全 文 ：（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＬａｎｚｈｏｕＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰＬＡ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００５０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｍｓｔｉｔｕｔｅｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，ＬａｎｚｈｏｕＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰＬＡ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００５０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｏｆＥｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ（ＴＦＥ）ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｂｏｒｎｒａｔｃａｌｖａｒｉａｌｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ（ＲＯＢ）．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴＦＥｗａｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆＲＯＢａｔ
０１，１，１０ａｎｄ１００μｇ·ｍＬ－１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｅｒｕｍｏｆｒａｔｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄＴＦＥＳ（ＳＲＡＴ）ｗａｓａｌｓｏａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｅｄｉｕｍｉｎａｐａｒ
ａｌｅｌｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ２５％，５％ ａｎｄ１０％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｉｒｅｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙＭＴＴａｎｄｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍａｒｋｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴＦＥｈａｄｎｏａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅａｎｄｏｎｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｔａｎｙｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，２５％ ａｎｄ５％ ＳＲＡＴｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｔｒｏｎｇｌｙａｎｄ，５％ ＳＲＡＴｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｂｙｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ｃａｌｃｉｕｍｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｍｉｎ
ｅｒａｌｉｚｅｄｎｏｄｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆＴＦＥｓｈｏｕｌｄｂｅｔｈｅａｎｔｉｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＥｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００７０８２９
［通讯作者］ 吕秋军，Ｔｅｌ：（０１０）６６９３２２０１，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｑｊ６６＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏ
甘草苷对原代海马神经细胞的保护和营养作用
杨 云，卞广兴，吕秋军
