全 文 ：·596· 中草1lsChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
杜仲药材HPLC指纹图谱及其共有模式的建立
狄留庆1，刘圣金1，赵晓莉1，单进军1，毕肖林1，宋燕2
(1．南京中医药大学，江苏南京210029；2．上海华宇药业有限公司，上海200002)
摘 要：目的用高效液相色谱法建立杜仲药材的指纹图谱分析方法。方法采用LichrospherC。。(250mm×4．6
mm，5弘m)分析柱，甲醇一0．1％磷酸水为流动相，梯度洗脱，体积流量为1．0mL／min，检测波长为230am，柱温30
℃。结果共有11个共有峰，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》，计算各被测样品的HPLC指
纹图谱的整体相似度，10批被测样品的色谱指纹图谱的整体相似度在0。574～0。958。并得出了杜仲药材的对照指
纹图谱。结论该指纹图谱方法简便、重现性好，可专属性地研究杜仲药材的指纹图谱，为有效地控制杜仲药材的
内在质量提供了科学依据。
关键词：杜仲药材；高效液相色谱法；指纹图谱；共有模式；质量控制
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)04—0596一04
EstablishmentoffingerprintofCor exEucommiaeanditsmutualmodebyHPLC
DILiu—qin91，LIUSheng—jinl，ZHAOXiao—lil，SHANJin～junl，BIXiao—linl，SONGYan2
(1．NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210029，China；2．Shanghai
HuayuPharmaceuticalCo．，Ltd．，Shanghai200002，China)
Abstract：ObjectiveToestablishthefingerprintsforanalysisofCortexEucommiaebyHPLC．
MethodsThecolumnofLichroshperC18(250mm×4．6mm，5弘m)wasused．Themobilephase
consistedofm thanol一0．1V00phosphoricacidwithgradientelution．Thedetectivewa elengthwas230nm，
thecolumntemperaturewas30℃，andtheflowratewas1．0mL／min．ResultsThefingerprintconsisted
of11commonpeaks．ThemutualmodeofHPLCfingerprintswasetupandthesimilardegreestOthe
cruderugsfromdifferenthabitatswerecomparedbySimilarityEvaluationSystemforChromatographic
FingerprintofCMM(Version2004A)，andtherangeofsimilarityforenbalchesofCortexEucommiae
0．574—0．958．ThestandardHPLCfingerprintofCortexEucommiaewasestablishedtOO．Conclusion
ThismethodiSaccurateandreliable。andprovidesa scientificbasisforthequalitycontrolofCortex
Eucommiae．
Keywords：CortexEucommiae；HPLC；fingerprint；mutualmode；qualitycon roI
杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommiaulmoides
Oliv．的干燥树皮，始载于《神农本草经》，上品，为
我国名贵药材，具有补肝肾、强筋骨、安胎、降血压之
功效。产于湖北、四川、贵州等省[1]。为更有效地控制
其质量，保证商品药材及相应制剂质量的稳定性，本
实验应用梯度洗脱法建立了杜仲药材的HPLC指
纹图谱的分析方法。
1仪器、试药与药材
1．1仪器与试药：Agilent1100高效液相色谱系统
(美国Agilent公司)；《中药色谱指纹图谱相似度评
价系统(2004A版)》(国家药典委员会发行)；
BP211D型电子分析天平(德国Satrorius公司)；
AS20500A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有
限公司)；中药材粉碎机(阜阳中鼎机械有限公司)。
松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside，
PDG)对照品购于中国药品生物制品检定所，供测
定用。甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，重蒸水自制。
1．2药材：不同产地及批次药材由上海华宇药业有
限公司提供，经南京中医药大学中药鉴定学教研室
吴德康教授鉴定为杜仲科植物杜仲E．ulmoides
Oliv。的干燥树皮。药材产地及批次见表1。
2方法与结果
