全 文 ：橙皮苷对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡
及滑膜组织 R.S5+=RB7表达的影响
蔡莉!! 李荣+! 解雪峰+
d安徽医科大学 病理学教研室!安徽 合肥 +)$$)+%
+d安徽医科大学 药学院!安徽 合肥 +)$$)+#
摘要#!目的$研究橙皮苷!EX;对佐剂性关节炎!44大鼠滑膜细胞的凋亡诱导作用及滑膜组织 R.S5+=RB7表达的影
响) 方法##$ 只 8X大鼠随机分为 # 组#正常组%模型组%EX;!&$$ ($$ #$ 0D*KDf剂量组和雷公藤多苷组+用弗氏完全佐
剂诱导大鼠44模型+X;4琼脂糖凝胶电泳观察滑膜组织凋亡情况+原位末端标记检测!P_;IG法检测滑膜组织中滑膜细胞
凋亡及凋亡指数+免疫组化法检测滑膜组织 R.S5+ 和 RB7表达变化) 结果#EX;!($$ #$ 0D*KDf 治疗组大鼠滑膜组织
X;4经电泳分析可见凋亡细胞X;4梯状条带+EX;!($$ #$ 0D*KDf组大鼠滑膜细胞凋亡指数较模型组显著升高+与模型
组比较$EX;!($$ #$ 0D*KDf组大鼠滑膜组织R.S5+ 表达明显降低而RB7表达明显升高$各剂量 EX;均可显著降低 R.S5
+=RB7) 结论#EX;能通过抑制滑膜组织R.S5+ 和促进RB7的表达%降低R.S5+=RB7$诱导44大鼠滑膜细胞凋亡$这可能是其治
疗44的作用机制之一)
关键词#!橙皮苷+佐剂性关节炎+滑膜细胞+凋亡+R.S5++RB7
稿件编号#!+$$*$*#$$)
基金项目 # ! 安徽省 高校省级优秀青 年人才基金项目
!+$$*8 >^]$&]X
通信作者#!! 蔡莉$ PMS# ! $ #)$$ I50BNS# UJ.BNSN3
#)d./0
!!类风湿关节炎!C?ML0B@/NJ BC@?CN@NU$ >4是以关
节滑膜慢性炎症为主要病理特征的自身免疫性疾
病./ ) 佐剂性关节炎!BJ1LlB2@BC@?CN@NU$ 44是一
种免疫性炎症动物模型$该模型继发性病变的组织
病理学和免疫学改变与人类 >4类似$广泛用于评
价治疗关节炎药物的作用.+/ ) 橙皮苷! ?MUAMCNJN2$
EX;具有抗氧化%抗炎%免疫调节和诱导肿瘤细胞
凋亡等多种药理作用.)5#/ $作者在近期研究中证实灌
胃给予EX;能抑制 44大鼠继发性足肿胀和关节
炎指数$并通过下调促炎细胞因子水平%上调抗炎细
胞因子水平$调节 44大鼠异常的免疫功能和恢复
细胞因子的网络平衡.%/ ) 为进一步揭示 EX;治疗
44的作用机制$本研究采用 X;4电泳观察滑膜组
织凋亡情况$P_;IG法检测滑膜细胞凋亡及凋亡指
数$免疫组化法检测滑膜组织 RB7=R.S5+ 表达变化$
旨在探讨EX;通过诱导滑膜细胞凋亡治疗 44的
可能作用机制)
!材料
_!动物!雄性 8X大鼠$体重!($ p+$ D$安徽
医科大学实验动物中心提供$合格证号皖动准字 $
号)
_(!药物与试剂!EX;从陈皮中分离%纯化$高效
液相色谱仪测定 m*(e+雷公藤多苷!@CNA@MC6DNL0
DS6./UNJMU$ PFP$ 上海复旦复华药业有限公司$ 批号
$($#(+EX;和 PFP临用前用 $de羧甲基纤维
素钠溶液配制成相应浓度) 医用卡介苗!上海生物
制品研究所$ 批号 +$$($($+P_;IG原位检测试
剂盒!南京凯基生物科技发展有限公司+X;4GBJ5
