全 文 ：·874· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6,El
本研究结果显示，0．23mg／mL的肝力注射液
(即910gmol／L苦参碱和227tlmol／L盐酸川芎嗪
联合作用)，对人肝癌5一Fu获得性多药耐药细胞株
BEL一7402／5一Fu的增殖抑制率小于10％，该质量浓
度作用于耐药细胞72h仍未见明显的细胞形态学
改变，提示0．23mg／mL质量浓度以下的肝力注射
液符合逆转剂的浓度要求，可以用于逆转MDR的
研究。MTT结果表明，910、227umol／L以下的苦参
碱与盐酸川芎嗪联合作用人肝癌BLE一7402／5一Fu
耐药细胞株72h能部分逆转该细胞株对5-Fu的获
得性耐药，而且逆转作用呈浓度依赖性。流式细胞术
进一步发现该质量浓度范围的肝力注射液能增强耐
药细胞摄取阿霉素的能力，提高耐药细胞内阿霉素
38．61％，提示肝力注射液可能是通过抑制细胞膜载
体蛋白的药物外排功能而发挥逆转MDR的作用。
本研究初步从体外观察了肝力注射液逆转人肝癌细
胞获得性多药耐药的作用，至于调整肝力注射液中
盐酸川芎嗪与苦参碱的比例是否有助于提高其逆转
MDR的效能，以及肝力注射液在体内的逆转作用
及其确切的作用机制有待于进一步研究。
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染料木素诱导人胃癌BGC一823细胞凋亡及其分子机制的研究
苏 文1，刘艳平r，李忠魁1，张树冰1，郑杰1，昊丽萍1，李宇晟2
(1．中南大学生物科学与技术学院细胞生物学系，湖南长沙410013；
2．中南大学湘雅医学院，湖南长沙410013)
摘 要：目的探讨染料木素(genistein)体外抑制人胃癌BGC一823细胞生长及诱导其凋亡的作用机制。方法采
用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测染料木素对人胃癌BGC一823细胞的增殖抑制效应；DAPI荧光染色观察细胞凋
亡形态；流式细胞仪检测染料木素作用24h后BGC一823细胞的周期分布和凋亡率；RT—PCR方法检测环氧合酶一2
(COX一2)在mRNA水平的表达；进一步采用Westernblotting法检测COX一2在蛋白质水平的表达。结果染料
木素对BGC一823细胞具有增殖抑制效应，并有时间及浓度依赖性。染料木素作用24、48、72h的半数抑制浓度
收稿日期：2006—12-Ol
基金项目：湖南省科学技术厅基金资助项目(03ssy3091)
作者简介：苏文(1979一)，男，湖南省长沙市人，中南大学2004级硕士研究生，主要从事细胞周期与细胞凋亡的研究。
Tel：(0731)2650418E—mail：wensu@mail．CSU．edu．an
*通讯作者刘艳平Tel：(0731)2650418E—mail；ypliu@xysm．net
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·875·
(IC50)分别为(81．04±1．03)、(31．85±2．26)、(20．73±2．11)弘g／mL。10～80pg／mL染料木素作用24h后，
BGC一823细胞出现核碎裂，呈现典型的凋亡特征，细胞被阻滞于G：／M期，随药物质量浓度的增加，细胞凋亡率逐
渐增加，细胞内COX一2表达在mRNA水平和蛋白质水平均下调。结论染料木素对人BGC一823细胞有较强的抑
制增殖和诱导凋亡作用，其机制可能与抑制C0x一2表达有关。
关键词：染料木素；BGC一823细胞；增殖；环氧合酶一2；凋亡
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)06—0874—05
ApoptosisinducedbygenisteininhumangastriccancerBGC一823cells
anditsmolecularmechanisms
SUWenl，LIUYan—pin91，LIZhong—kuil，ZHANGShu—bin91，ZHENGJiel，
WULi—ping1．LIYu—shen92
(1．DepartmentofC llBiology，CollegeofBiosciencea dT chnology，CentralSouthUniversity，Changsha410013，
China；2．XiangyaSchoolofMedicine，CentralSou hUniversity，Changsha410013，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectofgenisteinonCOX一2expressioninhumangastric
cancerBGC一823cellsandtoexploreitspotentialmechanismsofinhibitingproliferationandnducing
apoptosis．MethodsTTAssaywasusedtoobservetheffectofgenisteinafter24honproliferationof
BGC一823cells．Cellcyc eandapoptosiswereanalyzedbyflowcytometry(FCM)andDAPIstaini g．