2．1 色谱条件：色谱柱LichrospherC18(250mm×
4．6mm，5弘m)；流动相：甲醇一0．1％磷酸水梯度洗
脱ElO：90～18：82(o～10min)， 8：82～30：
70(10～30min)，30：70～35：65(30～40min)，
收稿日期：2006—09—17
基金项目：国家科技部“十五”攻关课题(2001BA701A55—37)
作者简介：狄留庆(1964一)，男，江苏海安人，教授，博士，南京中医药大学中医药研究院制剂研究室主任。
Tel：(025)86798226E—mail：diliuqin9928@163．corn
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·597·
表1 10批杜仲药材样品来源
Table1 TenbatchesofCortexEucommme
fromvarioussources
35：65～70：30(40～75mln)，70：30～10：90
(75～77min)，10：90(77～92min)]；体积流量：
1．0mL／min；柱温：30℃，检测波长：230nm；进样
体积10弘L。
2．2供试品溶液的制备：取杜仲干燥粉末2g，精
密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入50％甲醇
50mL，密塞，称定质量，超声40min，冷却后称质
量，补足质量，滤过，滤渣同滤纸再置锥形瓶中加入
50％甲醇50mL同法提取20min，合并滤液，摇
匀，精密移取50mL置蒸发皿中蒸干，用甲醇溶解，
残渣用50％甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，微孔
滤膜滤过，即得。
2．3溶液的制备：选择松脂醇二葡萄糖苷对照品作
为参照物。取松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，精密称
定，加甲醇溶解，制成0．1mg／mL的溶液。
2．4样品测定：取供试品溶液各10肛L注入液相
色谱仪，按2．1项下色谱条件测定，记录色谱图。在
供试品色谱中，以松脂醇二葡萄糖苷色谱峰(S峰)
的保留时间和色谱峰面积为1，计算各指纹峰的相
对保留时间和相对共有峰面积值。
2．5方法学考察
2．5．1稳定性试验：取供试品溶液，在0、2、4、6、8、
10h分别进样分析，记录主要色谱峰面积，各主要
色谱峰相对保留时间的RSD为o～0．3％，相对共
有峰面积的RSD为O～5．O％，均小于5％。结果表
明，供试品溶液在10h内稳定。
2．5．2精密度试验：取供试品溶液，重复进样5次，
记录主要色谱峰面积，各主要色谱峰相对保留时间
的RSD为0～0．2％，相对共有峰面积的RSD为
o～1．7％，均小于5％，符合指纹图谱技术要求。
2．5．3重现性考察：称取同一批四川通江产杜仲药
材样品6份，按照上述供试品溶液制备方法制备，并
按上述色谱条件分析，记录主要色谱峰面积，各主要
色谱峰相对保留时间的RSD为O～3．1％，相对共
有峰面积的RSD为0～4．2％，均小于5％。
2．6指纹图谱及技术参数
2．6．1指纹图谱的建立及共有指纹峰的确定：取上
述10批杜仲药材，按供试品溶液制备方法制备，分别
进样10弘L，按2．1条件测定。根据测定结果，制定以
松脂醇二葡萄糖苷为参照物的杜仲指纹图谱，确定了
11个共有色谱峰。对选择的指纹峰编号为1～11。
2．6．2共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积：
按“2．4”项下方法计算11个共有指纹峰的相对保留
时间和相对峰面积值。其相对保留时间分别为：1
(0．189～0．190)、2(0．399～0．403)、3(0．584～
0．587)、4(0．888～0．889)、5(1)、6(1．066～
1．068)、7(1．084～1．085)、8(1．312～1．314)、9
(1．345～1．346)、10(1．672～1．674)、11(1．868～
1．870)，显示出了很好的“共有”特点。相对峰面积值
结果见表2。
2．6．3 相似度评价及对照指纹图谱的建立：采用
《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》对
各样品色谱图的原始数据文件(输出格式为aia)进
表2 10批杜仲药材指纹图谱中共有指纹峰的相对峰面积值
Table2 Relativepeakareasofcommonfi gerprinteakin enbatchesofCodexEucommiae
样品号
各峰相对峰面积
0．201
0．308
0．114
O．111
0．359
0．357
0．214
0．209
0．149
0．035
0．174
0．386
0．524
0．530
O．257
0．263
0．291
0．294
0．649
3．131
O．188
O．115
0．241
0．240
0．119
0．123
0．094
0．093
0．086
O．149
7
7
O
8
1
7
7
7
5
9
0
0
2
1
2
3
6
8
8
5
3
6
2
2
4
4
8
8
l
0
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
O
0
O
O
O
O
O
O
O
O
7
5
7
5
4
3
9
7
3
1
5
3
7
7
6
6
6
6
1
5
2
