免费文献传递   相关文献

Effects of three C21 steroidal saponins from Cynanchum auriculatum  on cell growth and cell cycle of human lung cancer A549 cells

白首乌中3个C21甾体皂苷类成分对人肺癌A549细胞生长及周期的影响


目的:探讨白首乌的3个C21甾体皂苷类成分对人肺癌A549细胞生长的抑制作用及对细胞周期的影响。方法:按浓度梯度配置3个C21甾体皂苷类成分,使终浓度分别为5,10,20,40,60,80,100 μmol·L-1,采用MTT法检测3个C21甾体皂苷类成分作用48 h各浓度对人肺癌A549细胞生长的抑制作用;分别选择3个C21甾体皂苷类成分的IC50近似浓度(47,34,60 μmol·L-1)处理细胞12,24,48 h后,采用流式细胞仪检测对细胞周期变化的影响。结果:分离得到的3个C21甾体皂苷:隔山消苷C1N、隔山消苷C3N、隔山消苷K1N作用48 h的IC50分别为46.07,33.02,59.92 μmol·L-1;细胞周期分析显示, 随着作用时间的延长(12,24,48 h),隔山消苷C1N、隔山消苷C3N使G0/G1期细胞数逐渐增加,S和G2/M期细胞数逐渐减少(P<0.05,P<0.01);隔山消苷K1N使S期细胞数减少,G2/M期细胞数增加(P<0.05,P<0.01)。结论:3个甾体皂苷对A549细胞均有不同程度的生长抑制作用,并呈浓度依赖性,其作用机制可能与3个甾体皂苷诱导细胞周期阻滞有关。

Objective: To investigate the inhibition of three C21 steroidal saponins from Cynanchum auriculatum on the cell growth and cell cycle of human lung cancer A549 cells.  Method: A549 cells were exposed to three C21 steroidal saponins of different concentrations (5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μmol·L-1) for 48 hours.  After 48 h, MTT assay was used to evaluate the inhibiting effects of three C21 steroidal saponins on the proliferation of the A549 cells. Exponential growth phase A549 cells were treated with 47, 34, 60 μmol·L-1 of three C21 steroidal saponins respectively for 12, 24, 48 h, then the changes of cell cycle were analyzed by flow cytometry.  Result: The three C21 steroidal saponins could inhibit the growth of A549 cells in dose-dependent manner and IC50  is 46.07 mol·L-1, 33.02 mol·L-1, 59.92 mol·L-1 respectively. The cell cycle analysis showed that wilfoside C1N and wilfoside C3N increased the percentage of G0/G1 phase cells and decreased G2/M and S-phase cells while the proportion of cells in S-phase was lower and in G2/M phase the proportion was higher than control when the cells were cultivated with wilfoside K1N (P<0.05, P<0.01).  Conclusion: Three C21 steroidal saponins could inhibit the proliferation of A549 cells in dose-dependent manner and the mechanism may be related to its arresting the cell cycle.


