全 文 ：化、抗自由基、提高 iNOS mRNA的表达和增加 NO
合成有关。
参考文献:
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小檗碱对 HeLa细胞凋亡及其凋亡相关蛋白表达的影响①
来丽娜 1 ,赵　娜2 ,郭春花1 ,张晓一 1 ,范毅敏 1
( 1. 长治医学院 药理教研室 ,山西 长治　 046000; 2. 天津医科大学总医院 外科研究所 ,天津　 300052)
摘　要: 目的　研究小檗碱对人宫颈癌 HeLa细胞株增殖及凋亡的影响及其发生机制。方法　采用 M TT法观察小
檗碱对 HeLa细胞增殖的影响 , DNA ladder、流式细胞仪等方法进行细胞凋亡检测 ,用 Weste rn blo tting方法检测
凋亡过程中相关蛋白 Bcl-2和 Bax表达的变化。结果　小檗碱在体外试验中能明显抑制 HeLa细胞的增殖 ,在一定
的时间、剂量范围内呈时间 -剂量依赖关系。 20、 40 mg / L小檗碱作用 48 h后 ,细胞 DNA片段分析可看到凋亡时降
解形成的梯带 ,流式细胞仪检测到了细胞凋亡峰 ,各组的凋亡率分别是 ( 16. 7± 2. 8)% 、 ( 29. 6± 4. 4)% ,与对照组
( 1. 9± 0. 6)% 和 5 mg /L小檗碱组 ( 2. 3± 0. 8)% 相比差异显著 (P < 0. 01)。在凋亡过程中 , Bax蛋白表达明显增
高 ,而 Bcl-2蛋白表达下凋。结论　小檗碱体外能抑制 HeLa细胞增殖并诱导其发生凋亡 ,其机制可能与 Bax蛋白
表达明显增高 ,而 Bcl-2蛋白表达下调有关。
关键词: 小檗碱 ; HeLa细胞 ; Bcl-2; Bax
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 02- 0244- 04
Effect of berberine on apoptosis and expression of Bax and Bcl-2 proteins in HeLa cells
LAI Li-na
1
, ZHAO Na
2
, GUO Chun-hua
1
, ZHANG Xiao-yi
1
, FAN Yi-min
1
( 1. Depa r tment o f Pha rmacolog y , Chang zhi Medical Co lleg e, Chang zhi 046000, China; 2. Institute of Surg er y,
Genera l Hospital o f Tianjin Medica l Univ er sity , Tianjin 300052, China)
Abstract: Objective　 To investiga te the effect of berberine on g row th and apoptosis of human cerv ical
cancer cell line HeLa and i ts possible mechanism. Methods　 The effect of berberine on g row th of HeLa
cells wa s studied by M TT assay. Apopto sis of HeLa cells exposed to berberine was observ ed by f low cy-
tometry and DN A gel elect ropho resis. The expression of Bax and Bcl-2 w as studied by Western blot ting
analysis. Results　 Berberine ma rkedly inhibi ted the pro li feration of HeLa cells in a time-and do se-depen-
dent manner. Af ter incuba tion of HeLa cells wi th 20 and 40 mg /L berberine fo r 48 h , DN A Ladder can be
observ ed. A typical “ sub-G1 peak” was checked by f low cy tometry. There w as a very low rate of natural
apopto sis ( 1. 9± 0. 6)% , w hi le in 5 mg /L berberine g roup, the apoptosis rate wa s ( 2. 3± 0. 8)% . Af ter
exposing HeLa cells for 48 h to 20 and 40 mg /L berberine, the apoptosis rate reached ( 16. 7± 2. 8)% (P <
0. 01) and ( 29. 6± 4. 4)% (P < 0. 01) , respectiv ely. Western blot ting show ed the expression o f Bax pro-
tein increased in HeLa cel ls, a t the same time, the expression of Bcl-2 decreased in a dose-dependent man-
ner. Conclusion　 In vitro berberine could inhibit the proliferation of HeLa cells and induce the apopto sis
by promo ting Bax and inhibi ting Bcl-2 expression in a do se-dependent manner.