4
2
2
3
3
4
4
2
1
●
●
●
●
●
●
●
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
7
3
3
4
5
8
O
O
3
3
4
2
9
9
7
7
7
3
2
5
1
1
O
O
O
O
1
1
1
0
●
●
●
●
●
●
●
●
●
0
O
O
O
0
O
O
O
O
0
3
2
4
7
Z
1
6
3
1
8
O
4
8
8
7
7
5
6
2
5
1
l
O
O
1
1
1
1
l
O
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
O
O
O
O
0
O
O
O
O
O
3
O
8
1
O
9
1
2
8
2
7
1
7
l
7
7
O
9
l
8
1
3
6
7
1
1
2
1
2
2
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
O
O
O
O
O
O
0
O
O
O
万方数据
·598· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
行分析，自动匹配见图1，并以10批样品生成的对
照谱图(中位数法)作为对照模板，计算各色谱图的
整体相似度在0．574～0．958，见表3，得到杜仲药材
的对照指纹图谱，见图2。
三抚 i=0j￡—b簇蹇量委—JL．．{——～==：￡墨五五=仁}_。
羽 聋—棼竺=#善曼葺车茸习=&末楼=豢=#≤=：萼
000 17 50 34．99 5249 69．98
t／min
$10一湖北恩施s9一贵州黔西一1S8一四川通江一1S7一贵州遵义
$6-四JII广元一1S5一贵州黔西一2S4一四川广元一2s3一四川达
州 s2一四川通江一2s1一四川都江堰R一对照图谱
S10-Enshi，HubeiS9一Qianxi，GuizhouS8一Tongjiang，
SichuanS7一Zunyi，GuizhouS6一Guangyuan，Sichuan
S5一Qianxi．GuizhouS4-Guangyuan，Sichuan
S3一Dazhou．SichuanS2一Tongjiang，Sichuan
S1一Dujiangyan·SichuanR—referencesubstance
图1 10批杜仲药材HPLC色谱指纹图谱相似度
评价系统(2004A版)自动匹配结果
Fig．1Resultofautomaticmat hingoftenbatches
ofCortexEucommiaebysimilarityevaluation
systemforchromatographicfingerprint
(Version2004A)
U J3 26 j9 52 65 78
t，min
图2杜仲药材HPLC对照指纹图谱
Fig．2ReferenceHPLCfingerprintofCor exEucommiae
3讨论
3．1检测波长的选择：采用Agilent1100DAD检
测器对样品进行全波长扫描，综合考虑已知杜仲中
有效成分松脂醇二葡萄糖苷和其他成分的吸收，根
据3D—plot图谱，表明以230am处检测的图谱信息
量较多，峰形较好，溶剂干扰少，基线平稳。
3．2提取溶剂、时间和次数的选择：为了尽可能全
面反映药材的化学信息，对药材供试品溶液制备方
法进行实验研究。选择醋酸乙酯、甲醇、75％甲醇、
50％甲醇、25％甲醇、水6个极性梯度的溶剂进行
考察，结果50％甲醇热提的样品信息量较多、峰面
积较大；选择回流、超声提取方法进行了比较，结果
超声法所得峰面积为回流法的95％以上，考虑到
操作的方便性，确定选择超声法；选择不同超声时间
为20、40、60min进行比较，结果以超声40min为
宜；比较提取两次和3次，得出以提取两次为宜。
3．3流动相的选择：分别对甲醇一水(酸水)和乙腈一
水(酸水)系统进行3％～97％范围的梯度洗脱比
较，结果表明，在甲醇一0．1％磷酸水条件下所得色谱
峰分离度、峰形较好，程序稳定。
表3杜仲指纹图谱相似度评价系统(2004A版)相似度计算结果
Table3 SimilarityofCortexEucommiaesamplescalculatedbyfingerprint
3．4参照物的选择：松脂醇二葡萄糖苷为杜仲的主
要降压成分口]，也是现行《中国药典》收载杜仲的指
标性成分口]。在优选的洗脱条件下，松脂醇二葡萄糖
苷的分离较好，保留时间适中。最终确定选择样品中
松脂醇二葡萄糖苷为参照物。
3．5所收集的10批杜仲药材，其产地、生长年限、
采收季节、加工工艺等因素对杜仲药材的内在质量
均有一定的影响，所研究的指纹图所表达的信息，仅
代表杜仲药材的整体情况，故而10批杜仲药材的指
纹图的相对峰面积值变异较大。
3．6在中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A
版)的辅助下，得出了杜仲药材的HPLC色谱指纹
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·599·
图谱的对照指纹图谱，为杜仲药材提供了质量上的
技术监控手段。
References：
1-1 KangTG．TraditionalChi eseMedicineIdentification(中药
鉴定学)rMl．Beijing：ChinaPressofTraditionalChinese
Medicine，2003．