JMC抽提试剂盒!碧云天生物技术研究所+RB7=R.S5
+ 兔抗人%大鼠%小鼠多克隆抗体!8B2@
物技术有限公司)
(!方法
(_!动物分组!大鼠随机分为正常组%44模型
组%EX;!&$$ ($$ #$ 0D*KDf剂量组和阳性对
照组!PFP$ &$ 0D*KDf$每组 $ 只)
(_(!44大鼠模型的诱导!将除正常组外的大鼠
左侧后足跖皮内注射弗氏完全佐剂!即卡介苗 ($
h$ ? 灭活后与高压灭菌的液体石蜡充分碾磨混
匀配成 $ D*Gf的乳剂 $d 0G致炎$正常组大
*+))*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
鼠在相同部位注射同体积的液体石蜡)
(_&!给药方案!致炎后第 + 天$大鼠继发性关节
炎出现!继发性足肿胀度及关节评分均提示关节炎
发生) 各用药组于造模第 + 天开始灌胃给药!$
0G*KD
f
$连续 + J$正常组和模型组给予等体积
的 $de羧甲基纤维素钠)
(_Q!X;4电泳观察!造模后第 +( 天引颈处死大
鼠$按常规方法.+/分离大鼠双侧后足膝关节滑膜组
织$提取滑膜组织 X;4样本$操作步骤按试剂盒说
明书进行$取
G抽提得到的 X;4进行 +e琼脂
糖凝胶电泳 !&$ [$ + ?$凝胶成像系统观察并
拍照)
(_$!P_;IG法检测滑膜细胞凋亡!取各组大鼠石
蜡包埋的踝关节切片$按P_;IG细胞凋亡原位检测
试剂盒!R:HP:;标记 FHX法说明书操作步骤进
行$以不加 PJP酶作为阴性对照) 显微镜下观察%
拍照并计数凋亡细胞数目$计算凋亡指数#即在 &$$
倍光镜下$每张切片计数 $ 个视野$每个视野计数
$ 个细胞$凋亡指数 j凋亡阳性细胞数=总计数的
细胞数i$$e)
(_Y!滑膜组织 RB7$R.S5+ 表达的检测!免疫组化
法检测大鼠滑膜组织 RB7$R.S5+ 的表达$操作步骤
按试剂盒说明书进行$用 FR8 代替一抗作阴性对
照$用确诊乳腺癌切片做阳性对照$以细胞胞质或细
胞核中出现明显的黄色或棕黄色颗粒判断为阳性染
色) 采用南京大学捷达公司WX($ 病理图像分析系
统进行图像分析$以 +$$ 倍视野范围分别计算所有
染色的平均吸光度值$取 个视野的平均值进行
分析)
(_%!统计学分析!数据分析采用 8F88d 软件$
所有数据结果均以
#
Mp?表示$组间比较采用 H2M5
ZB64;H[4检验)
&!结果
&_!X;4电泳观察滑膜组织凋亡情况!正常组和
模型组大鼠滑膜组织未发生明显的细胞凋亡$仅见
离点样孔不远的基因组 X;4+EX;!($$ #$ 0D*
KD
f
组可见较为清晰的%典型的凋亡细胞 X;4梯
带条带$表明在滑膜组织中存在明显的细胞凋亡
!图 )
&_(!P_;IG法原位检测细胞凋亡结果!P_;IG染
色法可以准确定位正在凋亡的细胞$凋亡细胞可被
特异性染成棕黄色或棕褐色) 44模型组滑膜细胞
凋亡数量少$凋亡指数与正常组比较无显著差异+
EX;&$ 0D*KD
f组可见少量凋亡细胞+EX;!($$
#$ 0D*KD
f
组可见较多阳性染色的凋亡细胞$凋
亡指数与模型组相比有显著性提高$提示EX;可以
诱导过度增殖的44大鼠滑膜细胞凋亡!表 )
9d0BCKMC+4d正常组+Rd模型组+
XdEX;($ 0D*KD
f组+IdEX;#$ 0D*KDf组+ QdPFP组)
图 !琼脂糖凝胶电泳观察EX;诱导滑膜细胞凋亡
表 !EX;对44大鼠滑膜组织中细胞凋亡
的影响!
