全 文 ：中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·721·
小鼠的生存时间10～15d，而对发病时间无影
响[1州。本实验结果显示羟基积雪草苷虽不能延迟小
鼠发病但能延长小鼠生存期10d左右，这已是一个
很好的苗头，且积雪草在我国长江以南地区广泛生
长，药源丰富，因此有必要进一步研究并将其开发为
治疗ALS和其他神经元变性疾病的药物。
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芫花根总黄酮含药血清对小鼠细胞免疫功能的影响
高晓雯，郑维发+，彭烨城
(徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州 221116)
摘 要：目的 建立小鼠血清中芫花根总黄酮(TFRD)各成分的HPLC测定方法，探讨TFRD含药血清对正常小
鼠细胞免疫功能的影响。方法HPLC法测定小鼠单次ig给药后不同时间点血药浓度；MTT法检测多次ig给药
后含药斑清对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、NK与LAK细胞杀伤活性和腹腔巨噬细胞的吞噬功能等细胞免疫功能
的影响。结果单次igTFRD后血药浓度在20～30min达到高峰；TFRD含药血清能促进脾淋巴细胞增殖，增加
NK和LAK细胞杀伤活性，增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力。结论TFRD含药血清能增强正常小鼠细胞免疫功能。
关键词：芫花根总黄酮；血清药理学；细胞免疫
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0721—05
Effectofserumcontainingtotalf avonoidsfromrootsofDaphnegenkwa
oncellimmunityinmice
GAoXiao—wen，ZHENGWei—fa，PENGYe-cheng
(KeyLaboratoryforBioteehnologyonMedicinalPl ntsofJiangsuProvince，
XuzhouNormalUniversity，Xuzhou221116，China)
Abstract：ObjectiveToestablishHPLCmethodforassayingtotalf avonoidsfromtherootsof
Daphnegenkwa(TFRD)inserumof iceandtoelucidatetheffectofmiceserumcontainingTFRDon
cellimmunityinmice．MethodsTFRDConcentrationinserumwasdeterminedfromthemicereceived
singleigTFRDatcertaint meintervalsusingHPLCmethod．TheeffectsofTFRDserumonlymphocyte
proliferation，killingactivit esofNKandLAKcell，andphagocyticac vityofmacrophagewered tected
bvMTTmethod．ResultsTFRDin erumreacheditshighestconcentrationin20—30minafterigadmi—
nistration．TFRD—containingserumsignif cantlyimprovedtheproliferationoflymphocyte，enhancedthe
killingactivitiesofNKandLAKcells。ande forcedthephagocyticact vityofmacrophage．Conclusion
TFRD—containingserumisaneffectiveagentsforenhancingellimmunityinmice．
收稿日期：2005—10—24
基金项目：教育部科学技术研究重点项目(03049)；江苏省高校自然科学研究计划重点项目(02KJA360002)
作者简介：高晓雯(1977一)，女，江苏徐州人，徐州师范大学天然产物化学及药理学硕士研究生。E—mail：gxw2003@126．com
*通讯作者郑维发Tel：(0516)83403179E—mail：yyzw@xznu．edu．cn
万方数据
·722· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
Keywords：totalflavonoidsfromtherootsofDaphnegenkwaSieb．etZucc．(TFRD)；serumphar—
macology；cellimmunity
芫花DaphnegenkwaSieb．etZucc．为瑞香科
