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Quantitative analysis of lupeol in leaves of Ilex cornuta by RP-HPLC

RP-HPLC测定枸骨叶中羽扇豆醇的含量



全 文 :Pharmacokineticsandbioavailabilitystudyofdanshensuinrat
PANJianyang1,ZHAOXiaoping2,SHAOQing1
(1.PharmaceuticalInformaticsInstituteofZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;
2.ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou,310053,China)
[Abstract] Objective:Tostudythepharmacokineticsandbioavailabilityofdanshensuinrat.Method:TwelveSDratswere
randomlydividedinto2groupsforbothoralandintravenousadministrationofdanshensuatasingledoseof46mg·kg-1.UPLCtriple
quadrupolemassspectrometricmethodwasappliedtodeterminetheplasmaconcentrationofdanshensu.Thecalculationsofpharmaco
kineticparameterswereperformedwithtopfitprogram.Pharmacokineticsandbioavailabilityofdanshensuwereinvestigatedinratafter
administrationofdanshensu.Result:Fororaladministration,Cmax,tmax,t1/2 andAUCwere(1419±439)ng· mL
-1,
(60.1±19.0)min,(138.9±42.2)minand(2.01±0.40)×105ng·min·mL-1,respectively.Whileforintravenousadministra
tion,t1/2andAUCwere(159.9±77.2)minand(2.11±0.55)×10
6ng·min·mL-1,respectively.Conclusion:Theoralbio
availabilityofdanshensuwasrelativelylowat9.53%,whichwassuggestingthatthepoorabsorptionofdanshensubyoraladerministra
tion.Therewasnoobviousdiferencebetweenoralandintravenousadministration
[Keywords] Danshensu;bioavailability;pharmacokinetics;UPLCtriplequadrupolemassspectrometery
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20070109
[基金项目] 上海市教委科研项目青年教师项目(02CQ20);
上海市科委项目(05DZ19742);上海市重点学科建设项目(Y0301)
[通讯作者] 吴,Tel:(021)51322513,Email:laurawu2000@
hotmail.com;李颜,Tel:(021)643691818789,Email:lycft@163.com
RPHPLC测定枸骨叶中羽扇豆醇的含量
李 颜1,2,3,吴 1,2,王峥涛1,2,史薇娜4,郭 澄3
(1.上海中医药大学 中药研究所 中药标准化教育部重点实验室,上海 201203;
2.上海中药标准化研究中心,上海 201203;
3.上海交通大学 附属第六人民医院 药剂科,上海 200233;
4.苏州市高新区枫桥人民医院 药剂科,江苏 苏州 215129)
[摘要] 目的:建立RPHPLC法测定枸骨叶中羽扇豆醇含量的方法,为枸骨叶的质量分析和评价提供科学依
据。方法:采用AgilentZorbaxODS柱(4.6mm×150mm,5μm),柱温为25℃,乙腈水(8∶2)为流动相,在流速1.0
mL·min-1和紫外检测波长210nm下进样20μL对枸骨叶甲醇提取物进行HPLC分析。结果:羽扇豆醇在0.25~
12.7μg(r=0.9998)呈良好的线性关系,平均加样回收率为100.2%(RSD4.3%)。结论:本方法简便,重复性好,
为评价枸骨叶药材的质量提供科学依据。
[关键词] 枸骨叶;羽扇豆醇;RPHPLC
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)02014903
  枸骨叶为冬青科Aquifoliaceae冬青属IlexL.植 物枸骨IlexcornutaLindl.Ex.Paxt.的干燥叶,主要
分布于在我国南方江苏、湖南、安徽、浙江等地,是苦
丁茶的主要来源植物之一。传统中医药理论认为,
枸骨叶具有清热养阴,平肝益肾,散风通络等功
效[1]。现代药理学研究表明,枸骨叶具有抗生育,
