
μg以使内标为10mg·L-1,用甲醇定溶至2mL,经
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045μm微孔滤膜过滤,滤液即为供试液。
2.2 色谱条件 ShimadzuVPODS色谱柱(20mm×
150mm,5μm),WatersC18保护柱(Waters,Milford,
MA,USA)。流动相为水甲醇甲酸(92∶7∶1),使用
前超声脱气,流动相中的每组分均用022μm微孔
滤膜过滤,配制流动相用MiliQ纯水;温度为室温,
流速02mL·min-1,进样量5μL。
2.3 质谱检测条件 电喷雾离子化(ESI);正离
子;选择性离子检测 m/z,腺嘌呤136[M+H]+;腺
苷268[M+H]+;虫草素 252[M+H]+;2氯腺苷
(内标,IS)302[M+H]+。ESI源温度380℃;脱溶
剂和加热块温度分别为250℃和200℃;源电压 +
40kV;检测电压15kV;脱溶剂电压 -18V;Q阵
列偏转电压 45V;雾化气(N2)流速为 42L·
min-1。
2.4 对照品溶液的制备 甲醇用045μm微孔滤
膜过滤并经脱气处理,02g·L-1腺嘌呤、腺苷、虫
草素和内标2氯腺苷储备液用甲醇配制并保存于
冰箱中,工作液(10,200mg·L-1)用甲醇稀释储
备液配制。将混合对照品(各组分浓度均为10mg
·L-1)或冬虫夏草提取液在拟定 LCESIMS条件
下分析,腺嘌呤、腺苷、虫草素和内标2氯腺苷达基
线分离,保留时间分别为198,242,364,445min
(图1)。
A.对照品;B.青海产冬虫夏草子座;
1.腺嘌呤;2.腺苷;3.虫草素;4.2氯腺苷(10mg·L-1)。
图1 SIM模式下对照品及样品的LCESIMS总
离子流图
2.5 标准曲线的制备 每组分配制7个非零标准,
腺嘌呤为08,25,200,400,800,1000和1300
mg·L-1,腺苷为05,25,200,400,800,1000,
1245mg·L-1,虫草素为 05,25,200,400,
800,1000,1285mg·L-1,用以计算标准曲线。
标准曲线由各组分和2氯腺苷的峰面积比率(Y)对
各组分质量浓度(X,mg·L-1)经线性回归而成,内
标质量浓度为100mg·L-1。腺嘌呤、腺苷和虫草
素质量浓度分别在 08~1300mg·L-1,05~
1245mg·L-1和05~1285mg·L-1时线性关系
良好,其线性回归方程和相关系数(括号内)分别为
Y=007264X+000622(09987),Y=01597X+
00146(09991),Y=01942X +00186
(09994)。
2.6 重复性试验 取20mg·L-1腺嘌呤、腺苷和
虫草素混合对照品溶液,按上述 LCESIMS条件连
续测定6次,得腺嘌呤、腺苷和虫草素与2氯腺苷峰
面积比的平均值分别为 1457,3175,3872,RSD
分别为092%,082%和078%,表明精密度良好。
以拟定提取方法平行提取6份川产冬虫夏草虫体,
在拟定LCESIMS条件下测定。结果腺嘌呤、腺苷
和虫草素的平均值分别为181,974和265mg·
L-1,RSD分别为37%,28%和34%,证明此方法
重复性良好。
2.7 选择性和检测限 由图1A知,腺嘌呤、腺苷、
虫草素和IS分离良好,由于使用选择性离子检测模
式,在腺嘌呤、腺苷和虫草素保留时间区域内没有干
扰,故本法有很高的专属性。当信噪比为3∶1时,腺
嘌呤、腺苷和虫草素的检测限(LOD)分别为 05,
01,01mg·L-1。
2.8 稳定性试验 取川产冬虫夏草虫体样品提取
液,分别于0,2,4,6,8,12h进样测定,结果供试品
溶液在12h内峰面积无明显变化,峰面积RSD分别
为10%,084%和091%。
2.9 回收率试验 取6份已测含量的同批次川产
冬虫夏草虫体,精密称取100mg,加入10μg腺嘌
呤、50μg腺苷和20μg虫草素后,按2.1制备供
试品溶液后,按拟定的分析条件测定峰面积以测定
回收率,测得腺嘌呤、腺苷和虫草素的平均回收率分
别为9876%,9937%和9926%,表明该方法有很
强的可靠性。
2.10 样品分析 利用本法测定不同产地冬虫夏草
的子座及虫体中腺嘌呤、腺苷和虫草素的含量,图
1B为青海省冬虫夏草样品在拟定条件下的LCESI
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MS总离子流图,测定结果见表1。
表1 不同产地冬虫夏草中腺嘌呤、腺苷和虫草素的
质量分数(n=6) mg·kg-1
样品 腺嘌呤 腺苷 虫草素
青海冬虫夏草子座 312 1926 938
青海冬虫夏草虫体 287 1143 542
西藏冬虫夏草子座 364 819 516
西藏冬虫夏草虫体 325 704 391
四川冬虫夏草子座 210 1372 320
四川冬虫夏草虫体 181 974 265
3 讨论
LCESIMS联用法在选择流动相时既应考虑
对分离也应考虑对离子化的影响。由于各核苷
类化合物有着相似的结构,它们很难被分离出
来,优化色谱条件是必要的。实验了水、甲醇和
甲酸的浓度,其中以流动相的 pH和有机修饰剂
的含量对分离、峰型和检测灵敏度影响最大。当
甲酸体积分数在 01% ~12%,腺嘌呤、腺苷、
虫草素和2氯腺苷能被完全分离,但当甲酸的浓
度低于09%时,离子化效果比较差。考虑到分