TranscriptionlevelofCOX一2wasdetectedbyRT—PCRandproteinlevelofCOX一2wasdetectedby
Westernblotting．ResultsGenisteinignificantlyinhibitedthproliferationofBGC一823cellsindose—and
time—dependentmanners，theICsovalueofgenisteinat24，48，and72hwere(81．044-1．03)，(31．854-
2．26)，and(20．73±2．11)／19／mI。，respectively．Whentreat dwith10一80gg／mLg nisteinfor24h，
BGC一823cellswerearrestedatG2／Mphase，andtheapoptoticratewasincreasedlongwiththeincrease
ofgenisteinconcentration。meanwhile。COX一2expressionattranscriptionandpr teinlevelwasdecreased．
ConclusionGenisteinhasa strongerinhibitiononproliferationandinductiononapoptosisfBGC一823
cellsthroughin ibitingCOX一2expression．
Keywords：genistein；BGC一823cells；proliferation；cyclooxygenase一2(COX一2)；apoptosis
染料木素(genistein)属于黄酮类化合物，广泛
存在于豆类作物和齿状植物中，从染料木(金雀花)，
广豆根，槐实，红车轴草，黄羽扁豆根、花，高丽槐心，
黄花木茎，野葛花等多种中药中均能提取到。其具有
雌激素、抗氧化、调血脂等功能，可预防骨质疏松症、
阿尔茨海默氏病、动脉硬化以及乳腺癌、前列腺癌等
肿瘤疾病[13；近年来研究发现染料木素对多种肿瘤
细胞系具有生长抑制、细胞毒性和诱导凋亡的作
用[2]，但其抗肿瘤的作用机制尚不十分清楚。本研究
以环氧合酶一2(COX一2)为肿瘤细胞凋亡的作用靶
点，进一步探讨染料木素抗癌的分子作用机制。
1材料
人胃癌细胞株BGC一823细胞由中南大学细胞
中心保种使用。RPMI一1640粉末购自Gibco公司；
小牛血清购自北京鼎国公司；染料木素购自南京青
泽医药科技开发有限公司(质量分数≥98％，用
DMSO溶解，调整DMSO终体积分数为0．06％)；
碘化丙啶(PI)染料购自Sigma公司；四甲基偶氮
唑盐(MTT)和DMSO购自Amresco公司。兔抗
人COX一2单克隆抗体购自CaymanChemical公
司。小鼠抗人13-actin单克隆抗体购自Sigma公司。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体和辣根
过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体及ECL化
学发光试剂均购自KirkegaardPer yLaboratories
公司。Olympus倒置显微镜、OlympusBX一60荧光
显微镜为日本奥林巴斯公司产品；BIO—RAD550酶
标仪为Biorad公司产品；EPICS流式细胞仪及
Mcycle分析软件为Coulter公司产品。
2方法
2．1细胞培养：人胃癌BGC一823细胞用含10％小
牛血清的RPMI一1640培养基，置37℃、5％C02培
养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。
2．2 MTT实验：细胞用RPMI一1640培养液稀释，
将细胞制成1×105／mL的单细胞悬液，接种于96
孔板，每孔100弘L，于37℃、5％CO。及饱和湿度条
件下培养24h。对照组换上100肛L新鲜培养液，药
物组换上100肚L含不同质量浓度(10、20、40、60、
80ug／mL)染料木素的培养液。分别培养24、48、72
h后，每孔加入MTT20弘L，继续培养4h，吸去上
清液，加DMSO120肛L，振荡10min，使结晶充分
万方数据
·876· 中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
溶解，在酶标仪上读取570nm处吸光度(A)值。计
算细胞增殖抑制率，采用Bliss法计算半数抑制浓
度(ICs。)。
抑制率一(对照组A。，。一药物组As，。)／对照组As，o×
100％
2．3荧光染色观察细胞凋亡的形态：选用不同质量
浓度(o、10、20、40、60、80gg／mL)染料木素作用于
BGC一823细胞，培养24h后，收获细胞用PBS洗3
次后，0．4％多聚甲醛(pH7．4，PBS配制)室温下
固定30min，弃去固定液，并用PBS洗2次，用1％
TritonX一100作用4min，加入适量的0．5mg／L
4，6一朕脒一2一苯基吲哚(DAPI)荧光染色60min，
用PBS冲洗3次，取10弘L滴片于燥，荧光显微镜
观察并拍照。
2．4流式细胞仪检测细胞的周期分布和凋亡率：选