扩张冠状动脉,抗菌等作用[1,2]。大量的植物化学
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研究揭示了三萜及其苷类是枸骨叶中的主要活性成
分[35]。然而对于该植物的质量控制分析却鲜有报
道,仅1995年郭亚健等报道了采用薄层扫描法对不
同采收期枸骨叶中熊果酸的含量测定[6]。本研究
是在对枸骨叶植物化学和药理活性研究的基础
上[79],选择在枸骨叶中大量存在的三萜类化合物羽
扇豆醇为指标性成分,应用RPHPLC对不同产地枸
骨叶中羽扇豆醇的含量进行分析,从而为评价枸骨
叶药材的质量提供新的方法和科学依据。
1 仪器与试药
Agilent1100型高效液相色谱仪包括 G1315A
型DAD检测器,自动进样器和柱温箱,MetlerAE
200型电子分析天平,KQ-250DB型数控超声波清
洗器(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈(色谱纯,
Sigma),水为超纯水,氯仿、醋酸乙酯、甲醇(分析
纯,上海化学试剂公司),羽扇豆醇对照品(由上海
中药标准化研究中心提供,HPLC检测其纯度≥
98%)。
收集10批枸骨叶样品,基源由上海中医药大学
中药研究所吴立宏副研究员鉴定,10批样品均为冬
青科冬青属植物枸骨 I.cornuta的叶。标本存放于
上海中医药大学中药研究所标本室(标本号
0510011)。药材于60℃干燥24h,粉碎,过24目
筛,制成粗粉,备用。
2 方法与结果
2.1 样品制备方法的建立
2.1.1 提取溶剂 分别以氯仿、醋酸乙酯和甲醇为
溶剂,采用超声振荡法提取30min,羽扇豆醇的色谱
峰面积进行考察和比较,同时考虑到色谱峰的峰宽,
对称系数等因素,因此选择甲醇作为提取溶剂。
2.1.2 溶剂用量 取药材0.5g,精密称定,分别加
入甲醇10,20,50mL,超声振荡提取30min,对羽扇
豆醇的色谱峰面积进行考察和比较,结果表明,3种
体积制备的供试品溶液,羽扇豆醇的峰面积无明显
差异(RSD<2.4%),因此,选择20mL作为提取溶
剂的用量。
2.1.3 提取方法 取药材0.5g,精密称定,加入甲
醇20mL,分别采用a.热回流法30min;b.热回流法
60min;c.索氏提取法(3h);d.超声振荡法(30
min);e.超声振荡30min后温浸1h再超声振荡30
min;f.40℃水浴温浸16h后超声振荡30min。对
羽扇豆醇的色谱峰面积进行考察和比较,6种提取
方法所得的色谱峰面积分别为(2965.8,2963.1,2
950.4,2653.2,2663.7,2921.1)。因此,40℃水浴
温浸16h超声振荡30min(f)和热回流法(a,b,c)
的提取效率高于其他方法,鉴于试验操作的简便性,
因此选择40℃水浴温浸16h后超声振荡30min为
提取方法。
2.2 色谱条件 色谱柱 AgilentZorbaxODS(4.6
mm×150mm,5μm);流动相 乙腈水(8∶2),流速
1.0mL·min-1;紫外检测波长 210nm;柱温为 25
℃;进样量20μL。理论塔板数按羽扇豆醇计算,不
低于7500。在该液相色谱条件下,羽扇豆醇对照品
和枸骨叶样品的色谱图见图1。
图1 羽扇豆醇对照品和枸骨叶样品的HPLC图
A羽扇豆醇对照品;B枸骨叶样品;1羽扇豆醇
2.3 羽扇豆醇对照品溶液的制备 取羽扇豆醇对
照品适量,精密称定,加甲醇溶解并制成254μg·
mL-1的溶液,摇匀,即得。
2.4 供试品溶液的制备 取枸骨叶样品粉末约
0.5g,精密称定,置于50mL具塞三角瓶中,精密加
入甲醇20mL,称定质量,40℃水浴温浸16h,超声
振荡提取30min,放冷,再称重,用甲醇补足减失的
质量,摇匀。经0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,
即得供试品溶液。
2.5 标准曲线的绘制 取羽扇豆醇对照品溶液,经
0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,备用。分别进样
1,5,10,30,50μL,以所得色谱峰的峰面积为纵坐标
(Y),羽扇豆醇的量(μg)为横坐标(X)进行线性回
归,回归方程为 Y=457.6X+15.13(r=0.9998),
线性范围0.25~12.7μg。
2.6 仪器精密度试验 取254μg·mL-1的对照品
溶液,按上述色谱条件连续进样6次,计算羽扇豆醇
色谱峰的峰面积的RSD0.17%。
2.7 稳定性试验 取供试品溶液,分别在2,4,6,
8,12,24,48,72h内按上述色谱条件测定样品中羽
扇豆醇分别为 0.55%,0.56%,0.55%,056%,
0.55%,0.54%,0.53%,0.54%。结果表明,羽扇豆
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醇含量的 RSD1.7%,因此,样品溶液在72h内稳
定。
2.8 重复性试验 取来源于河南的枸骨叶样品
05g,共6份,精密称定,按2.4项下操作,分别测
定羽扇豆醇的含量。结果表明,测得含羽扇豆醇
0.58%,RSD2.4%。
2.9 加样回收率试验 取已测知含量的来源于河
南的枸骨叶样品(0.58%)约0.25g,精密称定,分
别加入一定量的羽扇豆醇对照品,按供试品的制备
及上述色谱条件测定,计算回收率。高、中、低3个
浓度,平均回收率100.2%,RSD4.30%,见表1。
表1 枸骨叶提取物中羽扇豆醇的加样回收率