Key words: berberine; HeLa cell; Bcl-2; Bax
　　小檗碱是从毛茛科黄连属植物黄连、黄柏的根 茎中提取的主要成分 ,属异喹啉类生物碱 ,也称黄连
·244· 中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
① 收稿日期: 2007-06-25作者简介:来丽娜 ( 1974— ) ,女 ,山西长治人 ,硕士研究生 ,讲师 ,研究方向为中药药理学。
Tel: ( 0355) 3151442　 E-mail: lailina@ 126. com
素 ,用于抗肠道细菌感染已有悠久的历史 ,对其心血
管系统等方面的作用近年也有了更多的认识 ,如对
心律失常、心肌梗死、高血脂、糖尿病等症的应用或
试用已趋广泛。近来的研究还表明 ,小檗碱具有一定
的抗肿瘤作用 ,对多种肿瘤细胞有一定的抑制和杀
伤作用 [1～ 4 ]。 本实验以人宫颈癌 HeLa细胞株为实
验对象 ,观察小檗碱对其增殖的影响 ,并进一步探索
其抗肿瘤机制。
1　材料与方法
1. 1　材料: 小檗碱购自 Sigma 公司 ,溶于 120
mmol /L的 HEPES调节液 ( pH 7. 4)中 ,配制成
100 mg /L的储备液 ,超滤除菌 , - 20℃保存。使用
前将小檗碱储备液用 RPM I-1640培养基稀释 ,分
别配制成质量浓度为 5、 20、 40 mg /L的加药培养
基。溴化四氮唑蓝 ( M TT)、碘化丙啶 ( PI)均购自
天津联星生物公司 (进口分装 ) , Bcl-2、 Bax单克隆
抗体购于北京中杉生物公司 (进口分装 ) , 5-FU (天
津金耀氨基酸有限公司 ,批号 0609032) , HeLa细胞
株由本室保存 ,于含 10% 胎牛血清、 1× 105 U /L青
霉素、 100 mg /L链霉素的 RPM I-1640培养基中 ,
置 37℃、 5% CO2孵育箱中进行培养。
1. 2　 MT T法检测药物对 HeLa细胞生长的抑制
作用: 将指数生长期细胞 1× 107 /L接种于 3块 96
孔培养板中 ,每孔 100μL,贴壁后换含不同质量浓
度药物的 5% 无酚红 RPM I-1640全培养液每孔
200μL,每组设 9复孔 ,培养至预定时间 24、 48、
72 h,终止培养前 4 h加 MT T ( 5 g /L , PBS) 每孔
20μL,弃上清液加入 DMSO每孔 100μL,震荡混
匀 ,于酶标仪 570 nm处测定各孔吸光度 ( A )值。计
算生长抑制率 ( IR)。
IR= ( 1- 药物组 A值 /对照组 A值 )× 100%
1. 3　细胞 DNA片段分析: 收集 2× 106细胞 ,
1 500×g离心 5 min,弃上清液。 PBS洗涤两次 ,具
体步骤按基因组 DNA提取试剂盒 (北京中杉生物
公司 ) 操作说明书进行。 取制备的 DNA样品 ,
1. 5% 琼脂糖凝胶 70 V电压 ,电泳约 2 h。
1. 4　流式细胞仪检测细胞凋亡率:将 1× 107 /L指
数生长期细胞接种于 50 mL的培养瓶中 ,待细胞汇
合约 70% 时换无血清的 RPM I-1640培养液培养
18 h,使细胞同步化 ,再换含不同质量浓度药物的全
培养液 ,对照组加入等量的药物溶剂 ,每组设 3复
瓶 ,继续培养 48 h,收集细胞 ,用 0. 01 mo l /L pH
7. 4 PBS洗涤细胞 1遍 ,用 0. 5 mL PBS悬浮细胞吹
散使之成单细胞悬液 ,将其滴入 4 mL 95% 冷乙醇
中 , 4℃固定 24 h, PBS洗 1遍 ,加入 PI ( 50 mg /L,
含 RNAase 100 mg /L ) 使细胞终浓度大于 1×
109 /L,室温避光染色 20 min上机检测 ( Beckman
Coulter EPICS-X L)。
1. 5　Western blo tting 检测 Bcl-2、 Bax 蛋白的表
达: 分别收集用不同剂量药物处理 48 h后的细胞 ,