用不同质量浓度(O、10、20、40、60、80lag／mL)染料
木素作用于BGC一823细胞，培养24h后，收集各组
细胞各1x106个，加入70％冷乙醇1mL，4℃固
定过夜。染色前1000r／min，离心5rain，除去固定
液，0．01mmol／LPBS洗3次，加500tLLPBS重悬
细胞，加入RNaseA和PI(PI终质量浓度5．0Pg／
mL，RNaseA终质量浓度20>g／mL)，37℃避光水
浴30min，流式细胞仪检测细胞周期各个阶段细胞
的百分率和凋亡细胞百分率，并用Modfitlt2．0软
件分析。
2．5 RT—PCR法检测BGC一823细胞COX一2
mRNA表达：分别收集以0、10、20、40、60、80pg／
mL染料木素处理24h的细胞1×107个，以一步法
提取总RNA，定量后按试剂盒进行逆转录总
cDNA，逆转录产物进行聚合酶链反应。COX一2引
物：上游为5’一GAATGGGGTGATGAGCAGTT一
37，下游为5-CAGAAGGGCAGGATACAGC一37，
扩增片段561bp；9-actin引物：上游为57一
ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC一3’，下游为
57一CATGGTGGTGCCGCCAGACAG～37，扩增片段
552bp。取PCR产物10弘L电泳，凝胶成像系统下
观察并摄影分析。实验重复3次。
2．6 Westernblotting检测BGC一823细胞COX一2
蛋白表达：分别收集以0、10、20、40、60、80弘g／mL
染料木素处理24h的细胞5×106个，PBS洗3次，
加入5×变性裂解液[60mmol／LTris—HCl(pH
6．8)、2．5％甘油、2％SDS、0．05％2一巯基乙醇、
0．1％溴酚蓝]80弘L，将细胞刮下，100℃变性，取
上清测量蛋白浓度。以SDS—PAGE电泳，电转移至
PVDF膜，封闭后分别加一抗(兔抗人COX一2单克
隆抗体、小鼠抗人p-aetin单克隆抗体)孵育1h，漂
洗后加入二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔
IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG
抗体)孵育lh，再次漂洗后加入ECL化学发光试
剂显色，曝光。结果以fl-aetin为内对照，分析
COX一2蛋白表达。实验重复3次。
2．7 统计学分析：所有数据以z±S表示，采用
SPSSl2．0统计软件进行分析。
3 结果
3．1 染料木素对BGC～823细胞增殖的影响：MTT
检测结果表明染料木素对BGC一823细胞具有增殖
抑制作用，并呈剂量和时间依赖性。随药物质量浓度
的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制作用明显
加强，见图1。当染料木素的质量浓度增加为80ug／
mL时，BGC一823细胞增殖受到严重抑制。染料木素
作用24、48、72h的IC。。分别为(81．04±1．03)、
(31．85±2．26)、(20．73±2．11)／*g／mL。
誉＼
僻
瀑
爨
锲
磐
墓
暴
O 10 2U 40 6U 80
P／(ug·mL“)
图1染料木素对BGC一823细胞增殖的抑制作用
(i±j，一一3)
Fig．1Inhibitionofge isteinonproliferation
ofBGC 823cells(j±s，辟=3)
3．2荧光染色观察细胞凋亡的形态：对照组和药物
组经DAPI染色后，在荧光显微镜下可见：对照组细
胞呈均匀蓝色，核膜完整，细胞结构正常，表示对照组
细胞为生长状态良好的活细胞；而药物组细胞细胞核
出现断裂的颗粒和片状荧光，染色质周边化，月牙状；
表明染料木素能诱导BGC一823细胞发生凋亡。
3．3 流式细胞仪测定结果：不同质量浓度染料木素
作用24h后，随着药物质量浓度的增加，G。／G。期细
胞比例逐渐下降，而G。／M期细胞比例上升，细胞
凋亡率逐渐增加。见表1。
3．4 染料木素对BGC一823细胞CoX一2mRNA表
达的影响：琼脂糖凝胶电泳结果表明，不同质量浓度
染料木素作用24h后，随着药物质量浓度的增加，
∞
∞
∞
们
加
O
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·877·
COX一2的PCR扩增条带亮度明显逐渐减弱，说明
染料木素在mRNA水平可以使COX一2基因表达
下调。见图2。
3．5染料木素对BGC一823细胞COX一2蛋白表达
的影响：Westernblotting结果表明，不同质量浓度
染料木素作用24h后，随着药物质量浓度的增加，
COX一2蛋白表达逐渐减弱，见图3。
表1染料木素作用BGC一823细胞24h细胞周期
和凋亡率的变化(；±s，n=6)
Table1 Changesofcellcycleandcellapoptosisrate
ofBGC一823cellstreatedwithgenistein
for24h(；土S，n一6)
组别
p／ 细胞周期分布／％
(腿·mL一1)Go／G1S G2／M
’—— 凋亡率／％
与对照组比较：’P<0．05
。P<0．05UScontrolgroup
