全 文 ：ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｇｒａｔｉｏｓｉｓｓｉｍｕｍ
ＷＡＮＧＭｉｎ，ＺＨＡＮＧＣｈａｏｆｅｎｇ，ＷＡＮＧＺｈｅｎｇｔａｏ，ＺＨＡＮＧＭｉａｎ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓｙ，ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００３８，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｇｒａｔｉｏｓｉｓｉｍｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｗｅｒｅｉｓｏ
ｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｓｉｌｉｃａｇｅｌ，ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ｃｏｌｕｍｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｐｅｃｔｒａｌｄａｔａ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｎｉｎｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｓ：３，５，４′ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｉｂｅｎｚｙｌ（１），３，４′ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ５ｍｅｔｈｏｘｙ
ｂｉｂｅｎｚｙｌ（２），３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ４′，５ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｉｂｅｎｚｙｌ（３），ａｐｉｇｅｎｉｎ（４），ｐｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ（５），ｄｅｆｕｓｃｉｎ（６），ｎｏｃｔａｃｏ
ｓｔｙｌｆｅｒｕｌａｔｅ（７），βｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ（８）ａｎｄｄａｕｃｏｓｔｅｒｏｌ（９）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａｌｔｈｅｓｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｉｓｐｌａｎｔｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔ
ｔｉｍｅ，ａｎｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓ２，４ａｎｄ５ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｉｒｓｔｌｙｆｒｏｍｔｈｉｓｇｅｎｕｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ；Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｇｒａｔｉｏｓｉｓｉｍｕｍ；ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
［责任编辑 戴 畅］
ＨＰＬＣＥＣＤ检测猕猴血清中单胺类递质
李 芳，张惠云
（山东中医药大学，山东 济南 ２５００１４）
［摘要］ 目的：通过应用ＨＰＬＣＥＣＤ分离测定猕猴血清中单胺类递质，验证其与经前期综合征（ＰＭＳ）肝气逆证
的内在关系，筛选科学有效的检测方法。方法：采用ＺＯＲＢＡ×ＳＢＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），流动相：乙酸钠
１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１，柠檬酸８５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，正二丁胺０４ｍｍｏｌ·Ｌ－１，辛烷基磺酸钠１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，乙二胺四乙酸（ＥＤ
ＴＡ）０２ｍｍｏｌ·Ｌ－１，甲醇１８％，抽滤。流速０９ｍＬ·ｍｉｎ－１，量程１μＡ。结果：猕猴血清中去甲肾上腺素（ＮＥ），肾上
腺素（Ｅ），多巴胺（ＤＡ）和５羟色胺（５ＨＴ）回收率依次为９７０％，９７８％，９９５％，１００３％，ＲＳＤ０２２％～０９３％，重复
性较好。结论：该方法操作简便、快速、准确，是检测猕猴血清中单胺类递质检测的一种理想方法。
［关键词］ 高效液相色谱法；电化学检测；单胺类递质；血清
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０８０７０３０３
［收稿日期］ ２００６０２０９
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（３０５７２２９１）
［通讯作者］ 张惠云，Ｔｅｌ：０５３１８２９６２８４９，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｈｕｉｙｕｎ＠
１６３．ｃｏｍ
经前期综合征（ＰＭＳ）肝气逆证为临床常见证候并
为医学界所广泛关注，但其发病机理不清。研究表明，
经前期综合征（ＰＭＳ）肝气逆证与肝主疏泄、调畅情致
有关，肝疏泄失常与血清中单胺类递质的含量变化有
着内在的联系［１，２］。基于正常雌性实验猕猴的月经周
期与人的月经周期相似，因此利用ＰＭＳ肝气逆证猕猴
模型进行研究［３］，以探索猕猴宏观表现的变化和体内
单胺类神经递质的微观变化规律。单胺类神经递质包
括：去甲肾上腺素（ＮＥ），肾上腺素（Ｅ），多巴胺（ＤＡ），
５羟色胺（５ＨＴ）及其有关化合物［４］。这四种神经递质
具有重要的生理作用［５］：均可参与人及动物的行为及
精神情绪活动。因此准确测定猕猴血清中这几类神经