（军事医学科学院 放射与辐射研究所，北京 １００８５０）
［摘要］ 目的：研究甘草苷（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ，ＬＱ）对β淀粉样蛋白（Ａβ２５～３５）所致大鼠原代神经细胞损伤的保护作用
和营养作用。方法：采用大鼠原代海马神经元Ａβ２５～３５损伤模型，四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定细胞活力、流式细胞
术检测神经细胞凋亡、荧光探针法检测细胞内钙离子浓度，考察 ＬＱ神经保护作用；通过考察 ＬＱ诱导海马神经元
轴突延长的作用和流式细胞术检测其对海马神经干细胞分化为胆碱能神经元作用观察其神经营养作用。结果：１０
μｍｏｌ·Ｌ－１Ａβ２５～３５显著降低细胞的存活率；明显升高细胞内钙离子水平；诱导细胞凋亡发生，凋亡率达２８％。预先
给预０１，１，１０μｍｏｌ·Ｌ－１浓度的ＬＱ处理细胞６ｈ，可显著抑制Ａβ２５～３５导致的细胞死亡，能够明显降低Ａβ２５～３５导致
的细胞内钙离子浓度升高，流式细胞检测凋亡率分别降低到１０％，１５％ ，２２％，提示 ＬＱ能够拮抗 Ａβ２５～３５导致的细
胞凋亡。ＬＱ能够显著增加神经生长因子（ＮＧＦ）介导的海马神经元轴突延长，特异性的促分裂原活化蛋白激酶
（ＭＡＰＫ）抑制剂能够部分阻断该作用。另外，ＬＱ可以诱导神经干细胞体外定向分化为胆碱能神经元。结论：甘草
苷对Ａβ２５～３５导致的大鼠原代神经细胞损伤具有神经保护作用，同时甘草苷对原代海马神经元有营养作用。
［关键词］ 甘草苷；海马神经元；凋亡；轴突；海马神经干细胞；Ａβ２５～３５
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０８０９３１０５
甘草苷（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ，ＬＱ）是甘草的主要有效成分
之一，属于以２苯基色原酮（２ｐｈｅｎｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）为
母核的二氢黄酮类化合物，其分子式为 Ｃ２１Ｈ２２Ｏ９。
文献报道，甘草苷药效显著，具有抗溃疡、抗病毒、抗
抑郁等作用［１３］。目前对甘草苷的神经保护及营养
作用报道很少，本研究就此进行初步的考察。
１ 材料
１．１ 药物和试剂
甘草苷（中国药品生物制品检定所，批号
２００６０４，纯度＞９８５％）；β淀粉样蛋白（Ａβ２５～３５）、多
聚Ｌ赖氨酸氢溴化物、ＰＤ９８０５９（Ｓｉｇｍａ公司）；四甲
基偶氮唑盐（ＭＴＴ，Ｆｌｕｋａ公司）；解剖液（ｍｍｏｌ·
Ｌ－１：葡萄糖１５１，蔗糖２１９，ＮａＣｌ１３６９，ＫＣｌ５４，
Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ０７，ＫＨ２ＰＯ４０２，ｐＨ７２～７４）；
阿糖胞苷（法玛西亚普强公司）；神经生长因子
（ＮＧＦ，北京圣日公司）；Ｎ２，Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）；碱性成纤维
细胞生长因子（ｂＦＧＦ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｋ公司）；细胞外液
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第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１：ＮａＣｌ１５０，ＫＣｌ５，ＣａＣｌ２２，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２
Ｏ，Ｈｅｐｅｓ１０，Ｄ葡萄糖 ５，ｐＨ７４）；二甲基亚砜
（ＤＭＳＯ，晶美生物公司，Ｌｏｔ：ＲＣＯ３０７１１）；Ｆｌｕｏ３ＡＭ
（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｌｏｔ：Ｆ４０７２３）；分散剂 Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ公司，
Ｌｏｔ：０９５Ｋ００１６）；磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ，博士德公
司）；牛 血 清 白 蛋 白 （ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ公 司，Ｌｏｔ：
１２６Ｋ０６６０）；曲拉通 Ｘ１００（ＴｒｉｔｏｎＸ１００，Ｓｉｇｍａ公
司，Ｌｏｔ：１０６Ｈ０６１９）；乙二醇二乙醚二胺四乙酸
（ＥＧＴＡ，Ａｍｅｒｓｃｏ公司，Ｌｏｔ：３５９４Ｂ２３）；ＡｎｎｅｘｉｎＶ
ＦＩＴＣ凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公
司，批号０７０５２５）。一抗：ＮｅｕｒｏｎａｌＣｌａｓｓＩＩβＴｕｂｕ