M—Maker1～6—0、10、20、40、60、80pg／mL染料木素
M—Marker1—6—0，10，20，40，60，and80}tg／mLgenistein
图2染料木素对BGC一823细胞COX一2mRNA
表达的影响
Fig．2EffectofgenisteinonCOX一2mRNA
expressioninBGC一823cell
1～6—0、10、20、40、60、80tsg／mL染料木幕
1--6—0，10，20，40，60，and80／19／mLgenistein
图3染料木素对BGC一823细胞COX一2蛋白表达的影响
Fig．3EffectofgenisteinonCOX一2protein
expressioninBGC一823cells
4讨论
染料木素抗肿瘤活性最早是《神农本草经》记载
的大豆，生大豆，味甘平，涂痈肿。近年发现染料木素
具有较强的抗癌活性，对乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃
癌、大肠癌等多种肿瘤细胞具有杀伤和诱导凋亡作
用[2]。本实验用染料木素对人胃癌BGC一823细胞进
行处理，发现染料木素对BGC一823细胞有显著的增
殖抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；荧光显微镜下
可见细胞核变小，出现断裂的颗粒和片状荧光，呈现
明显的凋亡形态；进一步流式细胞仪分析显示，随染
料木素质量浓度的增加，G。／G。期细胞逐渐减少，
G：／M期细胞增多，出现G。／M期阻滞，凋亡细胞显
著增多；说明染料木素对BGC一823细胞有显著增殖
抑制和诱导凋亡的作用。
细胞凋亡是一个多基因参与的、复杂的生命过
程，特异性诱导肿瘤细胞凋亡，已成为肿瘤治疗研究
的靶点之一[3]，近年来研究发现环氧合酶
(Cyclooxygenase，COX)是诱导肿瘤细胞凋亡的重
要作用靶点，COX主要作用为催化花生四烯酸产生
一组化学性质各异的前列腺素(PGs)，包括PGE。、
PGI。、PGF抽等。目前已明确其有两种异构体CoX一1
和COX一2。COX一1是管家基因，而COX一2在多数
正常组织中并不表达，在炎症及各种癌组织中如结
肠癌、胃癌及胰腺癌中均有升高，众多实验证据表明
COX一2在癌症的发生过程中起重要的作用[4’5]。研
究表明COX一2促进癌症发生的机制主要通过增加
PGE。水平、抑制凋亡等参与肿瘤的形成[6]，研究证
实COX一2催化产生的PGs可增强肿瘤细胞的生
长[7]，其中PGE：可通过诱导BCL一2的表达而抑制
细胞凋亡[8]，COX一2特异性抑制剂和非特异性抑制
剂对多种肿瘤细胞均可引起凋亡[9’10【。然而以抑制
COX一2表达为肿瘤细胞凋亡的作用靶点的药物主
要是非甾体类抗炎药(NSAIDs)等化学药物[11|，而
不良反应少的中药及其有效成分以抑制COX一2诱
导肿瘤细胞凋亡研究较少，本实验从mRNA水平
和蛋白质水平证明染料木素抑制COX一2的表达，
从而诱导BGC一823细胞凋亡。
综上所述，本实验研究发现染料木素对BGC一
823细胞有显著增殖抑制作用，从细胞周期阻滞和
抑制凋亡基因COx一2的表达方面，证实了染料木
素诱导BGC一823细胞凋亡的可能作用机制，为中药
有效成分寻找新的抗肿瘤靶点提供实验依据，其具
体的作用机制值得进一步研究。
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川芎嗪对中波紫外线辐射后细胞光产物影响
及其光保护作用机制的研究
林向飞，骆 丹。，徐 晶，吉 玺，朱 洁，徐丽贤
(南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院皮肤科，江苏南京210029)
摘 要：目的 观察中波紫外线(UVB)辐射后永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)中光产物环丁烷嘧啶二聚
体(CPDs)的产生和清除情况，观察川芎嗪对UVB辐射后细胞光产物的影响并探讨其保护作用机制。方法采用
30mJ／cm2UVB照射培养的HaCaT细胞，加入川芎嗪干预处理，采用免疫组织化学法检测CPDs，以RT—PCR法
和Westernblotting法检测各受试组中p53和增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA和蛋白的表达水平。结果
UVB辐射后HaCaT细胞中CPDs生成，0．5h达高峰，辐射后4h内清除速率较快，4h后清除速率较慢直至辐射
24h。川芎嗪处理UVB辐射的细胞中CPDs少于单纯照射组(P<0．05)。川芎嗪可下调p53(34．9％)和PCNA
(30．9％)的mRNA表达，还可下调p53(23．1％)和PCNA(24．9％)的蛋白表达。结论HaCaT细胞对UVB照
射所致光产物CPDs的清除存在快速期及慢速期；JIJ芎嗪可降低光产物CPDs水平。川芎嗪的光保护作用可能与
其下调修复相关调控分子p53和PCNA基因及蛋白表达有关。
关键词：中波紫外线(UVB)辐射；环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)；川芎嗪；p53；PCNA
