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Simultaneous determination of four glycosylflavones from Lophatherum gracile by RP-HPLC

RP-HPLC同时测定淡竹叶中4种黄酮苷的含量



全 文 :RPHPLC同时测定淡竹叶中4种黄酮苷的含量
袁 珂1,薛月芹1,殷明文2,楼炉焕1
(1.浙江林学院 天然药物研发中心,浙江 临安 311300;
2.郑州大学 化学系,河南 郑州 450052)
[摘要] 目的:建立RPHPLC同时测定不同产地、不同采收期淡竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷
的含量。方法:采用高效液相色谱法,WatersXBridgeC18色谱柱(46mm×250mm,5μm),以甲醇005%冰醋酸
(35∶65)为流动相洗脱,流速10mL·min-1,检测波长340nm,柱温25℃。结果:4种成分均达到基线分离,线性
关系良好。方法的平均回收率及 RSD分别为荭草苷1032%,21%;异荭草苷1016%,27%;牡荆苷984%,
23%;异牡荆苷992%,18%。结论:本研究所建立的HPLC方法操作简便、结果准确可靠,为该类药材的入药及
资源利用提供了依据。
[关键词] RPHPLC;淡竹叶;黄酮苷
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)19221504
[收稿日期] 20080209
[基金项目] 浙江省森林培育重中之重学科开放基金项目
(200510)
[通讯作者] 袁珂,Tel:(0571)63743607,Email:yuan_ke001
@163.com
  淡竹叶为禾本科植物淡竹 Lophatherumgracile
Brongn.的叶。始载于《本草纲目》,历版《中国药
典》均收载,主要分布于我国浙江、福建、广东、广
西、安徽等地。其性寒味苦,具有清热除烦、解渴利
尿、明目解毒和止血的功能[1]。淡竹叶中含有黄酮
类、三萜类、酚酸类、蒽醌类、香豆素类、氨基酸类和
微量元素等[2]。竹叶提取物的功能因子主要是黄
酮苷,包括荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷
等[3]。研究表明,其中的黄酮苷类具有多方面的生
物活性,如抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基、降低
血脂及血胆固醇,抗菌消炎、抗病毒,增强免疫功能
等方面的作用[45]。本研究建立4种黄酮苷成分的
RPHPLC法,并对采自不同产地、不同采收期淡竹
叶中的荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷进行含
量分析,为有效控制药材质量及合理利用植物资源
提供参考依据。
1 仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪(美国 Waters公
司);Waters2996PAD检测器(美国 Waters公司);
Empower色谱工作站;KQ-250B超声波提取器(昆
山市超声仪器有限公司);MiliporeSimplicity型超
纯水器(美国 Milipore公司);RE52A旋转蒸发仪
(上海亚荣生化仪器厂);101-1型电热恒温干燥
箱;微量分析天平(EETTLERAE240瑞士)。
淡竹叶分别采自浙江、福建、广东、广西、湖北、
湖南、重庆、江苏、安徽,经浙江林学院药用植物分类
学系楼炉焕教授鉴定为淡竹叶 L.gracile,样品保存
于浙江林学院天然药物研发中心实验室。
对照品荭草苷、异荭草苷[6],牡荆苷、异牡荆苷
由本实验室制备(通过核磁共振波谱鉴定),以上对
照品由 HPLC面积归一化法标定纯度分别为
9918%,9824%,9836%,9808%;甲醇为色谱
纯,水为超纯水,其他试剂为分析纯,均经045μm
微孔滤膜滤过。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性试验 WatersXBridge
C18柱(46mm×250mm,5μm);流动相甲醇
005%冰醋酸(35∶65);流速10mL·min-1;检测
波长340nm;柱温25℃;灵敏度02AUFS。在上述
色谱条件下,荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷色
谱峰与相邻色谱峰分离度大于20,理论塔板数均
大于6000。
2.2 对照品及供试品溶液的制备 对照品溶液的
制备 分别精密称取荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡
荆苷对照品适量,混合后用甲醇超声溶解并定容,制
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成含荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷分别为
0245,0161,0111,0120g·L-1的混合溶液,经
045μm微孔滤膜滤过,即为对照品溶液。
供试品溶液的制备 将淡竹叶样品置50℃烘箱
中干燥至恒重,粉碎成细粉,过100目筛。精密称取
各待测样品10g,用10mL70%甲醇浸泡4h后,
超声提取2次,每次30min,滤过。合并滤液,旋转
蒸发浓缩干后用甲醇定容至25mL,经045μm滤
膜滤过,滤液作为供试品溶液,备用。
2.3 线性关系考察 精密依次吸取混合对照品溶
液2,4,6,8,10μL,按上述色谱条件测定。以对照
品质量X(μg)为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线
性回归,得4种成分的回归方程、相关系数及线性范
围,见表1。
表1 4种黄酮苷标准曲线的回归方程
化合物 回归方程 r
线性范围
/μg
荭草苷  Y=4704×108X+1517×10209993049~245
异荭草苷 Y=3813×108X+8771×10309999032~161