用 冰 预 冷 的 PBS 洗 两 次 , 用 细 胞 裂 解 液
( 50 mmol /L HEPES pH 7. 4, 1% Tri tonX-100, 2
mmol /L正钒酸钠 , 100 mmo l /L NaF, 1 mmol /L
EDT A, 1 mmo l /L EGT A, 1 mmol /L PM SF, 100
mg /L抑肽酶 10 mg /L亮抑酶肽 100 mg /L胃蛋白
酶抑制剂 ) 冰水浴中裂解 1 h, 16 000× g 离心
5 min,收集上清液 , Bio-Rad法蛋白定量 ,调整蛋白
浓度一致 ,制备 10% SDS-PAGE分离胶 ,垂直电泳
分离蛋白质后转至硝酸纤维素膜上 , 5% 脱脂奶粉
封闭 1 h后 ,分别加入 1∶ 200稀释的小鼠抗人
Bcl-2、 Bax、单克隆抗体 ,以 β-actin作为内参照 ,室
温下持续摇动 2 h, TBST洗 3次 ,每次 20 min。 按
1∶ 4 000加入辣根过氧化物酶 ( HRP)标记的羊抗
鼠二抗 , 37℃ 温育 1 h, TBST 洗 3次 ,每次 20
min。 加 ECL发光剂 ,显影、定影 ,实验重复 3次 ,
Scan Maker 6型扫描仪测定印迹区带的吸光度值
并进行半定量分析。
1. 6　统计方法: 数据均采用 SPSS 10. 0软件分析 ,
计量资料以 x± s表示 ,均数间比较采用单因素方差
分析。
2　结果
2. 1　对 HeLa细胞增殖的影响:小檗碱对 HeLa细
胞增殖抑制作用有明显的剂量依赖和时间依赖关
系 ,即抑制作用随药物质量浓度增高和作用时间延
长而增强 ,见表 1。
2. 2　细胞 DNA片段分析: 20、 40 mg /L小檗碱作
用于细胞 48 h后 ,在琼脂糖电泳上出现明显的具有
生化特征的梯状区带图谱 ( DN A Ladder) ,而对照
组和 5 mg /L小檗碱组无此特征 (图 1)。
2. 3　对 HeLa细胞凋亡率的影响: 流式细胞仪检测
不同质量浓度小檗碱作用 48 h后对 HeLa细胞凋
亡的作用 ,结果发现随着药物质量浓度增加 , HeLa
细胞凋亡率随之增加 ,见表 2。
2. 4　对 Bcl-2、 Bax 蛋白表达的影响: 小檗碱作用
48 h后 , Bcl-2、 Bax蛋白表达水平明显不同 , Bcl-2
随药物质量浓度增加蛋白表达逐渐降低 ,相反 Bax
蛋白表达水平则随药物质量浓度的增加而逐渐增
强 ,见图 2。
·245·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
表 1　小檗碱对 HeLa细胞增殖的影响 ( x± s , n= 9)
Table 1　 Inhibition of berberine on proliferation of HeLa cells (x± s , n= 9)
组　别 剂量 /
( mg· L- 1 )
24 h
A IR/%
48 h
A IR /%
72 h
A IR/%
对照 0 0. 657± 0. 024 - 0. 816± 0. 038 - 1. 002± 0. 065 -
小檗碱 5 0. 681± 0. 021 5. 36 0. 751± 0. 045* 8. 13 0. 884± 0. 041* 12. 13
20 0. 563± 0. 033* 14. 73 0. 617± 0. 054* * 24. 34 0. 694± 0. 054* * 30. 71
40 0. 487± 0. 027* * 26. 97 0. 529± 0. 037* * 35. 49 0. 541± 0. 036* * 46. 01
5-FU 5 0. 551± 0. 030* * 16. 13 0. 623± 0. 026* * 23. 65 0. 702± 0. 044* * 29. 95
10 0. 473± 0. 030* * 28. 00 0. 521± 0. 031* * 36. 15 0. 598± 0. 037* * 41. 33