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)06—0878—05
Effectofligustrazineonphoto—-productsanditsphoto—-protectivem hanisms
afterUVBirradiation
LINXiang—fei，LUODan，XUJing，JIXi，ZHUJie，XULi—xian
(DepartmentofD rmatology，FirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China)
Abstract：ObjectiveToobserveth productionandremovalofphoto-product，cyclobutane
pyrimidinemers(CPDs)，inHaCaTcellsinducedbyUVBirradiationndi terventioneffectof
ligustrazine，andtoinvestigateitsphoto—protectivemechanismsonHaCaTcellsdamagedfromUVB
irradiation．MethodsHaCaTcellswereculturedo irradiatedwithUVBirradiationof30mJ／cm2andthen
treatedwith1igustrazine．TheproductionandremovalofCPDswerexaminedbyimmunohistochemical
method．ThemRNAandproteinxpressionsofp53andproliferatingcellnuclearantigen(PCNA)were
detectedbyRT—PCRandWesternblottingassay，respectively．ResultsCPDsappearedinHaCaTcells，
reachedthepeakat0．5handremovedrapidlyuringthefirst4h，andthenremovedslowlyuntil24h
afterUVBirradiation．ThequantityofCPDsinHaCaTcellsunderUVBirradiationinligustrazine—treated
groupwaslessthanthatinmerelyirradiatedgroup(P收稿日期：2006—12—05
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30371294)
作者简介：林向飞(1979一)，女，江苏南京人，现于南京医科大学攻读皮肤性病博士学位，研究方向为光损伤与光保护机制研究及中药的
干预作用机制研究。E—mail：xiaolin979@sina．com
*通讯作者骆丹
万方数据
染料木素诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡及其分子机制的研究
作者： 苏文， 刘艳平， 李忠魁， 张树冰， 郑杰， 吴丽萍， 李宇晟， SU Wen， LIU Yan-ping
， LI Zhong-kui， ZHANG Shu-bing， ZHENG Jie， WU Li-ping， LI Yu-sheng
作者单位： 苏文,刘艳平,李忠魁,张树冰,郑杰,吴丽萍,SU Wen,LIU Yan-ping,LI Zhong-kui,ZHANG
Shu-bing,ZHENG Jie,WU Li-ping(中南大学生物科学与技术学院,细胞生物学系,湖南,长沙
,410013)， 李宇晟,LI Yu-sheng(中南大学湘雅医学院,湖南,长沙,410013)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(6)

参考文献(11条)
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1. 吴丽萍 染料木素对人胃癌细胞BGC-823的实验研究[学位论文]2009
2. 吴丽萍.李宇晟.刘艳平.WU Li-ping.LI Yu-sheng.LIU Yan-ping 染料木素抗肿瘤机制的研究进展[期刊论文]-
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西师范大学学报（自然科学版）2007,35(2)
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2004,17(3)
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ZENG Jian-guo 红车轴草提取物对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响[期刊论文]-生命科学研究2006,10(2)
10. 刘景东.刘惠敏.王憬.王秀卿.甘露 槐角多糖含量测定方法的研究[期刊论文]-白求恩军医学院学报2007,5(3)


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