植物，广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的
部分地区。芫花根在民间曾被用来治疗多种癌肿，疗
效显著。芫花根还可以治疗腹水、急性乳腺炎等。化
学成分研究表明，芫花根主要含有黄酮、香豆素和萜
类化合物。其中黄酮类化合物除了芫花素、芫根苷等
少数单黄酮外，主要含有毛瑞香素系列双黄酮，种类
多且含的量高，为芫花根的主要成分之一[1]。前期实
验[21证明，芫花根总黄酮(TFRD)对小鼠细胞免疫
功能有调节作用。为了更好地探讨TFRD对细胞免
疫功能调节的作用机制，使反应体系更接近于动物
体内环境，本实验采用血清药理学方法，对正常小鼠
的脾淋巴细胞增殖、NK和LAK细胞的杀伤活性以
及腹腔巨噬细胞的吞噬功能等指标进行检测，从而进
一步阐明TFRD的药理作用与免疫调节作用机制。
1材料
1．1实验动物与细胞株：ICR小鼠，8～12周龄，体
重18～22g，雌雄各半，徐州医学院实验动物中心
提供(动物合格证号：苏动字200402)。实验小鼠饲
养在(25土2)℃、明暗各12h的饲养室中，自由饮
水和取食。K562细胞由中国科学院上海细胞研究
所提供。
1．2药品与试剂：甲醇(色谱纯)由Fisher公司提
供；RPMI一1640培养液、DMEM培养液由美国Gib—
CO公司提供；胎牛血清由美国Hyclone公司提供；
刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、巯基乙醇酸
钠、中性红、二甲基亚砜(DMSO)、MTT均由美国
Sigma公司提供；淋巴分离液TBD由中国医学科学
院生物工程研究所提供；白细胞介素一2(IL一2)沈阳
三生制药股份有限公司提供；自制三蒸水；肿瘤坏死
因子一a(TNF—a)试剂盒由法国Diaclone公司
提供。
1．3 TFRD及各单体的制备：按文献所述的方法[21
从芫花根醇提物中制备总黄酮；按文献所述的方
法Es]从总黄酮中分离制备毛瑞香素B、G、H，芫花
素、芫根苷以及芫花醇A，波谱学方法鉴定结构。
1．4色谱条件：Waters600EHPLC色谱仪，以甲
醇一水(pH5．0)作为流动相，按下列梯度进行洗
脱：0～10min，25：75；11～20min，33：67；21～58
min，41：59；59～79min，55：45；80～100rain，
85：15。检测波长275nm。色谱柱：Inertsil，
250mm×4．6mm；柱温30‘C。
2方法
2．1 对照品溶液的配制：精密称取对照品芫花苷、
芫花醇A、毛瑞香素H、毛瑞香素G、毛瑞香素B和
芫花素(均为本实验室从芫花根中分离制备，质量
分数均>99％)，质量分别为0．1446、0．3487、
0．9112、1．4662、2．7625、0．1237mg。分别置于25
mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作
为标准对照品溶液备用。
2．2 供试品溶液的配制：精密称取TFRD6．25
mg，置25mI。量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻
度，摇匀，作为供试品溶液备用。
2．3 单次给药血清样品的处理及测定：小鼠70
只，随机分为7组，每组10只。正常组，培生理盐
水；其余6组小鼠igTFRD乳液200mg／kg。给药
后分别于10、20、30、40、50和60min从心脏取血，
分离血清。取血清1．0mL置10mL离心管中，加5
mL异丙醇一氯仿(1：5)的混合溶液，旋涡混匀，
4000r／min离心5min。吸取氯仿层于10mL离心
管中，40‘C水浴下氮气吹干，加0．20mL流动相甲
醇，旋涡振荡1min并超声1min溶解，4000r／rain
离心5min，取上清液进样20肛L。按上述色谱条件
进行检测。
2．4多次给药血清的制备：小鼠随机分为两组，正
常组与给药组。分别ig生理盐水和TFRD乳液200
mg／kg，每日2次，ig7次，最后ig给药后0．5h无
菌心脏取血，分离血清，供以下实验用。
2．5脾淋巴细胞增殖实验：按常规方法[4]制备脾淋
巴细胞悬液2×106／mL，加入96孔板中。实验设正
常血清组、含药血清组、含药血清+ConA组和含药
血清+LPS组，血清的添加量分别为10％、20％、
30％、40％和50％，每孑L终体积为200td。，每组设5
个复孔。放入37C、5％CO：的恒温培养箱中培养
68h，每孔加入5mg／mLMTT溶液10肚L，继续培
养4h。培养结束后，弃上清液，加入150肛LDM—
SO，静置20min，用酶标仪测定570nm处吸光度
(A)值哺j。
2．6 NK细胞杀伤活性实验：无菌制备效应细胞脾
淋巴细胞2×106／mL，靶细胞K562浓度为2×105／
mL，分别以每孔50pL加入96孔板。实验孔分别
加入不同量的含药血清或正常血清，效应细胞与靶
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·723·
细胞对照孔分别加入相同体积的正常血清，每组设