ｌｉｎ（Ｔｕｊ１）抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ）；兔抗大鼠乙酰胆碱转移酶
（ＣｈＡＴ）多克隆抗体（北京博奥森）；兔抗大鼠巢蛋
白（Ｎｅｓｔｉｎ）多克隆抗体（博士德生物有限公司）；兔
ＩｇＧ（军事医学科学院）；二抗：ＦＩＴＣ标记山羊抗兔
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（中杉金桥）。
１．２ 仪器
黑色底部不透明的９６孔培养板（Ｃｏｒｎｉｎｇ）；二
氧化碳培养箱（ＳＡＮＹＯ）；超净工作台（北京昌平长
城空气净化工程公司）；酶标仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ）；微板
读数仪（ＢＭＧ）；荧光显微镜（ＺＥＩＳＳ）；流式细胞仪
（美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
１．３ 动物
ＳＤ大鼠乳鼠，出生１２ｈ内，雌雄兼用，军事医
学科学院实验动物中心提供，合格证号 ＳＣＸＫ（京）
２００５００１３。
２ 方法
２．１ 大鼠原代海马神经元的分离培养及鉴定
２．１．１ 分离与培养方法 参照 Ｍｅｌｅｒ等人［４］方法
并稍加改进：大鼠乳鼠经７５％乙醇消毒后，断头置
于含解剖液的平皿中，分离出全脑，解剖显微镜下分
离海马组织。将其置于０２５％胰蛋白酶中并用剪
刀剪碎。
#
隔４ｍｉｎ吸取胰酶至含血清离心管中，
直至无肉眼可见的组织块。２００目金属筛网过滤后
以１０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ。用种植液（ＤＭＥＭ
Ｆ１２培养液原液，１０％胎牛血清，１０％马血清，０３
ｍｇ·ｍＬ－１谷氨酰胺）稀释后，接种于预先包被０１ｇ
·Ｌ－１多聚赖氨酸的培养板。次日更换培养液
（ＤＭＥＭＦ１２原液，１０％马血清，１％Ｎ２，１％Ｂ２７，０３
ｍｇ·ｍＬ－１谷氨酰胺，３ｎｇ·ｍＬ－１阿糖胞苷）。
２．１．２ 大鼠原代海马神经元的鉴定 取培养４ｄ
的神经细胞，加９５％乙醇固定１５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤２次
后，加入含０５％牛血清白蛋白的ＰＢＳ液，１０ｍｉｎ后
吸弃上清，加入含０２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００破膜１０ｍｉｎ后
加入含有 ０５％ＢＳＡ，０２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，Ｔｕｊ１一抗
（１∶２５０）的ＰＢＳ液，于４℃湿盒内孵育过夜，另设不
加一抗的对照孔，以ＰＢＳ代替一抗。然后用 ＰＢＳ洗
涤 ２次，加入含有 ０５％ＢＳＡ，０２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，
ＦＩＴＣ标记的二抗（１∶２００）的 ＰＢＳ液，于室温孵育２
ｈ，用 ＰＢＳ洗涤２次后加入适量 ＰＢＳ后于荧光显微
镜下观察荧光染色情况。
２．２ 对Ａβ２５～３５损伤原代海马神经元的保护作用
取培养７ｄ的神经细胞，模型组换以１０μｍｏｌ·
Ｌ－１老化处理的 Ａβ２５～３５损伤液，药物组加入０１，１，
１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＬＱ６ｈ后加入Ａβ２５～３５损伤液，正常
组用 ＤＭＥＭＦ１２普通培养液原液培养，３ｄ后测
ＭＴＴ。方法如下：加入终浓度为 ０５ｍｇ·ｍＬ－１的
ＭＴＴ，培养箱内继续孵育４ｈ后吸弃上清，每孔加入
１５０μＬＤＭＳＯ，振荡 １０ｍｉｎ后，于酶标仪检测 ５４０
ｎｍ处吸光度（Ａ）。计算其抑制率，公式为：抑制率
（％）＝（Ａ给药组 －Ａ模型组）／（Ａ对照组 －Ａ模型组）×１００％。
２．３ 甘草苷抗Ａβ２５～３５致原代海马神经元凋亡作用
取培养７ｄ的神经细胞，分别检测 １０μｍｏｌ·
Ｌ－１Ａβ２５～３５作用 ４８ｈ时细胞凋亡率。药物组于
Ａβ２５～３５作用前６ｈ加入０１，１，１０μｍｏｌ·Ｌ
－１的ＬＱ，
对照组加入等体积的原液。采用 ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ
试剂盒检测细胞凋亡：０２５％胰酶消化细胞，收集各
孔细胞于 １５ｍＬＥＰ管中，３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 ５
ｍｉｎ后用冷的 ＰＢＳ洗涤 ２次，加 ２００μＬＢｉｎｄｉｎｇ
Ｂｕｆｅｒ重新悬浮细胞，加入１０μＬＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ，
轻轻混匀，避光室温反应 １０ｍｉｎ，加入 ５μＬＰＩ溶
液，混匀后于室温避光孵育 ５ｍｉｎ，加入 ３００μＬ
ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｅｒ，移入专用试管中，流式细胞仪检测细
胞凋亡率。
２．４ 甘草苷拮抗Ａβ２５～３５致原代海马神经元内钙离
子超载作用
培养７ｄ的神经细胞，以０２５％胰酶消化、离心
后以细胞外液洗涤细胞２次。加入探针 Ｆｌｕｏ３ＡＭ
（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）和分散剂 Ｆ１２７（０１％），于３７℃
避光湿盒中负载４０ｍｉｎ。之后用含０２％ ＢＳＡ的细
胞外液洗涤细胞２次，以去除背景。并于荧光显微
镜观察其探针负载情况。调整细胞密度为２×１０５
个／孔接种于９６孔培养板中，药物组加入０１，１，１０
μｍｏｌ·Ｌ－１的ＬＱ，对照组加等体积的细胞外液。于
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２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８
培养箱内预孵３０ｍｉｎ后加入１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ａβ２５～３５
损伤液，微板读数仪上于激发／发射波长 ４８５ｎｍ／
５２０ｎｍ处测荧光强度。每组分别依次加入 Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ１００，ＥＧＴＡ，测最大及最小值，依以下公式计算
Ｃａ２＋浓度。
［Ｃａ２＋］ｉ（ｎｍｏｌ·Ｌ
－１）＝３９０×（Ｆ－Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ－Ｆ）
２．５ 甘草苷对原代海马神经元轴突生长的影响
将分离的海马神经元重悬于含１０％胎牛血清
的ＤＭＥＭ／Ｆ１２种植液，接种于预先包被多聚赖氨
酸的２４孔板，培养过夜后换为含３％胎牛血清，１％
Ｎ２，１％Ｂ２７和 ３ｎｇ·ｍＬ
－１阿糖胞苷的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２
培养液。药物组加入０１，１，１０μｍｏｌ·Ｌ－１ＬＱ，同时
加入 ２ｎｇ·ｍＬ－１ ＮＧＦ；另设一组 １μｍｏｌ·Ｌ－１
ＰＤ９８０５９预孵２０ｍｉｎ后加入１μｍｏｌ·Ｌ－１ＬＱ和２
ｎｇ·ｍＬ－１ＮＧＦ；以２ｎｇ·ｍＬ－１ＮＧＦ为对照组。２ｄ
后于荧光显微镜下拍照，并统计轴突长度。
２．６ 甘草苷对原代海马神经干细胞分化的影响
２．６．１ 原代海马神经干细胞的分离培养 参照文
献［５］并稍加改进：大鼠乳鼠经７５％乙醇消毒后，断
头并置于含解剖液的平皿中，分离海马组织并用小
剪将其剪碎，用口径递减的吸管轻轻吹打海马碎片
数次，直至肉眼观察不到碎片。过 ２００目筛后，
１０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上清加入含２０ｎｇ·
ｍＬ－１Ｂｆｇｆ，２％Ｂ２７的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２干细胞培养液，
吹打，置于玻璃培养瓶中，培养过夜，小心吸取上清，
稍加吹打后铺于预先包被多聚赖氨酸的６孔板。
２．６．２ 原代海马神经干细胞的鉴定 采用荧光免
疫组化染色法鉴定所分离培养细胞是否为干细胞，
方法同 ２．１．２，一抗为 Ｎｅｓｔｉｎ抗体，二抗为羊抗兔
ＩｇＧＦＩＴＣ标记抗体，同时设以 ＰＢＳ代替一抗的阴性
对照组［６］。
２．６．３ 甘草苷诱导原代海马神经干细胞分化为乙
酰胆碱能神经元作用 干细胞培养７ｄ后加入终浓
度０１，１，１０μｍｏｌ·Ｌ－１的ＬＱ，另设一对照组。加药
作用４ｄ后，先后用 ＣｈＡＴ抗和羊抗兔 ＩｇＧＦＩＴＣ二
抗标记乙酰胆碱能神经元［７］，同时设加兔 ＩｇＧ抗阴
性对照组，方法同前。ＰＢＳ洗涤后轻轻吹打收集全
部细胞，离心后重悬于 ＰＢＳ中，于流式细胞仪上检
测乙酰胆碱能神经元含量。
２．７ 统计学方法
数据应用 ＳＰＳＳ软件 １３０统计分析，数据以
珋ｘ±ｓ表示，用方差分析及 ｔ检验比较组间差异的显
著性。
３ 结果
３．１ 原代海马神经元形态学观察及鉴定
最初接种的海马神经元呈圆形，２ｈ后开始贴
壁，５ｈ内大部分贴壁，有部分细胞出现１～２个小突
起。培养４ｄ后，神经细胞突起明显增多增长并交
织成网，至第７天网状更明显，神经细胞生长良好，
形态典型，呈短梭形、锥形。经免疫荧光染色法染色
后，于荧光显微镜下观察，对照组仅有几处非特异性
荧光，加神经元标记抗体 Ｔｕｊ１组细胞绿色荧光明
显，因此所分离细胞为神经元细胞。
３．２ 甘草苷对 Ａβ２５３５所致原代海马神经元存活能
力的影响
原代海马神经元经 Ａβ２５３５损伤后，５４０ｎｍ处的
吸光度比对照组明显降低（Ｐ＜００１）；与模型组比，
ＬＱ组细胞吸光度增加（Ｐ＜００１）（表１）。
表１甘草苷对Ａβ２５３５致原代海马神经元损伤的保护作用