递质的含量变化对研究经前期综合征（ＰＭＳ）肝气逆证
具有重要意义。本试验即对高地位猕猴外周血中单胺
类神经递质进行检测及分析。
１ 仪器与材料
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪，（二元泵，自动进
样器，柱温箱，ＥＣＤ检测器）；ＬＧＲ１６－Ｗ高速冷冻
离心机（北京医用离心机厂）。
标准品：去甲肾上腺素（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，ＮＥ），肾上
腺素（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，Ｅ），多巴胺（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ），５羟色
胺（５ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ，５ＨＴ）均为 ＳＩＧＭＡ公司产品
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中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
（ＡＲ级）；乙酸钠、柠檬酸、辛烷基磺酸钠、正二丁胺、
乙二胺四乙酸均为分析纯；甲醇为色谱纯；水为超纯
水。正常雌性高地位青年猕猴（１０只），恒河猴种，体重
４～５ｋｇ，３～６岁，由中科院苏州西山实验动物中心提
供。许可证号ＳＹＸＫ（苏）２００２２００３２。
２ 方法
２．１ 造模方法［６］ 于猕猴月经周期的第１５天开始
造模（此时约为黄体期开始），将雌猴赶入压缩笼，
挤压，以猕猴稍能活动为限，每天连续挤压７ｈ，并且
给予激惹刺激，挤压造模５ｄ（不挤压时猕猴仍在压
缩笼里），造模５ｄ后将猕猴放出压缩笼。连续挤压
２个月经周期后，于猕猴经前期（约为月经后２３～２５
ｄ）灌胃给予经前平颗粒（江苏扬子江药业集团公司
生产，批号０４０２１６）０２ｇ·ｋｇ－１，１次／ｄ，每月经周
期７ｄ，连续治疗２个月经周期。
样品采集：取血时间均为经前期３～５ｄ，各猴在
正常情况及造模后和造模给药后分别于清醒状态下
从后肢静脉取血４ｍＬ，放入离心机中以３０００ｒ·
ｍｉｎ－１离心２０ｍｉｎ，取血清－４℃冷藏，以备检测。
２．２ 对照液及供试液的制备［７］ 分别精密称取
ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ适量，用流动相溶解并稀释成３００
μｇ·ｍＬ－１的标准贮备液。分别取贮备液稀释成
ＮＥ：０００３，０３，０３５，３０，４０μｇ·ｍＬ－１；Ｅ：０００３，
０３，１５，２８，３５μｇ·ｍＬ－１；ＤＡ：０００１，０１，０５，
１０，１５μ·ｇｍＬ－１；５ＨＴ：０００２，０１，０２，０４，２０
μｇ·ｍＬ－１，得各组分的标准品对照液。
取２．１项下的血清２００μＬ置于１５ｍＬＥＰ管
内，再加入等体积的５％高氯酸溶液，加盖后摇匀，
室温放置２０ｍｉｎ以充分沉淀血清中的蛋白质，于１
万 ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取上清液，０２２μｍ微孔滤
膜过滤，得供试液。
２．３ 色谱条件 根据文献［８］并加以改进。色谱
柱：ＺＯＲＢＡ×ＳＢＣ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；
流动相：甲醇１８％乙酸钠１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１，柠檬８５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１，正二丁胺０４ｍｍｏｌ·Ｌ－１，辛烷基磺酸
钠１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＥＤＴＡ０２ｍｍｏｌ·Ｌ－１，调 ｐＨ
３７。抽滤、脱气；流速 ０９ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量 ２０
ｕＬ；柱温１８℃；工作电压０４ｍｖ，量程１μＡ。
２．４ 统计分析 本实验采用 ＳＡＳ９１软件进行 ｔ
检验，所有结果用 珋ｘ±ｓ表示，两组间平均值的比较
用ｔ检验。
３ 结果
３．１ 标准曲线制备［９］ 取２．２项下的对照液，按
２．３项下色谱条件测定，各对照液色谱峰面积 Ａ对
浓度Ｃ作线性回归，得ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ的线性回归
方程，结果见表１。
表１ 标准品ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ的线性范围
组分 回归方程（ｎ＝５） ｒ 线性范围／ｎｇ·ｍＬ－１
ＮＥ Ｃ＝０３７０９Ａ＋５７２１１ ０９９９１ ８８～４１８９９
Ｅ Ｃ＝０３１３９Ａ＋２９１３７ ０９９９８ ３１～３５０４５
ＤＡ Ｃ＝０１１４５Ａ＋２３５５３ ０９９９１ ２４１～１２４０３
５ＨＴ Ｃ＝００５３１Ａ＋２０２６９ ０９９９３ ２１３～２００５７
结果表明，４种组分线性回归方程的回归系数
介于０９９９１～０９９９９。标准曲线的线性范围分别
为８８～４１８９９ｎｇ·ｍＬ－１，３１～３５０４５ｎｇ·
ｍＬ－１，２４１～１２４０３ｎｇ·ｍＬ－１，２１３～２００５７ｎｇ
·ｍＬ－１，且线性关系良好。
３．２ 回收率试验 取处理后的５份样品，每份样品
分成２份，其中１份添加已知量的含４种标准品的
混标，另外１份加入等量的流动相作对照。分别测
出ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ在样品中的含量，再根据对照分
别计算出４种物质的回收率，结果见表２。
表２ 回收率试验结果
组分
加入量
／μｇ·ｍＬ－１
回收量
／μｇ·ｍＬ－１
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
ＮＥ ３６８８ ３５７６ ９７０ ０５６
Ｅ ３５００ ３４２３ ９７８ ０９３
ＤＡ １５３８ １５３１ ９９５ ０２２
５ＨＴ ２５２５ ２５３２ １００３ ０４１
３．３ 重复性试验 对已知浓度的标准品溶液，在同
样条件下进样６次，ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ的峰面积的标