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1.40 1.23 2.67 103.1    
1.40 1.22 2.57 95.9    
1.40 1.24 2.71 105.6    
1.40 1.60 3.06 103.8    
1.40 1.60 3.02 101.3 100.2 4.3
1.40 1.61 3.04 101.9    
1.39 2.05 3.46 101.0    
1.40 2.01 3.26 92.5    
1.40 1.97 3.30 96.4    
2.10 样品测定 按2.4项下制备各不同来源的枸
骨叶的供试品溶液,按上述色谱条件进行 RPHPLC
分析,按外标法计算各个收集地枸骨叶中羽扇豆醇
的百分含量见表2。
表2 不同来源枸骨叶样品中羽扇豆醇的质量分数
% 
产地 平均值 产地 平均值
上海(商品)   0.72 陕西咸阳(商品) 0.78
甘肃敦煌(商品) 0.84 河南许昌(商品) 0.58
贵州贵阳(自采) 1.21 新疆乌鲁木齐(商品) 0.64
安徽(商品)   0.77 江苏南京(自采) 0.62
安徽太平(野生) 0.70 上海张江(自采) 0.62
3 讨论
本研究在药理活性研究的基础上,选择具有抗动
脉粥样硬化的活性单体羽扇豆醇为指标性成分,建立
RPHPLC含量测定方法。通过精密度试验,重复性试
验以及加样回收率试验证实该方法简便易行,准确性
高,可为枸骨叶药材的质量控制和评价提供方法。
枸骨叶作为一味常用中药的同时也常用作园林
观赏性植物,为了比较分析不同来源枸骨叶中主要
成分的变化,获取了3种主要来源(栽培品,商品和
野生品)的枸骨叶,其中上述10个不同产地中3个
自采样品均来自园林种植。表2中列出了10个来
源枸骨叶中羽扇豆醇的质量分数,可以看出,除来自
贵州的自采样品,其余各栽培品,商品和野生品中羽
扇豆醇的含量差别不明显。
贵州产药材羽扇豆醇含量最高,这极有可能与
其采收时间相关。该样品为当年采集,而其他商品
药材的储存时间超过1年。
[参考文献]
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[7] 吴 ,程志红,刘和平,等.中药枸骨叶脂溶性化学成分的研
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[9] 龚苏晓.中国蒲公英中的羽扇豆醇对小鼠黑色素瘤细胞的诱
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QuantitativeanalysisoflupeolinleavesofIlexcornutabyRPHPLC
LIYan1,2,3,WUTao1,2,WANGZhengtao1,2,SHIWeina4,GUOCheng3
(1.InstituteofChineseMateriaMedicaKeylaboratoryofStandardizationofChineseMedicines,MinistryofEducation,
ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China;
2.ShanghaiR&DCentreforStandardizationofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China;
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3.Dept.ofPharmacy,ShanghaiSixthPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200233,China;
4.Dept.ofPharmacy,SuzhouHighTechFengqiaoPeople'sHospital,Suzhou,215129,China)
[Abstract] Objective:TodevelopanHPLCmethodforthequantitativeanalysisoflupoelinleavesofIlexcornuta.Method:
ThechromatographicseparationwasaccomplishedonanAgilentZorbaxODScolumn(4.6mm×150mm,5μm)elutedwithamobile
phasecomposedofacetonitrileandwater(8∶2),andwithaflowrateof1.0mL·min-1.TheRPHPLCexperimentswereachievedat
25℃,andUVdetectionwassetat210nm.Result:Thecalibrationcurvewaslinearintherangeof0.2512.7μg(r=0.9998)for
lupoel,withacceptableprecisionandaccuracy.ThemethodwasappliedtosamplesofI.cornutafrom10diferentlocations.Conclu
sion:Theestablishedmethodwasprovedtobesimple,reproducible,accurate,andcanbeusedtoevaluatethequalityofleavesofI.
