目的:考察灯盏花素的平衡溶解度、油水分配系数等理化常数,研究温度、pH及抗氧剂等对其水溶液稳定性的影响。方法:建立灯盏花乙素的HPLC测定方法,测定灯盏花素在不同介质中的平衡溶解度与不同pH条件下的表观油/水分配系数(Papp),以10 h的药物含量变化率为指标考察介质、温度、pH及抗氧剂对其稳定性的影响。结果:方法学考察表明,精密度、稳定性、重现性、回收率等均符合要求;灯盏花素在生理盐水,蒸馏水,pH 7.0 磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7.5 PBS,Ringer‘S液,甲醇及乙醇中的平衡溶解度分别为(20.68±1.12),(79.35±0.68),(7 954.62±34.90),(18 708.17±253.05),(3 670.40±27.64),(210.71±0.74),(184.34±1.47) mg·L-1;灯盏花素在pH 3.0,4.0,5.0,6.5,7.0下的Papp分别为5.362,0.542,0.371,0.328,0.143;灯盏花素在Ringer‘S液中的稳定性差;温度、pH升高,其稳定性均显著降低;EDTA 2Na能显著提高灯盏花素溶液的稳定性。结论:本研究建立的灯盏乙素HPLC测定方法专属性较好、简便,灯盏花素的Papp随着pH增大而减小,在水性介质中的平衡溶解度随着pH增大而增大,但是pH增大,灯盏花素水溶液的稳定性显著降低, EDTA 2Na可以作为灯盏花素溶液剂的抗氧剂。
Objective: To investigate the physicochemical constants such as equilibrium solubility and apparent partition coefficients (Papp), and study the effects of temperature, pH value and antioxidants on the stability of breviscapine solution. Method: The equilibrium solubility of breviscapine in various medium and the Papp of breviscapine under different pH conditions were determinated by RP HPLC, and the effects of temperature, pH value and antioxidants on the stability of solution were investigated by taking change rates of drug content in 10 h as detection index. Result: The equilibrium solubility of breviscapine in saline, distilled water, pH 7.0 PBS, pH 7.5 PBS, Ringer‘S fluid, methanol and ethanol were (20.68±1.12), (79.35±0.68), (7 954.62±34.90), (18 708.17±253.05), (3 670.40±27.64), (210.71±0.74), (184.34±1.47) mg·L-1 respectively; while in pH value 3.0, 4.0, 5.0, 6.5, 7.0 solution, the Papp were 5.362, 0.542, 0.371, 0.328 and 0.143 respectively. The stability of breviscapine in the Ringer′s fluid was the worst and the stability was significantly decreased with the increase of temperature and pH value and it could be improved by EDTA 2Na. Conclusion: The established HPLC assay was accurate and convenient. The Papp of breviscapine is decreased by increased the pH value, while in the aqueous solution the equilibrium solubility of breviscapine increase with the pH in crese. EDTA 2Na can be used as an antioxidant of breviscapine solution.
全 文 :灯盏花素的理化性质及其稳定性影响因素研究
石森林1,徐莲英2,毛展凯1,叶娇云1,李万里1,高 敏1
(1.浙江中医药大学 药学院,浙江 杭州 310053;
2.上海中医药大学 中药学院,上海 201203)