离和离子化两因素,选流动相为水甲醇甲酸
(92∶7∶1)。
当在m/z50~350扫描时,可得腺嘌呤、腺苷、
虫草素和2氯腺苷的质谱图,由实验可知,各化合
物以分子离子[M+H]+为基峰。将含有腺嘌呤、腺
苷、虫草素和2氯腺苷的混合标准溶液注入 LCMS
系统中,选m/z为136,268,252和302的[M+H]+
峰,用SIM模式监测这些化合物,从而测定腺嘌呤、
腺苷和虫草素。用腺苷标准液(20mg·L-1)优化
ESIMS的灵敏度。
本文测定方法经各项试验考察,结果表明方法
简便易行、测定结果准确,重现性好,本法能同时测
定3种主要核苷类物质,从而达到准确定量分析冬
虫夏草的主要核苷类有效成分的目的。与常用的高
效液相色谱法相比出峰快,只需5min即可完成整
个分析过程,可适于测定冬虫夏草中腺嘌呤、腺苷和
虫草素的含量。
试验中,作者分别测定了3个不同产地冬虫夏
草中腺嘌呤、腺苷和虫草素的含量。结果表明冬虫
夏草子座中的腺嘌呤、腺苷和虫草素含量均高于其
虫体部分,有的还有显著差异。不同冬虫夏草中3
种核苷类有效成分含量存在一定差异,其中青海产
的冬虫夏草中腺嘌呤、腺苷和虫草素含量均最高,表
明其具有较好的品质。
[参考文献]
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RapidsimultaneousdeterminationofmainnucleosidesinCordyceps
sinensiswithLCESIMS
ZHOUJufeng1,HUANGLanfang2,3,GUOFangqiu3
(1.DepartmentofBiochemistry,XiangnanColege,Chenzhou423000,China;
2.DepartmentofMedicineandPharmaceutical,QuzhouColege,Quzhou324000,China;
3.ColegeofChemistryandChemicalEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410083,China)
[Abstract] Objective:ToestablishanLCMSmethodforrapidsimultaneousdeterminationofadenine,adenosineandcordyce
pininCordycepssinensis.Method:Anelectrosprayionization(ESI)interfaceandselectiveionmonitoring(SIM)modewereused.
TheanalyticalcolumnwasaShimadzuVPODScolumn(20mm×150mm)andthemobilephasewaswatermethanolformicacid
(92∶7∶1).Methanolwasusedasextractionsolventand2chloroadenosinewasusedasinternalstandardforthisassay.Result:The
regressionequationsandcoeficientwereY=007264X+000622andr=09987foradenine,Y=01597X+00146andr=
09991foradenosine,Y=01942X+00186andr=09994forcordycepin.Thelinearrangewas081300mg·L-1,05
1245mg·L-1and051285mg·L-1foradenine,adenosineandcordycepin,respectively.Theaveragerecoverywas9876%,
9937% and9926% foradenine,adenosineandcordycepin,respectively.Conclusion:Thisestablishedmethodwashighlysensi
tive,fastandselective,whichcanbeusedforrapidsimultaneousdeterminationofadenine,adenosineandcordycepininC.sinensis.
ThismethodalsocanbeappliedforthequalitycontrolofC.sinensis.
[Keywords] Cordycepssinensis;nucleoside;LCESIMS
[责任编辑 王亚君]
《中国天然药物》征订启事
《中国天然药物》是由中国药科大学与中国药学会共同主办、科学出版社出版的国家级药学学术期刊,
2003年5月创刊。刊物以报道来自天然产物活性化合物的发现与改造,以及其药效与药理作用机制为重
点,是具有我国独特优势的中药、草药、海洋药物、微生物药物、生化药物、民族药物进行国际交流的重要窗
口。
本刊在线投稿、审稿(htp://qk.cpu.edu.cn/tianran)。为双月刊,单月20日出版,2010年国内定价为
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ran。
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