cornuta.
[Keywords] Ilexcornuta;lupeol;RPHPLC
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20070411
[基金项目] 国家自然科学基金项目(20432030)
[通讯作者] 赵玉英,Tel:(010)82801592,Email:nmechem
@bjmueducn
鸡血藤黄酮类化合物的研究
郑 岩,刘 桦,白焱晶,马彦梅,赵玉英
(北京大学 医学部 药学院 天然药物学系,北京 100083)
[摘要] 目的:研究鸡血藤Spatholobussuberectus的化学成分。方法:用色谱法分离,用波谱法鉴定结构。结
果:分离并鉴定了5个黄酮类化合物,分别为3羟基9甲氧基紫檀烷(1)、芒柄花素钠(2,7二羟基4′甲氧基异黄
酮钠)(2)、芒柄花素(3)、大豆苷元(4)、7,4′二羟基3′甲氧基异黄酮(5)。结论:化合物1,2,5为首次从本属植物
中得到。
[关键词] 鸡血藤;黄酮
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)02015203
  鸡血藤是一味沿用千年的活血化瘀中药,以其
藤汁红如鸡血而得名,药用历史悠久,始见于《本草
备要》,历代本草均有记载,是一个植物来源较多的
中药品种,临床药用很早就分为鸡血藤药材和鸡血
藤膏两种方式。2005年版《中国药典》规定鸡血藤
原植物为密花豆 SpatholobussuberectusDunn的干
燥藤茎,具有补血、活血、舒筋活络的功效,用于治疗
月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等症。为
研究鸡血藤活性成分,首先对其的主要化学成分进
行了分离,本研究报道用溶剂法和色谱法从鸡血藤
的95%乙醇提取物的石油醚及醋酸乙酯萃取物中
分离鉴定了5个化合物:分别为3羟基9甲氧基紫
檀烷(1,medicarpin,即3hydroxy9methoxypterocar
pane)、芒柄花素钠(2,7羟基4′甲氧基异黄酮钠,
即7Osodium4′methoxyisoflavone)、芒柄花素(3,
formononetin,即 7hydroxy4′methoxyisoflavone)、
大豆苷元(4,daidzein;7,4′dihydroxyisoflavone)、
7,4′二羟基3′甲氧基异黄酮(5,4′dihydroxy3′
methoxyisoflavone)。化合物1,2,5为首次从本属植
物得到。
1 仪器与材料
岛津260型紫外分光光度仪。VXR-300型,
INOVA-500型核磁共振波谱仪,TMS内标。提取
分离用甲醇、乙醇、氯仿、醋酸乙酯、石油醚、丙酮等
均为北京化工厂分析纯产品。薄层硅胶 GF254,粗
孔硅胶(100~200目,200~300目)均为青岛海洋
化工厂产品,SephadexLH-20购自北京欧亚新技
术公司。鸡血藤药材2005年8月购于广西,由北京
大学医学部药学院天然药物学郑俊华和陈虎彪教授
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