牡荆苷  Y=1399×108X+1526×10309999 022~111
异牡荆苷 Y=2047×108X+3884×10309999 024~121
2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液,按上
述色谱条件重复进样5次,每次2μL,记录4种黄
酮苷的峰面积,计算结果荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、
异牡荆苷的 RSD分别为 17%,20%,22%和
21%,表明精密度良好。
2.5 重复性试验 从同一批淡竹叶药材中平行取
样5份,按2.2项下供试品溶液的制备方法制备供
试品溶液,每种供试品溶液测定3次,每次进样10
μL,取平均值。以峰面积计算各成分含量,结果荭
草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷含量的RSD分别
为21%,19%,23%和17%。
2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于0,
4,8,16,24,36,48h进样10μL,记录峰面积,结果
荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的RSD分别为
20%,21%,24%和18%,结果表明样品溶液在
48h内稳定。
2.7 加样回收试验 精密称取5份已知含量的同
一批淡竹叶药材粉末,分别称量加入荭草苷、异荭草
苷、牡荆苷、异牡荆苷对照品适量,按2.2项下供试
品溶液的制备方法制备并进样10μL,计算各对照
品的平均加样回收率,结果见表2。
表2 4种化合物的回收率(n=5)
化合物
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
荭草苷  0471 0420 0890 9960 1032 21
  0459 0424 0906 1050    
  0452 0427 0892 1029    
  0466 0428 0911 1036    
  0454 0466 0942 1049    
异荭草苷 0217 0224 0450 1041 1016 27
  0214 0226 0446 1028    
  0219 0207 0434 1037    
  0217 0213 0426 9820    
  0264 0217 0479 9920    
牡荆苷  0124 0133 0253 9680 984023
  0124 0115 0234 9600    
  0134 0116 0252 1014    
  0127 0104 0231 1002    
  0136 0137 0270 9780    
异牡荆苷 0246 0224 0471 1004 992018
  0228 0211 0432 9690    
  0243 0237 0482 1008    
  0207 0224 0431 1002    
  0223 0217 0435 9780    
2.8 样品测定 取采自不同产地以及浙江产不同
采收期的淡竹叶样品,按2.2项下方法制备供试品
溶液,在2.1色谱条件下测定4种有效成分的含量,
结果见表3,4,对照品、样品溶液色谱图见图1。
表3 不同产地淡竹叶中4种黄酮苷成分质量分数
(n=3) mg·g-1
产地 荭草苷 异荭草苷 牡荆苷 异牡荆苷
安徽歙县 0412 0502 0202 0406
重庆   0210 0532 0229 0462
浙江临海 0896 0523 0286 0496
广西桂林 0122 0145 0085 0076
江苏江阴 0552 0518 0205 0157
湖北随州 0576 0289 0226 0371
广东肇庆 0639 0408 0362 0392
福建龙岩 0931 0486 0234 0322
湖南黔阳 0487 0466 0289 0481
表4 不同采收期淡竹叶中4种黄酮苷成质量分数
(n=3) mg·g-1
采收日期 荭草苷 异荭草苷 牡荆苷 异牡荆苷
20070413 0256 0202 0176 0438
20070526 0289 0162 0150 0376
20070720 0992 0422 0208 0410
20070915 0532 0246 0164 0425
20071008 0304 0301 0170 0528
20071112 0806 0313 0178 0467
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A.对照品;B.安徽产淡竹叶样品;C.不同产地淡竹叶样品;
D.不同采收期淡竹叶样品;1.异荭草苷;2.荭草苷;
3.牡荆苷;4.异牡荆苷
图1 对照品及样品色谱图
3 讨论
试验分别比较了用50%,70%,100%甲醇3种
不同的溶剂进行索氏提取后所得提取物中总黄酮的
得率,结果表明采用70%甲醇提取效果最好。在此
基础上试验比较了索氏提取、回流提取和超声提取
后所得提取物中总黄酮的得率,结果显示超声提取
得率较高,提示热提可能会造成有效成分的结构破
坏。超声提取时又比较了药材粉碎粒度及超声时间
和超声次数对提取效果的影响,结果显示过100目
筛后用70%甲醇浸润4h后,超声提取2次,每次
30min能达到总黄酮提取完全,故试验采用上述条
件提取。
参照文献[7]中黄酮苷类的分离,试验选择流
动相为甲醇水、甲醇磷酸体系,但在此流动相条
件下4种有效成分的色谱图峰形较差,且难于达到
基线分离。在此基础上改用甲醇水(水中含
005%冰醋酸)系统,结果所得色谱图以甲醇
005%冰醋酸(35∶65)洗脱为最佳,4种有效成分能
达到较好分离,以荭草苷计分离度大于2,理论塔板
数高于6000。
应用紫外可见分光光度计在200~400nm对荭
草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷进行扫描,其中荭
草苷、异荭草苷在342nm处均有最大吸收,牡荆苷
在346nm处有较强吸收,而异牡荆苷在336nm处
  