　　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol group
M-DN A marker　 A-对照组　 B～ D-小檗碱 5、 20、 40 mg· L- 1组
M-DN A m ark er　 A-cont rol g roup
B— D-berberine 5, 20, and 40 mg· L- 1 group
图 1　 HeLa细胞 DNA琼脂糖电泳图
Fig. 1　 Agarose gel electrophoregram of HeLa cells DNA
表 2　小檗碱对 HeLa细胞凋亡的影响 (x± s, n= 3)
Table 2　 Ef fect of berberine on appoptsis of HeLa
cells ( x± s, n= 3)
组　别 剂量 /( mg· L- 1 ) 凋亡率 /%
对照 - 1. 9± 0. 6
小檗碱 5 2. 3± 0. 8
20 16. 7± 2. 8* *
40 29. 6± 4. 4* *
　　与对照组比较: * * P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 vs con trol group
3　讨论
　　有相当多的研究报道表明小檗碱在体内、外均
具有抑制肿瘤细胞生长的作用。 其作用机制至今未
明。本实验观察到小檗碱对 HeLa细胞有明显增殖
抑制作用 ,其抑制率在 5～ 40 mg /L质量浓度、 0～
72 h范围内有剂量依赖关系和时间依赖关系。流式
细胞仪检测结果显示 ,经小檗碱处理的 HeLa细胞
DNA直方图出现典型的亚二倍体峰 ,即凋亡峰 ,且
随药物质量浓度增加 ,凋亡细胞数量增多。 细胞
DNA琼脂糖电泳出现明显的梯形条带 ,通过以上
与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
图 2　小檗碱对 HeLa细胞 Bcl-2和 Bax蛋白表达的
影响 (x± s, n= 3)
Fig. 2　 Effect of berberine on protein expression of
Bcl-2 and Bax in HeLa cells ( x± s , n= 3)
结果证实小檗碱具有抑制 HeLa细胞生长和显著诱
导 HeLa细胞凋亡的作用。
研究无创伤性 ,无不良反应的天然植物抗肿瘤
药物是当今国际医药界的重点方向。目前 ,临床应用
的抗肿瘤药物多是通过诱导各自敏感的肿瘤细胞发
生凋亡来达到治疗目的。因此 ,寻找或合成凋亡诱导
率高的药物显得极为重要。分子生物学研究证实细
胞凋亡受促凋亡基因和抑凋亡基因的协同调控。 其
中 ,中药对促凋亡基因 bax和抑制凋亡基因 bcl-2
的调节作用受到了众多学者的关注。 Bcl-2和 Bax
分别是 bcl-2和 bax基因的蛋白质表达产物。 Bcl-2
和 Bax在细胞内是以同源二聚体或异源二聚体形
式存在的。近年研究提示 , bcl-2与 bax调节细胞凋
亡 ,不仅取决于自身蛋白表达的高低 ,还与 Bax 与
Bcl-2两蛋白之间的比值有关 ,当比值增大时 ,细胞
趋向凋亡 [5 ]。本实验表明小檗碱处理后 , Bcl-2随药
物质量浓度增加蛋白表达逐渐降低 ,相反 Bax蛋白
表达水平则随药物质量浓度的增加而逐渐增强 ,
Bax与 Bcl-2的比值上调 ,从而促进 HeLa细胞凋
·246· 中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
亡。因此推测这可能是小檗碱诱导 HeLa细胞凋亡
的分子机制之一。
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化州柚提取物止咳作用及其机制的研究①
李沛波 ,苏　畅 ,毕福均 ,王永刚 ,彭　维 ,苏薇薇*
(中山大学生命科学学院 ,广东 广州　 510275)