5个复孔，血清添加量为10％、20％、30％、40％和
50％，最终每孔加入RPMI一1640培养基补足200
肛L。放入37℃、5％CO。恒温培养箱中培养4h，每孔
加入5mg／mLMTT溶液10肚L，继续培养4h，弃
去上清液。每孔加入150肛LDMSO，静置20min，用
酶标仪在570nm处测A值，计算杀伤率n]。
杀伤率一f1一垒型罢二垒l×100％
、 01靶 ，
2．7 LAK细胞杀伤活性实验：LAK细胞的诱
导[4]：无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调细胞浓度为
5×106／mL，移入培养瓶中，加入IL一2使其终浓度
为1000U／mI。，将培养瓶置37。C、5％CO。孵箱中
培养3d，更换含IL一2为1000U／mL的培养基，培
养3d即孵化成LAK细胞。实验前用RPMI一1640
培养基调细胞浓度为2x106／mL。LAK细胞活性检
测同NK细胞杀伤活性测定方法。同法计算杀伤率。
2．8腹腔巨噬细胞吞噬功能实验：采用中性红吞噬
试验。按文献方法[71制备腹腔巨噬细胞，调细胞浓度
为1×106／mL，每孔100pL，再加入10％、20％、
30％、40％和50％的含药血清或正常血清，用完全
培养基DMEM补足200p．L，每组设5个复孔，
37‘C、5％CO。培养箱培养24h。每孔加入0．075％
无菌中性红生理盐水溶液50牡L后，继续培养30
rain，离心后弃去上清液，PBS洗3遍，每孔加细胞
裂解液(醋酸一乙醇，1：1)200肛L，用酶标仪测定
540nm处A值。
2．9统计学处理：实验数据均采用SPSSl3．0软件
进行t检验，统计数据用z±S表示。
3结果
3．1对照品标准曲线的制备：准确吸取对照品溶液
4、8、12、16和20弘L分别进样，按上述色谱条件进
行HPLC分析，以各自对照品进样质量X(肛g)对
色谱峰面积Y(mV／min)进行回归计算，线性回归
方程见表1。
表1 TFRD中各对照品的标准曲线方程
Table1 Standardequationofquantitativeanalysis
dataofreferencesubstancesinTFRD
3．2 TFRD中各单体的测定：精确吸取供试品溶
液12”L进样测定(图1)，采用峰面积外标法定量，
由色谱图相应的峰面积，分别代入各自的回归方程，
求出供试样品中各单体的进样质量，再计算出
TFRD中芫花苷、芫花醇A、毛瑞香素H、毛瑞香素
G、毛瑞香素B和芫花素的质量分数(表2)。
5
4
采m
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
f／rain
l一芫花苷 2一芫花醇A 3一毛瑞香素H
4一毛瑞香素G5一毛瑞香素B 6一芫花素
1-yuenkanin2-genkwanolA 3-daphnodorinH
4-daphnodorinG 5-daphnodorinB 6-genkwanin
图1 TFRD的HPLC图谱
Fig．1HPLCChromatogramofTFRD
表2 TFRD的测定结果
Table2 DeterminationofTFRD
3．3单次给药血清样品测定的结果
3．3．1血药浓度与时间的关系：正常小鼠在单次
igTFRD乳液200mg／kg后，血药浓度先是逐渐上
升，在20～30min达到高峰，然后逐渐下降；当到
60rain时，血清中几乎没有药物(图2)。
3．3．2血清中对照品标准曲线的制备：取正常小鼠
空白血清1mL，置于10mL具塞离心管中，精密加
入0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL对照品溶液，按2．3
方法处理血清样品，进样20肛L，进行色谱分析。结果
以各自对照品进样质量X(pg)对峰面积y(mV／
rain)进行线性回归，建立线性回归方程见表3。
3．3．3血药浓度的测定：根据20、30、40rain的血
清色谱图中各单体的峰面积，分别代入各自的回归
方程，可以计算出各单体在血清中的质量(表4)。
3．4 TFRD血清对淋巴细胞增殖的作用：TFRD
血清对正常小鼠的脾淋巴细胞增殖反应有促进作
用。与相等添加量的正常血清组相比，20％TFRD
万方数据
·724· 中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
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e一40rainf-50raing-60rain
图2单次igTFRD200mg／kg后不同时间小鼠
血清的HPLC图谱
Fig．2HPLCChromatogramofmiceserum
indifferenttimesafterasingleig
TFRDatadoseof200mg／kg
表3单次igTFRD200mg／kg血清中对照品标准
曲线方程
Table3 StandardequationofTFRDserumreference
substancesaft ra ingleig200mg／kg