#
Mp?$)j
组别 剂量=0D*KDf 凋亡指数=e
正常 f &d&$ pd&&
模型 f &d%# pd(
EX; &$ d# pd)&
($
%d&# p+d$*
#$
+d$& p+d))
+
PFP &$
(d&$ p+d*
+
!!注#与模型组比$n$d$$ +$n$d$)
&_&!各组大鼠踝关节滑膜组织 R.S5+$RB7表达的
变化!免疫组化结果显示$R.S5+ 和RB7蛋白阳性染
色呈棕黄色$主要在滑膜组织中表达) 与正常组比
较$模型组大鼠滑膜组织 R.S5+ 表达明显升高$RB7
表达略有升高但无统计学意义$R.S5+=RB7显著升
高+与模型组比较$&$ 0D*KDfEX;组大鼠滑膜组
织R.S5+$RB7表达无显著性变化$($$ #$ 0D*KDf
EX;组大鼠滑膜组织 R.S5+ 表达明显降低$RB7表
达明显升高$EX;各个剂量组均可显著降低 R.S5+=
RB7!表 +)
Q!讨论
研究表明>4患者滑膜细胞存在异常的凋亡过
程$如.506.$R.S5+ 等原癌基因过度表达+A)$QBU=
QBUG等抑癌基因减少或突变$凋亡抑制蛋白 QG:F%
抗凋亡因子9.S5 等异常高表达.(/ ) 滑膜细胞凋亡
机制障碍导致细胞增殖和凋亡平衡失调$滑膜组织
*)))*
第 ) 卷第 $ 期
+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[/Sd)$ :UULM!$
9B6$ +$$
!!
表 +!EX;对44大鼠滑膜组织R.S5+$RB7蛋白表达及R.S5+=RB7的影响!2$
#
Mp?$)j
组别 剂量=0D*KDf R.S5+ RB7 R.S5+=RB7
正常 f $-$*& p$-$& $-$% p$-$+ -+*$ p$-)+&
模型 f
$-($ p$-$+$
)
$-$*& p$-$&
-*# p$-&#
)
EX; &$ $-## p$-$% $-& p$-$(
-&*) p$-+%
($
$-&* p$-$#
$-$ p$-$+
+
-$$( p$-%$
+
#$
$-+$ p$-$&
+
$-(+ p$-$*
+
$-##& p$-$#
+
PFP &$ $-) p$-$+#+
$-*& p$-$+#
+
$-(% p$-$
+
!!注#与模型组相比$n$d$$ +$n$d$+ 与正常组相比)$n$d$)
过度增生$引起慢性滑膜炎症参与 >4发病) 以滑
膜细胞为靶点$诱导滑膜细胞凋亡进而抑制滑膜组
织增生是治疗>4的有效策略.*/ ) 作者在本研究中
观察了EX;诱导 44大鼠滑膜细胞凋亡的作用及
其可能的作用机制)
X;4电泳是检测凋亡发生时 X;4片段或寡核
苷酸片段的标准方法$出现梯状X;4条带就可以肯
定存在凋亡细胞) EX;!($$ #$ 0D*KDf治疗组
大鼠滑膜组织抽提得到的 X;4经电泳分析出现了
规则的凋亡细胞特征性梯状条带$表明滑膜组织中
存在较为明显的凋亡) P_;IG法用来检测细胞在
凋亡过程中细胞核X;4的断裂情况$特异准确地定
位凋亡细胞$EX;!($$ #$ 0D*KDf能诱导过度
增殖且凋亡相对不足的 44大鼠滑膜细胞凋亡$显
著提高 44大鼠滑膜细胞的凋亡指数) R.S5+$RB7
基因均属于原癌基因 R.S5+ 基因家族$R.S5+ 抑制细
胞凋亡$RB7促进细胞凋亡$细胞凋亡的发生与 R.S5
+=RB7有关#比值高$细胞存活率高+比值低$则细胞
凋亡率高.$/ ) 免疫组化图像分析结果表明#EX;
!($$ #$ 0D*KD
f
组能明显抑制 44大鼠滑膜组
织升高的R.S5+ 的表达$促进RB7的表达+EX;各个
剂量组均可显著降低44大鼠过高的R.S5+=RB7)
综上所述$诱导滑膜细胞凋亡是EX;抑制滑膜
增生的机制之一) EX;可能通过下调 R.S5+%上调
RB7的表达%并降低R.S5+=RB7来发挥诱导滑膜细胞
凋亡的作用) 这些研究结果为将 EX;开发用于治
疗>4提供了一定的药理基础)
参考文献#
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4DCN.Q//J . & /!OLBCJNBP$ >/@MSN4I$ WLBCMY4H$ M@BSd42@N5N2VSB00B@/C6
AC/AMC@NMU/VASB2@VSBl/2/NJUdIVM.@U/VCL@N2$ bLMC.M@N2 B2J ?MU5
AMCNJN2 /2 BJ1LlB2@BC@?CN@NUN2 CB@.W/dQBC0B./$ +$$$ #!*#
#()d
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DCB00MJ .MSJMB@?.W/d
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+$$ 年 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
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