全 文 :白首乌中3个 C21甾体皂苷类成分对人肺癌
A549细胞生长及周期的影响
姚楠1,顾晓洁2,李友宾1
(1.江苏省中医药研究院 中药化学室,江苏 南京 210028;
2.中国药科大学 现代中药教育部重点实验室 生药学教研室,江苏 南京 210038)
[摘要] 目的:探讨白首乌的3个C21甾体皂苷类成分对人肺癌A549细胞生长的抑制作用及对细胞周期的影响。方法:
按浓度梯度配置3个C21甾体皂苷类成分,使终浓度分别为5,10,20,40,60,80,100μmol·L
-1,采用MTT法检测3个C21甾体
皂苷类成分作用48h各浓度对人肺癌A549细胞生长的抑制作用;分别选择3个C21甾体皂苷类成分的IC50近似浓度(47,34,
60μmol·L-1)处理细胞12,24,48h后,采用流式细胞仪检测对细胞周期变化的影响。结果:分离得到的3个 C21甾体皂苷:
隔山消苷C1N、隔山消苷C3N、隔山消苷K1N作用48h的IC50分别为4607,3302,5992μmol·L
-1;细胞周期分析显示,随
着作用时间的延长(12,24,48h),隔山消苷 C1N、隔山消苷 C3N使 G0/G1期细胞数逐渐增加,S和 G2/M期细胞数逐渐减少
(P<005,P<001);隔山消苷K1N使S期细胞数减少,G2/M期细胞数增加(P<005,P<001)。结论:3个甾体皂苷对
A549细胞均有不同程度的生长抑制作用,并呈浓度依赖性,其作用机制可能与3个甾体皂苷诱导细胞周期阻滞有关。
[关键词] 白首乌;C21甾体皂苷;生长抑制;细胞周期
[收稿日期] 20081020
[基金项目] 江苏省科技厅公益项目(BM2004525)
[通信作者] 李友宾,Tel:(025)85639644,Email:liyoubinli@so
hu.com
  近年来研究证明,白首乌 Cynanchumauricula
tum具有抗肿瘤作用,并已证实 C21甾体类化合物
是其中公认的主要活性成分[1]。体外抗肿瘤实验
白首乌新苷 A,B,白首乌甾体总苷对4种人癌细
胞株具有显著的抑制作用[23]。耳叶牛皮消苷 A
在体外对人乳腺癌细胞、人肝癌细胞和人卵巢癌
细胞有显著的抑制作用,对小鼠体内接种的 S180
肉瘤也有很好的抑制作用[4]。但还未发现对肺癌
A549抑制作用的报道。本实验以人肺癌 A549细
胞株为实验对象,对从白首乌中分离得到的 3个
C21甾体皂苷类成分进行体外对人肺癌 A549细胞
生长及周期的影响,为抗肿瘤中药的开发和临床
应用提供依据。
1 材料
1.1 细胞株 人肺癌 A549细胞株购自中国科学
院上海细胞生物学研究所。
1.2 药物 白首乌购自江苏省盱眙县,经本院资源
化学室李友宾博士鉴定为萝雐科植物白首乌Cau
riculatum干燥的根茎。采用95%乙醇热回流提取,
硅胶、SephadexLH20和ODS柱层析、半制备 HPLC
等方法分离得到的3个C21甾体皂苷类成分,结构经
1D,2DNMR,MS分析及文献对照,确定为隔山消苷
C1NwilfosideC1N,隔山消苷C3NwilfosideC3N,隔山
消苷K1NwilfosideK1N
[5]。临用时将药物用DMEM
培养液分别配制成不同浓度备用,DMSO终浓度小
于05%。
1.3 试剂 DMEM培养基(GIBCO,450542);新生
牛血清(民海生物工程有限公司,080508);MTT
(Amresco,0793);胰酶(Amresco,0458);碘化吡啶
(PI染液,Sigma);核糖核酸酶(RNaseA,Sigma);
TritonX100(Amresco,010T0405);二甲亚砜(Amres
co,019D0404);氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公
司,0710052)。
1.4 仪器 HERAcel150CO2细胞培养箱(美国
Thermo公司);LabconcoclassⅡtypeA2生物安全
柜(美国 LABCONCO公司);ZeissAxioobserverA
倒置相差显微镜(日本 OLYMPUS公司);Thermo
MultiskanSpectrum酶标仪(美国 Thermo公司);
MH1403平版振荡器(海门其林贝尔仪器制造有
限公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国 BD公
司)。
·8141·
第34卷第11期
2009年6月
                           
Vol.34,Issue 11
 June,2009
2 方法
2.1 细胞培养 细胞用含10%小牛血清的 DMED
培养基,于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养,细胞
呈单层生长,达80%左右融合时传代,细胞消化采
用025%的胰酶和002% EDTA混合消化液。
2.2 细胞增殖抑制率的测定[6] 取对数生长期的
A549细胞,用025%胰酶和002% EDTA混合消
化液消化,用含10%小牛血清的DMEM培养基调整
细胞密度5×104个/mL,接种至96孔培养板中,每
孔100μL细胞悬液,继续培养 24h后,吸弃培养
液,更换含不同药物浓度(5,10,20,40,60,80,100
μmol·L-1)及溶剂对照的新鲜培养液,每个浓度设
6个复孔,并设空白调零孔。继续培养48h,每孔加
入10μLMTT(5g·L-1),继续培养4h,吸弃上清,
每孔加入100μLDMSO,振荡10min,溶解结晶,用
酶标免疫检测仪测定492nm波长处的吸光度(A)。
实验重复3次,取平均值。以溶剂处理为对照组,由
A计算抑制率,并由此求得半数抑制浓度(IC50)。
细胞生长抑制率(%)=(A对照 -A用药)/A对照 ×100%
2.3 流式细胞仪检测[7] 取对数生长期细胞制成
单细胞悬液,调整细胞数为1×105个/mL,接种于6
  