[摘要] 目的:考察灯盏花素的平衡溶解度、油水分配系数等理化常数,研究温度、pH及抗氧剂等对其水溶液稳定性的
影响。方法:建立灯盏花乙素的HPLC测定方法,测定灯盏花素在不同介质中的平衡溶解度与不同pH条件下的表观油/水分
配系数(Papp),以10h的药物含量变化率为指标考察介质、温度、pH及抗氧剂对其稳定性的影响。结果:方法学考察表明,精
密度、稳定性、重现性、回收率等均符合要求;灯盏花素在生理盐水,蒸馏水,pH70磷酸盐缓冲液(PBS),pH75PBS,Ringer'S
液,甲醇及乙醇中的平衡溶解度分别为(2068±112),(7935±068),(795462±3490),(1870817±25305),
(367040±2764),(21071±074),(18434±147)mg·L-1;灯盏花素在 pH30,40,50,65,70下的 Papp分别为
5362,0542,0371,0328,0143;灯盏花素在Ringer'S液中的稳定性差;温度、pH升高,其稳定性均显著降低;EDTA2Na能显
著提高灯盏花素溶液的稳定性。结论:本研究建立的灯盏乙素HPLC测定方法专属性较好、简便,灯盏花素的 Papp随着 pH增
大而减小,在水性介质中的平衡溶解度随着pH增大而增大,但是pH增大,灯盏花素水溶液的稳定性显著降低,EDTA2Na可
以作为灯盏花素溶液剂的抗氧剂。
[关键词] 灯盏花素;平衡溶解度;表观油水分配系数;稳定性
[收稿日期] 20080723
[基金项目] 国家中医药管理局项目(0607ZP24);浙江省科技攻
关项目(2003C33017)
[通信作者] 石森林,博士,副教授,硕士生导师,Tel:(0571)
86613524,Email:pjstone@163.com
灯盏花,又名灯盏细辛,系菊科植物短葶飞蓬
Erigeronbreviscapus(Vant.)HandMazz的干燥全
草。性寒,味苦、微辛,具有散寒解表、祛风除湿、活
络止痛之功效[1]。临床主要用于治疗脑血栓形成、
脑栓塞等脑血管意外所致完全性及不全性瘫痪。其
主要有效成分为灯盏花素(breviscapine,Bre)[2],以
灯盏乙素(scutelain)4′,5,6三羟基黄酮7葡萄糖
醛酸苷为主(占95%以上),还包括少量灯盏花甲素
(芹菜素7O葡萄糖醛酸苷)。灯盏乙素又名灯盏
花乙素、野黄芩苷、印黄芩苷、黄芩素苷。分子式
C21H18O12,相对分子质量46235.
目前已有灯盏花素片、注射剂、胶囊等制剂上
市,有关灯盏花素的研究则主要集中在临床与药效
研究等方面,尚未有对灯盏花素理化性质方面的系
统研究报道。而制剂处方设计前对原料药的物理、
化学性质进行考察,并研究影响药物稳定性的因素,
这对设计和制备安全、有效、稳定、可控的药物制剂
具有非常重要的意义。
因此,本研究有选择性地考察了与灯盏花素液
体制剂设计密切相关的理化性质,还对灯盏花素水
溶液稳定性进行了初步考察,旨在为其制剂处方和
工艺设计及生物药剂学等方面的研究提供参考。
1 材料与仪器
1.1 试药
灯盏乙素对照品(中国药品生物制品检验所,
批号110842200403);灯盏花素(云南玉溪万方天
然药物有限公司,批号 030702);乙二胺四乙酸二
钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、盐
酸等试剂均为分析纯;乙腈、甲醇、磷酸、冰醋酸、丙
二醇等试剂均为色谱纯;水为重蒸馏水。
1.2 仪器
高效液相色谱仪,Agilent1100;检测器UVD(美
国Agilent公司);色谱工作站(上海三瑞);CQ250
型超声波清洗器(上海超声波仪器厂);AB204N电
子天平(梅特勒托利多);PL5124型纯水机(美国
PALL公司);PHS3TC精密酸度计(上海天达仪器
有限公司);Lambda12紫外分光光度计(美国PE公
司);DDL5冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);
78HW3恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公
司);501A超级数显恒温水浴(上海浦东荣丰科学
仪器有限公司);XW80A型涡旋混合器(上海精科
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实业有限公司);101A2电热鼓风箱(上海市实验仪
器总厂)。
2 方法与结果
2.1 灯盏花素HPLC测定方法的建立
2.1.1 供试品溶液的制备 灯盏花素真空干燥24
h后,取约5mg,精密称定,置于250mL量瓶中,用
无水乙醇溶解并稀释至刻度,密塞,摇匀,即得。
2.1.2 对照品溶液的制备 灯盏乙素对照品真空
干燥24h后,取约5mg对照品,精密称定,置于50
mL量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,密塞,摇
匀,即得对照品储备液。精密吸取此对照品储备液
2mL于10mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,密塞,