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４）
分组 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ Ａ 抑制率／％
对照 － ２１４１±０１２６ －
模型 － １５８１±００１７１） －
ＬＱ ０１ １７４８±００２９２） ２９８５
１ １８６０±００４４２） ４９７６
１０ １８９８±０１７４２） ５６６０
注：与对照组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００１（表２同）
３．３ 甘草苷抗Ａβ２５～３５致原代海马神经元凋亡作用
与对照组相比，模型组细胞凋亡率显著升高
（Ｐ＜００１）。０１，１和１０μｍｏｌ·Ｌ－１ＬＱ组与模型
组相比凋亡率显著降低（Ｐ＜００１）（表２）。
表２ ＬＱ抗Ａβ２５～３５致原代海马神经元凋亡作用
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
分组 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ 凋亡率／％
对照 ０ ２５６±０３３
模型 － ２７６７±１５７１）
ＬＱ ０１ ２２０６±１３５２）
１ １４６８±１３９２）
１０ １０２８±０４６２）
３．４ 甘草苷抗Ａβ２５～３５致原代海马神经元内钙离子
超载作用
与对照组相比，模型组细胞内钙离子浓度显著
升高（Ｐ＜００１），有显著差异。与模型组相比，０１，
１，１０μｍｏｌ·Ｌ－１ＬＱ组细胞内钙离子浓度显著降低
（Ｐ＜００１或Ｐ＜００５），有显著差异（表３）。
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表３ ＬＱ抗Ａβ２５～３５引起原代海马神经元内钙离子升高作用
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
分组 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ ［Ｃａ２＋］ｉ／ｎｍｏｌ·Ｌ－１
对照 － １８２±１３
模型 － ６４３±２２１）
ＬＱ ０１ ５５５±４２２）
１ ４５０±３１３）
１０ ２９６±２２３）
注：与对照组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００５，３）Ｐ＜００１
３．５ 甘草苷对原代海马神经元轴突生长的影响
甘草苷本身对原代海马神经元轴突生长无促进作
用，但在２ｎｇ·ｍＬ－１ＮＧＦ存在下可明显促进其轴突生
长，其轴突长度明显长于对照组（Ｐ＜００１）（表４）。
表４ 甘草苷对原代海马神经元轴突生长促进作用
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
分组 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ 轴突长度／μｍ
对照 － １９２８±３４１
ＬＱ ０１ ４３３７±７７１１）
１ ５８９７±７３７１）
１０ ６３２１±６６２１）
ＰＤ９８０５９＋ＬＱ １＋１ ３４９３±３３０２）
注：与对照组比１）Ｐ＜００１，与１μｍｏｌ·Ｌ－１ＬＱ比２）Ｐ＜００１
３．６ 甘草苷对原代海马神经干细胞分化的影响
３．６．１ 神经干细胞的鉴定 经免疫荧光染色鉴定
所培养细胞为神经干细胞，对照组仅有几处非特异
性荧光，加神经干细胞标记抗体 Ｎｅｓｔｉｎ组细胞绿色
荧光明显。
３．６．２ 甘草苷促进原代海马神经干细胞分化为胆
碱能神经元作用 ＬＱ组胆碱能神经元含量与对照
组比有明显差异（Ｐ＜００１）（表５）。
表５ 甘草苷对原代海马神经干细胞分化为胆碱能
神经元作用（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
分组 剂量／μｍｏｌ·Ｌ－１ 胆碱能神经元／％
对照 － ０９４±０５９
甘草苷 ０１ ６０８±１４１１）
１ ９３６±１９５１）
１０ １２４２±３８１１）
注：与对照组比１）Ｐ＜００１
４ 讨论
β淀粉样蛋白（Ａβ）是一组由３９～４３个氨基酸
残基组成的多肽，其纤维状沉淀是 ＡＤ的主要病理
特征［８］。有研究者采用 Ａβ２５～３５诱导培养的原代神
经细胞建立 ＡＤ模型［９］。因此本实验采用 Ａβ２５～３５
诱发原代神经细胞损伤。通过检测 ＭＴＴ的吸光度
可以反应Ａβ２５～３５对细胞的损伤以及ＬＱ对损伤的保
护作用。结果表明，ＬＱ在０１～１０μｍｏｌ·Ｌ－１内可
以抑制Ａβ２５～３５对海马神经细胞的损伤。
有文献报道，Ａβ能够导致培养的神经元凋
亡［１０］，而且 ＡＤ病人中多数神经元是通过凋亡途径
死亡的。Ａβ通过在细胞膜上形成通路或者通过激
活细胞表面的相关受体而促进钙离子内流［１１］，而钙
离子在学习和记忆中起到基本的作用，它也与神经