孔板中,每孔2mL细胞悬液,培养24h后,实验组
分别加入含药培养液(增殖抑制实验筛选的有效浓
度),并设立正常对照组和阳性组(氟尿嘧啶)。在
12,24,48h分别收集细胞,离心,PBS洗涤,400目
尼龙膜过滤,调整细胞密度为1×106个/mL,加入含
50mL·L-1PI,25mg·L-1RNaseA染液1mL,4℃
避光染色30min后上细胞仪检测,分析细胞周期。
2.4 统计学方法 各组数据以 珋x±s表示,采用
SPSS软件计算对细胞的半数抑制浓度(IC50);用
Modfit软件对流式细胞仪测定的荧光强度进行分
析,根据荧光强度求出 G0/G1,S,G2期细胞的百分
率,两组间比较采用t检验分析。
3 结果
3.1 对人肺癌 A549细胞株增殖的影响 将7个
不同剂量的隔山消苷C1N(化合物1),隔山消苷(化
合物2),隔山消苷K1N(化合物3)分别作用于肺癌
A549细胞48h后,用MTT法检测细胞的存活情况,
发现3个C21甾体皂苷类成分对细胞均存在不同程
度的抑制作用,并随着各化合物浓度的增加,生长抑
制率增强,其 IC50依次为(4607±421),(3302±
577),(5992±469)μmol·L-1(表1)。
表1 3个C21甾体皂苷对人肺癌A549细胞的生长抑制作用(珋x±s,n=6) % 
化合物
剂量/μmol·L-1
5 10 20 40 60 80 100
1 1029±092 218±237 2739±168 5089±367 6543±591 8362±500 9537±230
2 1106±150 2732±473 4096±323 5506±700 7330±514 8348±454 9375±291
3 185±063 738±090 1279±251 2527±057 5467±667 6719±1371 9131±344
3.2 对人肺癌 A549细胞周期分布的影响 隔山
消苷C1N、隔山消苷C3N、隔山消苷K1N浓度分别选
择47,34,60μmol·L-1(IC50近似值)处理细胞12,
24,48h后,与对照组相比,隔山消苷 C1N(1)作用
12,24,48h后 G0/G1期细胞比例分别增加 174,
195,247%(P<001),S期细胞比例分别减小
182,190,209%(P<001),G2/M期细胞比例略
有下降(P<005);隔山消苷C3N(2)作用12,24,48
h后G0/G1期细胞比例分别增加69,146,174%
(P<005,P<001),S期细胞比例分别减小102,
157,209%(P<005,P<001),G2/M期细胞比
例变化不大;隔山消苷 K1N(3)组作用 12,24,48h
后S期细胞比例分别减小112,112,107%(P<
005,P<001),G2/M期细胞比例分别增加134,
89,90%(P<005,P<001),G0/G1期细胞比例
变化不大(表2)。
4 讨论
白首乌C21甾体苷对多种肿瘤具有抑制作用,是
一个有前景的防治肿瘤的药物。但从白首乌中系统
分离的甾体皂苷类成分在肺癌细胞 A549中的研究
还未见报道。为进一步证实 C21甾体苷的广谱抗肿
瘤活性,本实验选用 A549细胞株为靶细胞,进行了
体外抑瘤实验。实验结果表明,白首乌中的3个C21
甾体皂苷类成分对 A549细胞株均有不同程度的抑
制作用,且呈现良好的剂量依赖关系。
肿瘤共有的特性是失控性生长,其主要分子机
制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多或凋亡减
少[8]。本实验采用流式细胞检测法对 C21甾体苷的
·9141·
第34卷第11期
2009年6月
                           
Vol.34,Issue 11
 June,2009
   表2 3个C21甾体皂苷对人肺癌A549细胞周期分布的影响(珋x±s,n=3) % 
组别
浓度
/μmol·L-1
细胞周期
G0/G1 S G2/M
对照 - 6587±401 2470±271 943±142
112h 47 8326±2882) 650±2752) 1023±079
124h 47 8538±4382) 566±3452) 896±203
148h 47 9054±2182) 380±2672) 567±0641)
212h 34 7278±492 1455±4761) 1267±206
224h 34 8045±5391) 899±6601) 1055±219
248h 34 8329±3412) 378±1652) 1294±183
312h 60 6370±151 1350±2462) 2280±1262)
324h 60 6817±468 1346±3242) 1838±3651)
348h 60 6758±115 1403±3071) 1839±1922)
阳性药3) 100 6194±074 3551±4281) 048±0162)
  注:与对照组比较1)P<005,2)P<001;3)剂量单位为mg·L-1。
细胞周期影响进行了研究。结果显示,隔山消苷 C1
N、隔山消苷C3N使A549细胞阻滞在G0/G1期,通
过阻止受损细胞进入 S期进行 DNA的合成而抑制
肺癌细胞的过度增殖。隔山消苷 K1N可以将通过
G0/G1期而进入S期的肺癌细胞阻滞于 G2/M期来
抑制肺癌细胞的生长增殖。以上3个 C21甾体皂苷
类作用机制的不同可能与它们母核苷元结构类型的
不同有关。其影响细胞周期的作用机制是通过影响
周期蛋白合成,还是通过其他途径影响基因表达,还
需要今后进一步深入研究。
目前从中草药中寻找天然抗肿瘤活性成分是抗
癌药物研究的一个重要途径和研究热点[9],随着对
C21甾体皂苷类成分的深入研究,有望获得低毒并具
有明确抗肿瘤作用和机制的抗癌药物。
[参考文献]
[1] SongJM,LiuHL,DingXL.EficacyandtoxicityofC21steroidal
  