[2]CharlesJS，RavikumarPR，HuangFC，eta1．Isolation
andsynthesisof pinoresinol-digIucosides，a major
antihypertensiveprincipleofTu—Chung[J]．JAmChem
Soc，1976，98(17)：5412．
[3]ChP(中国药典)[S]．VolI．2005．
太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究
朱艳1，秦民坚r，杭悦宇2
(1．中国药科大学中药资源教研室，江苏南京210038；2．江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京210014)
摘 要：目的研究太子参脱病毒苗与外界苗rDNAITS区碱基序列的异同。方法运用PCR直接测序法对9种
太子参脱病毒苗和4种外界苗的rDNAITS区(包括ITSl、5．8S、ITS2)碱基序列进行了序列测定。结果太子参
脱病毒苗与外界苗的5．8S碱基序列完全一致，变异位点基本上位于ITSl的起始端与ITS2的终止端，其中江苏
溧阳和安徽宣城的脱病毒苗变异位点较多。使用UPGMA法构建了系统发生树，从分子生物学角度说明了它们之
间的内在联系。结论rDNAITS碱基序列的比较分析从分子水平上进一步阐明了脱病毒苗的遗传稳定性。
关键词：太子参；脱病毒苗；rDNAITS区；DNA序列
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)04—0599—03
SequenceanalysisofrDNAITSofde-virusseedlingsofPseudostellariahete ophylla
ZHUYanl，QINMin—jianl，HANGYue—yu2
(1．DepartmentofTraditionalChineseMedicinalMaterialResources，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210038，
China；2．InstituteofPlant，JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences，Nanjing210014，China)
Abstract：ObjectiveTostudyrDNAITSsequencesimilaritiesandifferencesbetweenthede—virus
seedlingsa doutsidese dlingsofP eudostellariaheterophylla．MethodsThsequencesofITSregion
(includingITSl，ITS2，and5．8S)fromninede—virusseedlingsa dfouroutsidese dlingsweretudiedby
themethodofDNAsequenceanalysis．ResultsTherew rethesamesequencesin5．8Sregionbetween
thede—virusseedlingsa doutsidese dlingsofP，heterophylla．Variablesiteslayintheinitialpositionof
ITSlandterminationofITS2basically．Thede—virusseedlingsfromLiyang(JiangsuProvince)and
Xuancheng(AnhuiProvince)hadmorev riablesites．PhylogeneticdendrogrambasedonITSwas
constructedbyusingUPGMAmethods．whichshowedt einherentrelationatthe1evelofmolecular
biology．ConclusionTheanalysisofrDNAITSofP．heterophyllahasfurtherclarifiedtheinherit
stabilityofde—virusseedlingsatthemolecularlevel．
Keywords：Pseudostellariaheterophylla(Miq．)PaxexPaxetHoffm．；de—virusseedlings；rDNA
ITS；sequencesofDNA
太子参为石竹科孩儿参属植物孩儿参
Pseudostellariaheterophylla(Miq．)PaxexPaxet
Hoffm．的干燥块根，收载于《中国药典》[1]，具有益
气健脾，生津润肺之功效，主治心悸自汗，疲倦乏力，
脾虚食少，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳等症。太子
参主产于江苏、山东、安徽、福建等省，长期无性繁殖
易发生病毒病，关于太子参脱病毒的具体情况，笔者
已作了初步的研究‘引。近年来，rDNAITS区以进化
速率快且与植物生活型呈相关性，而被广泛用于近
缘属问、属内系统发育及种内居群间的差异性研
究‘3～引。 余永邦等嘲曾对部分产区的太子参进行
rDNAITS区序列的比较，那么太子参脱病毒苗与
外界苗间是否也存在DNA序列上的差异?脱病毒
苗是否既脱除了病毒，又保持了该品种的优良特性?