有最大吸收,故选择340nm作为检测波长。
采自同一时期(7月份)不同产地的淡竹叶中所
含黄酮苷成分的含量差异悬殊,且分布呈现一定规
律。其中以浙江、福建等产竹大省的淡竹叶中总黄
酮苷成分的含量较高,而广西等地的淡竹叶中总黄
酮苷成分的含量较低,而且4种黄酮苷中尤以荭草
苷的含量相对较高,尤其是浙江、福建产淡竹叶中荭
草苷的含量占黄酮苷总量的40%以上,这可能与各
地区的气候、土壤等生境有关。同一产区的淡竹叶
因采收时期不同,黄酮苷的含量也有较大差异。试
验结果显示,来自同一产区(浙江临海)不同采收期
的淡竹叶中一年出现两个黄酮苷的高峰期,分别是
7月份和11月份,尤其是荭草苷的含量,与其他黄
酮苷相比明显高很多。综合考虑,采自7月份浙江、
福建产的淡竹叶中4种黄酮苷的总量较高,而浙江、
福建两省又是著名的产竹大省,资源非常丰富,值得
进一步研究与开发。
文献[8]报道4种黄酮苷均具有较强的生物活
性,因此以多种黄酮苷成分为指标,结合药材的外观
性状、产量及当地自然环境条件建立药材的质量评
价标准,对其进行质量控制与评价才更具科学性。
该研究结果为进一步了解不同产地、不同采收期淡
竹叶中黄酮苷含量的分布规律以及对其进一步开发
利用提供了试验依据。
[参考文献]
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Simultaneousdeterminationoffourglycosylflavonesfrom
LophatherumgracilebyRPHPLC
YUANKe1,XUEYueqin1,YINMingwen2,LOULuhuan1
(1.ResearchandDevelopmentCerterofNaturalMedicine,ZhejiangForestryUniversity,Lin′an311300,China;
2.DepartmentofChemistry,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)
[Abstract] Objective:TodevelopaRPHPLCmethodforsimultaneousdeterminationoforientin,isorientin,vitexinand
isovitexininLophatherumgracilefromdiferenthabitatandharvestingtime.Method:TheHPLCmethodwasappliedandthe
chromatographiccolumnwasaWatersXBridgeC18column(46mm×250mm,5μm).Themobilephaseconsistedofmethanol
005% aceticacid(35∶65).Theflowratewas10mL·min-1andthedetectionwavelengthwassetat340nm.Thecolumn
temperaturewassetat25℃.Result:Fourcomponentswereisolatedwel,thelinearrelationshipswereexcelent.Themean
recoveriesandRSDvaluesoforientin,isorientin,vitexinandisovitexinwere1032%,21%;1016%,27%;984%,23%;
992%,18%,respectively.Conclusion:TheHPLCmethodissimple,sensitiveandreliable,andcanbeusedforthequalitycontrol
ofthemedicinalmaterial.
[Keywords] RPHPLC;Lophatherumgracile;glycosylflavone
[责任编辑 王亚君]
蓬莪术药材醇提取物 LCMS指纹图谱的研究
周 欣,陈华国,赵 超,龚小见,李 明
(贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心,贵州 贵阳 550001)
[摘要] 目的:建立蓬莪术药材醇提取物的LCMS指纹图谱评价方法。方法:以四川中药材规范化种植基地
的蓬莪术药材为研究对象,采用甲醇冷浸法提取蓬莪术有效成分,用液相色谱质谱联用法测定其指纹图谱(LC
MSFPS),并采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版)对测定结果进行评价。
结果:四川种植的蓬莪术药材醇提取物的指纹图谱有良好的相似度,生成的指纹图谱,有14个共有特征峰。通过
与对照品的保留时间、紫外光谱及LCMS所得分子量信息比较,4~6号峰和9号峰分别鉴定为姜黄素、脱甲氧基
姜黄素、莪术烯醇和莪术酮。结论:建立的蓬莪术醇提取物的LCMS指纹图谱,为其质量控制提供科学依据。
[关键词] 蓬莪术;指纹图谱;液相色谱质谱联用法
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)19221804
[收稿日期] 20080102
[通讯作者] 周欣,Tel:(0851)6690018,Email:alice9800@
sinacom
  莪术是姜科植物蓬莪术 Curcumaphaeocaulis
Val.、广西莪术C.kwangsinensisS.G.LeeetC.F.
Liang或温郁金 C.wenyujinY.H.ChenetC.Ling
的干燥根茎[1]。中医理论认为莪术辛、苦、温,归
肝、脾经,具行气破血,消积止痛的功效[1]。莪术具
有抗肿瘤、抗早孕、抗凝血、抗炎、抗菌、抗氧化和保
肝等活性[25]。文献多采用气相色谱或气相色谱质
谱联用对莪术的挥发性成分进行研究[67]。由于指
纹图谱质量控制模式可以综合反映药材中各主要成
分及其相对含量,近年文献报道[89]采用 GCMS对
莪术的挥发性指纹图谱进行研究。本实验选用四川
双流等中药材规范化种植基地产蓬莪术(道地药
材[10]),采用液相色谱质谱(LCMS)联用技术对蓬
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