摇匀,即得对照品溶液,置4℃冰箱保存。
2.1.3 测定条件的选择 测定波长的选择:将对照
品溶液与供试品溶液分别用紫外分光光度在220~
400nm扫描,结果其最大吸收波长均为327nm。因
此灯盏乙素的检测波长定为327nm。
测定条件:ZorbaxXDBC18(46mm×150mm,
5μm),选用乙腈水磷酸(20∶80∶02)为流动相对
本品进行试验,灯盏乙素峰分离度较好,保留时间较
合适。记录该条件下色谱图,以被测组分灯盏乙素
计算理论塔板数为6000,灯盏乙素与相邻峰的分离
度为28。
根据试验结果,考虑到仪器、色谱柱、流动相的
配制和温度等系统因素的影响,规定理论板数按灯
盏乙素峰计算,应不低于4000。
因此,根据试验结果,所选的色谱条件如下色谱
柱ZorbaxXDBC18(46mm×150mm,5μm);流动
相乙腈水磷酸(20∶80∶02);检测波长327nm;柱
温室温;流速10mL·min-1。
系统适用性:灯盏花乙素、灯盏花素色谱图见图
1,2,表明该色谱条件可以用于灯盏乙素的测定。
1.灯盏乙素。
图1 灯盏乙素HPLC图
1.灯盏乙素。
图2 灯盏花素HPLC图
2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取对照品储备液
一定量,依次配成1~40mg·L-1的对照品液,进样
20μL,测定灯盏乙素峰面积,以灯盏乙素峰面积为
纵坐标,进样量为横坐标拟合标准曲线,得回归方程
Y=30491116X(r=09999),结果表明,灯盏乙素
进样量在225~540ng,其峰面积与进样量有良好
的线性关系。
2.1.5 精密度试验 准确吸取3个不同浓度的对
照品溶液200μL,各连续进样6次,测定灯盏乙素
峰面积,结果其 RSD分别为 023%,023%,
014%,表明精密度符合要求。
2.1.6 稳定性试验 取同一样品溶液,分别在0,
05,1,2,4,8,24h后进样20μL,测定灯盏乙素峰
面积。结果其峰面积 RSD0360%,可见样品在24
h内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验 分别精确称取同一批灯盏花
素原料6份,按供试品制备项下制备,依法操作。每
份重复3次进样20μL,结果6份原料中灯盏乙素
含量的RSD244% ,表明重复性良好,符合要求。
2.1.8 加样回收试验 在已知含量的灯盏花素中加
入一定量的灯盏乙素对照品,按供试品制备项下制备
成加样供试品溶液,再按上述色谱条件测定;结果见
表1,其平均回收率9728%,RSD146,符合试验要求。
表1 灯盏乙素加样回收率
称样量
/mg
测得量
/mg
加入量
/mg
实测值
/mg
均值
/%
RSD
/%
552 524 410 918
550 523 415 926
553 525 565 1065 9728 15
561 533 571 1102
557 529 655 1166
557 529 663 1179
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2.2 灯盏花素在不同溶剂中平衡溶解度的测定
取过量的灯盏花素原料药数份,置于250mL烧
杯中,分别加入甲醇、乙醇、Ringer'S液、生理盐水、蒸
馏水、pH70磷酸盐缓冲液(PBS)和pH75PBS各
100mL,温度控制在37℃,搅拌子搅拌,在适当时间
点吸取上清液,经045μm微孔滤膜过滤,弃去初
滤液,取续滤液作适当稀释后,按21测定灯盏花乙
素浓度,见表2。
表2 灯盏花素不同溶剂中的溶解度 mg·L-1
溶剂 1 2 3 珋x±s
生理盐水 2138 1939 2127 2068±112
蒸馏水 7978 7969 7857 7935±068
pH70PBS 795065 799134 792187 795462±3490
pH75PBS 1875436 1843521 1893494 1870817±25305
Ringer'S液 369954 366711 366454 367040±2764
甲醇 21085 21138 20991 21071±074
乙醇 18550 18484 18269 18434±147
2.3 灯盏花素油/水分配系数的测定
精密称取105℃干燥至恒重的灯盏花素原料药
适量,用pH70PBS溶解,配制成浓度为1g·L-1
的溶液作为母液。精密量取一定量的母液置于25
mL量瓶中,分别以 30,40,50,65,70等不同
pH蒸馏水稀释至刻度,摇匀,作为供试液。精密量
取各供试液适量与正辛醇适量置于具塞试管中,试
验前蒸馏水和正辛醇分别用正辛醇和蒸馏水饱和。
将具塞试管在涡旋混合器上震荡一定的时间,待平
衡后,37℃静置分离两相,取水相3000r·min-1离
心15min。按2.1测定萃取前后水相中的药物浓
度。计算油相中的药物浓度,并按下式计算油/水分
配系数:
Papp=C0/Cw(1)
式中Papp为油/水分配系数;C0为分配平衡后油
相中的药物浓度;CW为水相中的药物浓度。结果在
pH为 30,40,50,65,70,相应 Papp为 5362,