准偏差介于 ０１３％ ～１００％，分别是 ０１３％，
０３５％，１００％，０２８％。
３．４ 样品含量测定 取２．２项下的供试液，按２．３
项下色谱条件测定其中ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ的含量，结
果见表３。这表明，血清中杂质成分对测定干扰较
少且４种组分的色谱峰分离较好。
表３ 血清中ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ含量检测结果（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０） ｎｇ·ｍＬ－１
组别 ＮＥ Ｅ ＤＡ ５ＨＴ
造模前 ９０５４±２８２５ １７５９±２９５ ６７８±１４６ ９０７±１０４
造模后 ９９０２±２５０７ ２０１２±３３６ ９２７±２０８１） １０９７±１７９２）
造模后给药 ７１２９±２２５６３） １５９５±２２６４） ６４３±１４４４） ８６３±１６８４）
注：与造模前１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与造模后比较３）Ｐ＜００５，４）Ｐ＜００１
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４ 讨论
前人已有用毛细管电泳法测定血清中单胺类递
质的研究［１０］，鲁燕霞等［１１］用荧光检测法，但血清中
单胺类递质含量太低不易检测，高效液相电化学检
测分析法因其简便、快速、灵敏而被广泛应用［８，１２］，
可用于猕猴血清及组织中单胺类神经递质的研究，
也可用于临床中检测人血清中单胺类神经递质的研
究。
供试血样和对照液的储存：要储藏于２０℃的冰
箱中，以防止其分解。尤其是 ５ＨＴ在血清中含量
很低，对光、氧、高或低 ｐＨ环境很敏感［１３］，极易分
解。因此样品的储存及处理就显得格外重要。
实验结果表明，造模后与造模前相比，血清中
ＤＡ，５ＨＴ升高，有非常显著性差异（Ｐ＜００１），该指
标的改变可能和 ＰＭＳ肝气逆证密切相关。服用经
前平颗粒后，各组分均得到改善，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ都显
著降低；ＮＥ也明显降低。这表明，经前平颗粒对血
中这几类单胺类递质含量具有降低作用，提示经前
平颗粒治疗经前期综合征肝气逆证的作用机理可能
是通过降低猕猴血中 ＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴ含量而实现
的。这也说明，ＨＰＬＣＥＣＤ法不仅对于血清中低含
量物质的检测具有特定的优势，而且为研究经前期
综合征肝气逆证微观诊断指标的变化提供一个很好
的研究手段。
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Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏａｍｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｓｉｎｓｅｒｕｍｏｆｍａｃａｑｕｅｂｙｈｉｇｈ
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｈｙｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒ
ＬＩＦａｎｇ，ＺＨＡＮＧＨｕｉｙｕｎ
（ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ２５００１４，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｎＨＰＬＣＥＣＤｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏａｍｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｓｉｎｓｅｒｕｍｏｆｍａｃａｑｕｅ．
Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃａｒｉｅｄｏｕｔｏｎａＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｅｌｕｔｅｄｗｉｔｈａｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｏｆｍｅｔｈａ
ｎｏｌｗａｔｅｒ（１８∶８２）ａｔａｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ０９ｍＬ·ｍｉｎ－１．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆＮＥ，Ｅ，ＤＡ，５ＨＴｗｅｒｅ９７０％，９７８％，９９５％，
１００３％，ＲＳＤｗａｓ０２２％０９３％，ａｎｄｔｈｅｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙｗａｓｇｏｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｅｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ，
ａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏａｍｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｓｉｎｓｅｒｕｍｏｆｍａｃａｑｕｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＨＰＬＣ；ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒ；ｍｏｎｏａｍｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｓ；ｓｅｒｕｍ
［责任编辑 戴 畅］
·５０７·
第３２卷第８期
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
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