收稿日期：2006—07—31
基金项目：江苏省自然科学基金资助项目(BK2005206)
作者简介：朱艳(1972一)，女，江苏吴江人，硕士研究生，助理研究员，主要从事药用植物种质资源保存和生物技术等方面的研究。
*通讯作者秦民坚Tel：(025)85391290E—mail：minjianqin@sohu．corn
万方数据
杜仲药材HPLC指纹图谱及其共有模式的建立
作者： 狄留庆， 刘圣金， 赵晓莉， 单进军， 毕肖林， 宋燕， DI Liu-qing， LIU Sheng-jin
， ZHAO Xiao-li， SHAN Jin-jun， BI Xiao-lin， SONG Yan
作者单位： 狄留庆,刘圣金,赵晓莉,单进军,毕肖林,DI Liu-qing,LIU Sheng-jin,ZHAO Xiao-li,SHAN
Jin-jun,BI Xiao-lin(南京中医药大学,江苏,南京,210029)， 宋燕,SONG Yan(上海华宇药
业有限公司,上海,200002)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 6次

参考文献(3条)
1.Kang T G 中药鉴定学 2003
2.Charles J S;Ravikumar P R;Huang F C Isolation and synthesis of pinoresinol-diglucosides,a major
antihypertensive principle of Tu-Chung[外文期刊] 1976(17)
3.中华人民共和国药典(一部) 2005

本文读者也读过(10条)
1. 左航.黄文.李天宏 以绿原酸为参照物的杜仲叶HPLC指纹图谱[期刊论文]-安徽农业科学2008,36(13)
2. 黄平.席先蓉.张琼.张恩景.韩双.HUANG Ping.XI Xian-rong.ZHANG Qiong.ZHANG En-jing.HAN Shuang 杜仲药
材高效液相色谱指纹图谱研究[期刊论文]-齐鲁药事2007,26(11)
3. 张琼.黄平.彭松.ZHANG Qiong.HUANG Ping.PENG Song 杜仲炮制品HPLC指纹图谱的研究[期刊论文]-齐鲁药事
2009,28(2)
4. 黄平.席先蓉.张恩景.张琼.韩双.HUANG Ping.XI Xian-rong.ZHANG En-jing.ZHANG Qiong.HAN Shuang 杜仲药
材高效液相色谱指纹图谱研究[期刊论文]-医药导报2008,27(4)
5. 平丽.杨中林.张丹.李萍 杜仲生品及盐炙品HPLC指纹图谱比较研究[期刊论文]-中医药学报2009,37(6)
6. 陈望爱 结合化学计量学算法系统分析比较杜仲和杜仲叶中化学成分[学位论文]2008
7. 王媛.李宗孝.WANG Yuan.LI Zong-xiao 十种草药的振荡指纹图谱[期刊论文]-化学世界2007,48(8)
8. 刘圣金.狄留庆.毛厌草 杜仲及盐杜仲HPLC指纹图谱比较研究[会议论文]-2008
9. 邓建云.李建强.黄宏文.DENG Jian-Yun.LI Jian-Qiang.HUANG Hong-Wen 一株具有特异AFLP指纹图谱的杜仲古
树[期刊论文]-武汉植物学研究2006,24(6)
10. 谭莉莉.万小强.王刚 贵州产杜仲乙醇提取物UV、TLC及HPLC指纹图谱的比较研究[期刊论文]-遵义医学院学报
2003,26(2)

引证文献(6条)
1.徐艳.张立军 急性子高效液相指纹图谱研究[期刊论文]-时珍国医国药 2009(11)
2.张丹.张春凤.杨中林 杜仲指纹图谱中化学成分的归属研究[期刊论文]-中医药学报 2012(2)
3.王莉.段晓芳.敬海英.王竹.吴小丽.任杰.王竞.徐小平 指纹图谱和主成分分析法评价杜仲叶的质量[期刊论文]-
华西药学杂志 2012(2)
4.傅兴圣.韩乐.刘训红.许虎.李俊松.蔡宝昌.杨艳 杜仲饮片HPCE指纹图谱的研究[期刊论文]-中药材 2012(3)
5.陈珺.SONG Min.张钰.ZHANG Si-yun.杭太俊 粉葛与野葛中异黄酮的HPLC指纹对照和比色测定[期刊论文]-中国新
药杂志 2008(14)
6.张红霞.吴畏.高新华.陈伟.黄开华.方亮 中药指纹图谱在药用植物和真菌上的应用研究及前景[期刊论文]-上海
农业学报 2008(3)


本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200704041.aspx