摘　要: 目的　探讨化州柚提取物止咳作用及其机制的研究。方法　采用辣椒素致豚鼠咳嗽模型 ,观察化州柚提取
物对豚鼠咳嗽次数及气管内 C纤维 P物质释放的影响 ;采用电刺激猫喉上神经引咳模型 ,观察化州柚提取物对电
刺激猫喉上神经引咳的电压阈值的影响 ;采用机械刺激致辣椒素脱敏豚鼠咳嗽模型 ,观察化州柚提取物对机械刺
激致豚鼠咳嗽的影响。 结果　化州柚提取物能明显抑制辣椒素所致豚鼠咳嗽 ,但对辣椒素诱导的气管内 C纤维 P
物质的释放不产生明显影响 ;对电刺激猫喉上神经引咳的电压阈值无显著影响 ;对机械刺激致辣椒素脱敏豚鼠咳
嗽有显著抑制作用。结论　化州柚提取物具有明显止咳作用 ,但不产生中枢性镇咳 ,其止咳机制不是通过抑制气管
内 C纤维 P物质释放 ,但与快速适应性肺部牵张感受器 ( RARs)有关。
关键词: 化州柚 ; 止咳 ; 辣椒素
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 02- 0247- 04
　　化州柚 Citrus grandis ( L. ) Osbeck va r. to-
mentosa Hor t. 又称化州仙橘 ,系芸香科柑桔属植
物 ,为柚 Citrus grandis ( L. ) Osbeck的栽培变种 ,
主产于广东化州 ,是广东的地道药材。化州柚的未成
熟或近成熟的干燥外层果皮经加工即为中药化橘
红 ,习称“毛橘红” ,具有化痰、理气、健胃、消食之功
效 ,用于治疗胸中痰滞 ,咳嗽气喘 ,呕吐呃逆 ,饮食积
滞等症。本课题组已有研究报道:化州柚提取物能明
显抑制氨水所致小鼠咳嗽和枸橼酸所致豚鼠咳嗽 ,
具有明显止咳作用 [1 ] ;化州柚提取物还具有明显的
抗炎作用 [2 ]。 本研究在原研究基础上进一步探讨其
止咳作用及作用机制。
1　材料与方法
1. 1　药物及试剂:化州柚提取物 (由中山大学广州
现代中药质量研究开发中心提供 ,黄酮类成分占
70% 以上 ) ; 磷酸可待因 ,青海制药厂 ,批号
20051212; 氯醛糖 , AJoh nson M athey Company生
产 ;辣椒素 ,湖北襄西化工厂生产 ; P物质测定试剂
盒 , Adlit teram Diagno stic labo ra to ries. Inc;硫酸阿
托品注射液 ,郑州羚锐制药有限公司 ,规格 0. 5 mg /
mL,批号 0506196;氨茶碱注射液 ,广州明兴制药有
限公司 ,规格 0. 125 g /m L,批号 050701;莫吉司坦 ,
北京华奉联博科技有限公司 ,质量分数≥ 99. 0% ,批
号 HF0501012;乌拉糖 ,国药集团化学试剂有限
公司。
1. 2　动物: 豚鼠 ,体重 300～ 450 g,由南方医科大
学提供 ,动物合格证号: 粤监证字 2007A005;家猫 ,
体重 2. 0～ 3. 0 kg ,购于从化动物养殖场。
1. 3　仪器: BL— 420E泰盟生理记录仪 ,成都泰盟
仪器厂生产 ; CC2170A超声雾化器 ,中外合资成都
维信电子科大新技术有限公司产品 ; W ellscan MK3
酶标仪 , Labsystems Dragon。
1. 4　方法
1. 4. 1　对辣椒素所致豚鼠咳嗽的影响 [3 ]: 取豚鼠
·247·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
① 收稿日期: 2007-06-29基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2006BAI06A02- 02)作者简介:李沛波 ( 1973— ) ,男 ,湖南涟源人 ,药理学博士 ,讲师 ,研究方向为心血管药理学和新药研发。
Tel: ( 020) 84110808　 E-mail: lipb73@ yahoo. com. cn
* 通讯作者　苏薇薇　 Tel: ( 020) 84110808　 E-mai l: ls ssw w@ 126. com