   glycosidesfromBaishouwu[J].FoodSci,2002,23:100.
[2] 张如松,叶益萍,沈月毛,等.白首乌体外抑制肿瘤细胞的成分
研究[J].药学学报,2000,35(6):431.
[3] 曾郁敏,顾立刚.白首乌甙体外抗肿瘤作用的实验研究[J].中
国中医药信息杂志,2000,7(4):30.
[4] ZhangRS,LiuYL,WangYQ,etal.Cytotoxicandapoptosis
inducingpropertiesofauriculosideAintumorcels[J].Chemistry
&Biodiversity,2007,4:887.
[5] GuXJ,YaoN,QianSH,etal.FournewC21steroidalglyco
sidesfromtherootsofCynanchumauriculatum[J].Helvetica
ChimicaActa,2009,92:88.
[6] 张均田.现代药理实验方法.上册[M].北京:北京医科大学中
国协和医科大学联合出版社,1998:819.
[7] SpectorDL,GoldmanRD,LeinwandLA.细胞实验指南.上册
[M].北京:科学出版社,2001:119.
[8] KarunagaranD,JosephJ,KumarTR.Celgrowthregulation
[J].AdvExpBiol,2007,595:245.
[9] YangJY,XuJY,WuXM,etal.Researchontheantitumor
naturalproducts[J].ChinJMAP,2007,4(24):277.
·0241·
第34卷第11期
2009年6月
                           
Vol.34,Issue 11
 June,2009
EfectsofthreeC21steroidalsaponinsfromCynanchumauriculatum
oncelgrowthandcelcycleofhumanlungcancerA549cels
YAONan1,GUXiaoJie2,LIYoubin1
(1.DepartmentofPhytochemistry,JiangsuProvincialInstituteofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210028,China;
2.KeyLaboratoryofModernChineseMedicines,MinistryofEducationofPRCandDepartmentofPharmacognosy,
ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheinhibitionofthreeC21steroidalsaponinsfromCynanchumauriculatumonthecel
growthandcelcycleofhumanlungcancerA549cels.Method:A549celswereexposedtothreeC21steroidalsaponinsofdiferent
concentrations(5,10,20,40,60,80,100μmol·L-1)for48hours.After48h,MTTassaywasusedtoevaluatetheinhibiting
efectsofthreeC21steroidalsaponinsontheproliferationoftheA549cels.ExponentialgrowthphaseA549celsweretreatedwith47,
34,60μmol·L-1ofthreeC21steroidalsaponinsrespectivelyfor12,24,48h,thenthechangesofcelcyclewereanalyzedbyflow
cytometry.Result:ThethreeC21steroidalsaponinscouldinhibitthegrowthofA549celsindosedependentmannerandIC50is4607
mol·L-1,3302mol·L-1,5992mol·L-1respectively.ThecelcycleanalysisshowedthatwilfosideC1NandwilfosideC3Nin
creasedthepercentageofG0/G1phasecelsanddecreasedG2/MandSphasecelswhiletheproportionofcelsinSphasewaslower
andinG2/MphasetheproportionwashigherthancontrolwhenthecelswerecultivatedwithwilfosideK1N(P<005,P<001).
Conclusion:ThreeC21steroidalsaponinscouldinhibittheproliferationofA549celsindosedependentmannerandthemechanism
mayberelatedtoitsarestingthecelcycle.
[Keywords] Cynanchumauriculatum;C21steroidalsaponins;growthinhibition;celcycle
[责任编辑 古云侠]
本刊重要启事
本刊已开通在线支付功能,作者请登录本刊网站 www.cjcmm.com.cn“作者中心”,点击在线充值,可以
选择网上银行(没开通网银功能的帐户可以选择信用卡充值)和手机充值卡2种充值方式,充值成功后系统
会显示您的账号余额。然后您可以根据稿件状态和编辑部邮件通知来缴纳相应的费用,如审稿费,发表费
等。如有疑问请咨询鲍雷编辑:13683362408,178562955@qq.com。
·1241·
第34卷第11期
2009年6月
                           
Vol.34,Issue 11
 June,2009