0542,0371,0328,0143,表明灯盏花素的 Papp随
着pH增大而减小,在 pH30与 pH40间发生突
变,Papp明显降低。
2.4 灯盏花素溶液稳定性考察
2.4.1 溶剂对灯盏花素溶液稳定性的影响 精密
称取灯盏花素原料药数份,分别用甲醇、乙醇、Rin
ger'S液、N.S.配制成浓度为10mg·L-1的灯盏花
素溶液,于37℃恒温水浴中放置10h,取样,按2.1
测定灯盏花乙素浓度,以10h的药物含量变化率为
指标考察其稳定性。结果见表3,表明灯盏花素在
Ringer液中不稳定。
表3 灯盏花素在不同溶剂中的稳定性(n=3)
溶剂 含量变化率/%
生理盐水 9513±152
Ringer'S液 5687±094
甲醇 9751±078
乙醇 9825±069
2.4.2 温度对灯盏花素水溶液稳定性的影响 分
别用预热至40℃,55℃,75℃的蒸馏水配成浓度为
10mg·L-1的灯盏花素水溶液,各置于 40℃,
55℃,75℃恒温水浴中10h,取样,按2.1测定灯盏
花乙素浓度,以10h的药物含量变化率为指标考察
其稳定性。结果见表4,提示温度可显著影响灯盏
花素水溶液的稳定性,温度升高,其稳定性降低;
40℃时,灯盏花乙素含量为最初含量的95%以上,
75℃时,药物的含量还不到最初含量的60%。
表4 灯盏花素溶液在不同温度下的稳定性(n=3)
温度/℃ 含量变化率/%
40 9654±151
55 8978±048
75 5867±081
2.4.3 pH对灯盏花素水溶液稳定性的影响 分别
用预热至37℃的pH53的蒸馏水,pH65PBS,pH
70PBS,pH75PBS配成浓度为10mg· L-1的灯盏
花素水溶液,分别于37℃恒温水浴中放置10h,取
样,HPLC测定,以10h的药物含量变化率为指标考
察其稳定性。结果见表5,37℃时,在pH53的蒸馏
水中,药物的含量为最初含量的95% 以上,而随 pH
升高,药物的含量逐渐降低,pH75时,10h后的含
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量仅为原来的30% 左右;可见pH对灯盏花素水溶
液的稳定性具有显著影响,随着 pH升高,其稳定性
降低,灯盏花素水溶液稳定的pH为53。
表5 灯盏花素溶液在不同pH下的稳定性(n=3)
pH 含量变化率/%
53 9543±128
65 6614±031
70 4636±045
75 3258±112
2.4.4 抗氧剂 EDTA2Na对灯盏花素溶液稳定性
的影响 为提高灯盏花素溶液的稳定性,本研究对
抗氧剂 EDTA2Na的用量进行了考察,以蒸馏水,
pH65PBS,pH70PBS,pH75PBS为溶解介质的
同一浓度灯盏花素溶液(10mg·L-1),分别加入一
定量EDTA2Na,使成含不同浓度EDTA2Na的灯盏
花素溶液,于37℃恒温水浴中放置10h,取样,按
2.1测定灯盏花乙素浓度,以10h的药物含量变化
率为指标考察其稳定性。结果见表6,可见质量浓
度为20g·L-1的EDTA2Na能改善灯盏花素溶液
的稳定性。
表6 EDTA2Na对灯盏花素溶液稳定性的影响(n=3)
溶剂 EDTA2Na/g·L-1 含量变化率/%
蒸馏水 05 10027±041
10 10056±029
20 10048±018
pH65PBS 05 9421±024
10 9685±053
20 9908±058
pH70PBS 05 9314±091
10 9558±141
20 9819±087
pH75PBS 05 9103±072
10 9351±036
20 9637±099
3 讨论
3.1 灯盏花素含量测定方法的建立
目前灯盏花素一般以灯盏乙素作为质量控制指
标,灯盏乙素的含量测定方法主要有紫外分光光度
法[34],HPLC[5],HPLCMS[6]及 HPCE[7]。紫外分光
光度法操作简便,但对灯盏乙素的选择性差;HPLC
MS可实现对灯盏乙素的精确定量,检测限可达到1
ng,分析速度快,但是对仪器要求较高;HPCE测定
虽然简便、快速、准确,但高效毛细管电泳仪普及率
低。本研究建立了 HPLC紫外法,方法学考察结果
显示精密度、稳定性、重现性、回收率均符合要求,该
法仪器要求相对较低,检测方法简便、快速、准确,易
于应用。
3.2 灯盏花素溶解度的测定
溶解度是药物重要的物理参数之一,溶解度的
测定对于药物剂型选择,处方筛选及制剂成型工艺
等均具重要意义。本实验测得灯盏花素在生理盐
水,蒸馏水,pH70PBS及pH75PBS,Ringer'S液,
甲醇、乙醇中的平衡溶解度分别为(2068±112),
(7935±068),(795462±3490),(1870817±
25305),(367040±2764),(21071±074),
(18434±147)mg·L-1。
3.3 灯盏花素油水分配系数
油水分配系数的测定可以预测药物经胃肠道与
黏膜的吸收情况。本实验测得灯盏花素在 pH30,
40,50,65,70下的 Papp分别为 5362,0542,
0371,0328,0143;结果表明,灯盏花素的油水分
配系数随pH的增大而降低。