元的存活与死亡相关。因此本实验以 Ａβ２５～３５诱导
细胞凋亡，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，采用荧
光探针检测细胞内钙离子浓度，观察了 ＬＱ对
Ａβ２５～３５诱导神经细胞凋亡的保护作用和对 Ａβ２５～３５
引起胞内钙离子升高的抑制作用。结果证实，ＬＱ的
确可以有效地减轻 Ａβ２５～３５诱导的神经细胞凋亡的
发生，同时可以显著降低 Ａβ２５～３５引起内钙超载。综
上所述，甘草苷能够对 Ａβ２５～３５导致的大鼠原代海马
神经元损伤有保护作用。
文献报道，神经系统功能依赖于神经元之间良
好的连接，此连接形式依赖于生长锥对环境信号反
应进而引导轴突向合适的方向延伸［１２］。本实验利
用原代海马神经元验证甘草苷的神经营养活性。结
果表明，甘草苷在２ｎｇ·ｍＬ－１ＮＧＦ存在下能够促进
神经元轴突的生长，该作用能够被特异性丝裂原活
化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）激酶抑制剂 ＰＤ９８０５９部分阻
断，故推测甘草苷可能通过激活 ＭＡＰＫ信号通路进
而延长海马神经元轴突。近年发现神经干细胞可自
我更新和增殖，具有分化产生中枢神经类神经细胞
的多分化潜能，在神经损伤修复和退行性疾病治疗
等方面具有巨大的应用潜势［１３］。因此，本实验从出
生１２ｈ内的ＳＤ大鼠乳鼠获取神经干细胞，进行分
离培养和鉴定。并根据靶源性神经营养因子理论，
利用甘草苷诱导其向胆碱能神经元方向分化，选用
胆碱乙酰基转移酶抗体检测诱导后的神经干细胞是
否向胆碱能神经元分化。结果表明，甘草苷可以诱
导神经干细胞体外定向分化为胆碱能神经元。
研究表明，属于黄酮类化合物的槲皮素、二氢槲
皮素和３甲氧基槲皮素对Ｈ２Ｏ２和黄嘌呤／黄嘌呤氧
化酶引发的原代神经元损伤有明显的抑制作用，对
二苯代苦味酰肼自由基有较强的清除能力［１４］。鉴
于以上黄酮类化合物的神经活性作用，本实验从神
经保护和神经营养两个方面考察了黄酮类化合物甘
草苷的神经活性作用，结果显示，甘草苷兼有保护神
经元和促进神经轴突生长的双重作用，但其作用机
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第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８
制还有待进一步研究。
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ｃｅｔｉｎａｎｄｑｕｅｒｃｅｔｉｎ３ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＯｐｕｎｔｉａｆｉｃｕｓｉｎ
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Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｎｅｕｒｏｎｔｒｏｐｈｉｓｍｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎｏｎ
ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｃｅｌｓ
ＹＡＮＧＹｕｎ，ＢＩＡＮＧｕａｎｇｘｉｎｇ，ＬＵＱｉｕｊｕｎ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｅｆｅｃｔｓｏｆｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ（ＬＱ）ｏｎｒａｔｓｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐ
ｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎａｌｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＡβ２５－３５．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅｒａｔｓｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎａｌｄａｍａｇｅｍｏｄｅｌｂｙＡβ２５－３５ｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｆＬＱｔｏｔｈｅｃｅｌｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＭＴＴａｓｓａｙ．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｅｕｒｏｎｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ
ａｎｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｂｅｄｙｉｎｇ．ＬＱ’ｓｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｅｆｅｃｔｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｒｏｕｇｈｍｅａｓｕｒｉｎｇ
ｔｈｅｎｅｕｒｉｔｅｏｕｔｇｒｏｗｔｈｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＱｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓａｎｄｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＬＱｏｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｔｅｍｃｅｌｓ
ｔｏｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｅｌｓｗｉｔｈ１０μｍｏｌ·Ｌ－１Ａβ２５－３５ｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅａｓｉｇｎｉｆ
ｉｃａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｃｅｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ［Ｃａ２＋］ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｏ２８％．Ｈｏｗｅｖｅｒ，
ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＬＱ（０１，１，ａｎｄ１０μｍｏｌ·Ｌ－１）ｆｏｒ６ｈｏｕｒｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｃｅｌｓ’ｓｄｅａｔｈｉｎｄｕｃｅｄｂｙ
Ａβ２５－３５，ｐｒｅｖｅｎｔｅｄｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ［Ｃａ
２＋］，ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｎｅｕｒｏｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｏ１０％，１５％ ａｎｄ９％，ｗｈｉｃｈ
ｍｅａｎｅｄｔｈａｔＬＱｃｏｕｌｄａｎｔａｇｏｎｉｚｅＡβ２５－３５ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＬＱｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＮＧＦｈａｄａｄｒａｍａｔｉｃｐｒｏｌｏｎｇｅｄｅｆｅｃｔｏｎｔｈｅｎｅｕｒｉｔｅｏｆ
ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｂｌｏｃｋｅｄｂｙａｓｐｅｃｉｆｉｃＭＡＰＫｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔｏｓｏｍｅｅｘｔｅｎｔ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ＬＱ
ｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｔｅｍｃｅｌｓｔｏｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｔｈａｔ
ＬＱｈａｓｔｈｅｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃａｐａｃｉｔｙｔｏｃｅｌｄａｍａｇｅｉｄｕｃｅｄｂｙＡβ２５－３５ｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ，ａｎｄａｌｓｏｈａｓｔｈｅｎｅｕｒｏ
ｔｒｏｐｈｉｃｅｆｅｃｔｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ；ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｎｅｕｒｉｔｅ；ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｔｅｍｃｅｌｓ；Ａβ２５－３５
［责任编辑 古云侠］
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第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８