3.4 灯盏花素水溶液稳定性的研究
研究药物水溶液的稳定性,对其水溶液制剂的
研制具有十分重要的意义。灯盏花乙素为4′OH黄
芩苷,有文献报道[8],黄芩苷在水溶液中易发生 β
糖苷键水解,其后相邻的3个酚羟基被氧化成醌式
结构而失效。由于灯盏乙素与黄芩苷的化学结构相
似性,灯盏花素可能具有类似的不稳定性。作者在
预初试验中也发现灯盏花素不是很稳定,因而本研
究考察了灯盏花素水溶液的稳定性。
本研究表明灯盏花素在 Ringer液中不稳定;温
度、pH对灯盏花素水溶液的稳定性存在着显著性影
响,其稳定性随温度、pH升高而迅速下降。本研究
预实验还考察了 EDTA2Na、柠檬酸、抗坏血酸等抗
氧剂对灯盏花素溶液稳定性的影响,结果 EDTA
2Na能明显改善其稳定性,因此选用 EDTA2Na作
为灯盏花素溶液的抗氧剂,并考察其用量。结果浓
度为20g·L-1的EDTA2Na能改善灯盏花素溶液
的稳定性。
[参考文献]
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Studyonphysicochemicalpropertiesandinfluencefactorson
stabilityofbreviscapine
SHISenlin1,XULianying2,MAOZhankai1,LIWanli1,YEJiaoyun,GAOMin1
(1.ColegeofPharmacy,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou,310053,China;
2.ColegeofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiChineseMedicalUniversity,Shanghai201203,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatethephysicochemicalconstantssuchasequilibriumsolubilityandapparentpartitioncoefi
cients(Papp),andstudytheefectsoftemperature,pHvalueandantioxidantsonthestabilityofbreviscapinesolution.Method:The
equilibriumsolubilityofbreviscapineinvariousmediumandthePappofbreviscapineunderdiferentpHconditionsweredeterminatedby
RPHPLC,andtheefectsoftemperature,pHvalueandantioxidantsonthestabilityofsolutionwereinvestigatedbytakingchange
ratesofdrugcontentin10hasdetectionindex.Result:Theequilibriumsolubilityofbreviscapineinsaline,distiledwater,pH70
PBS,pH75PBS,Ringer'Sfluid,methanolandethanolwere(2068±112),(7935±068),(795462±3490),
(1870817±25305),(367040±2764),(21071±074),(18434±147)mg·L-1respectively;whileinpHvalue30,
40,50,65,70solution,thePappwere5362,0542,0371,0328and0143respectively.Thestabilityofbreviscapineinthe
Ringer′sfluidwastheworstandthestabilitywassignificantlydecreasedwiththeincreaseoftemperatureandpHvalueanditcouldbe
improvedbyEDTA2Na.Conclusion:TheestablishedHPLCassaywasaccurateandconvenient.ThePappofbreviscapineisde
creasedbyincreasedthepHvalue,whileintheaqueoussolutiontheequilibriumsolubilityofbreviscapineincreasewiththepHincr
ese.EDTA2Nacanbeusedasanantioxidantofbreviscapinesolution.
[Keywords] breviscapine;equilibriumsolubility;apparentpartitioncoeficients(Papp);stability
[责任编辑 周 驰]
本刊重要启示
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