表4 20、30、40minTFRD血清的测定结果(工±s，n一3)
Table4 DeterminationofTFRDserumin20，
30，and40min(i土s，一一3)
血清对脾淋巴细胞增殖有显著的促进作用(P<
0．05)；在ConA的诱导下，仅有TFRD血清添加量
为30％时有显著的促进作用(P的诱导下，TFRD血清添加量为20％～40％对淋
巴细胞增殖有显著促进作用(P3．5 TFRD血清对NK和LAK细胞杀伤活性的
影响：TFRD血清能显著提高NK和LAK细胞的
杀伤活性。与相等添加量的正常血清组相比，TFRD
血清添加量为30％时作用表现最为显著(P<
0．01)；其次是TFRD血清添加量为20％和40％
(P<0．05)，结果见表6。
表5 TFRD血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响(工土s，lit=5)
Table5 EffectofTFRDserumonlymphocyte
proliferationinmice(工土s，n一5)
As70组别——
i0％ 20％ 30，i 40％ sog
正常血清0．32-[-0．0237+0．05．56+0．02．74i0．01 0．83j：0．03
TFRD血清0．32士0．020．47士0．02’0．60±0．ol74±0．020．84士0．05
TFRD血清+conA0．29士0．020．39土0．040．65±0．00”0．74士O．030．69士O．01
TFRD血清+LPS0．35士O．03．43土0．01’0．71士0．06。0．83+0．03’0．85：1：0．03
与正常血清组比较：+P。P表6 TFRD血清对NK和LAK细胞杀伤活性的影响
(工-4-S，tl一5)
Table6 EffectofTFRDserumonkillingactivities
ofNKandLAKcells(J±s，n一5)
与正常血清组比较：。P。P3．6 TFRD血清对巨噬细胞吞噬功能的影响：
TFRD血清对正常小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功
能有增强作用，但与相等添加量的正常血清组相比，
只有TFRD血清添加量为30％时作用有显著性差
异(P<0．05)，见表7。
表7 TFRD血清对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
(j土s，辟一5)
Table7 EffectofTFRDserumonphagocytosis
ofmacrophagesinmice(苫士S，一一5)
与正常血清组比较：+P’ 4讨论
中药血清药理学是由日本学者在1984年提出
的，并由田代真一命名。它是指动物经口服给药一段
时间后，采集动物血液，分离血清，用含药物成分的
血清代替中药进行体外实验的一种方法[8]。中药复
方成分较复杂，直接进行体外实验有许多干扰因素，
科学性较差。该方法克服了中药直接进行体外实验
的不利因素，使反应体系更接近于体内环境，并且客
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·725·
观地模拟了药物与机体的相互作用过程，可更深入
地揭示药物作用机制，使结果具有真实性和科学性。
本实验建立了测定血清中TFRD浓度的高效
液相色谱方法，该方法准确、科学性强。根据不同时
间的HPLC指纹图谱测定血药浓度，为在血清药理
学方法中寻找一个合适的采血时间点提供一个更可
行的手段，也为研究药物在体内的吸收、代谢及其作
用机制提供了一个可靠的方法。由TFRD的药一时
关系可知，血清药物浓度在0～30min是逐渐上升
的，在30～60min是逐渐下降的，在60min的血清
中几乎已经没有药物。因此，确定ig后30min为采
血最佳时间点。由于中药试剂一般在给药3d后才
能观察到效果，并结合血清药理学实验中通常采用
的给药方式[9]，在本实验过程中，采取了1日2次，
给药7次的给药方案。
本实验从刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、提高NK
与LAK细胞杀伤活性以及增强巨噬细胞吞噬功能
等方面对TFRD含药血清的活性进行了评价和分
析，结果证实了TFRD含药血清对小鼠的细胞免疫
功能如淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬活性有一定的
促进作用，对NK以及LAK细胞的杀伤活性表现
出十分显著的促进作用。说明TFRD通过提高NK
和LAK细胞的杀伤活力实现对小鼠细胞免疫功能
的提升。
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关木通肾毒性的代谢组学研究
赵剑宇1，颜贤忠，彭双清2
(1．军事医学科学院国家生物医学分析中心，北京100850；2．军事医学科学院毒物药物研究所
国家北京药物安全评价研究中心，北京100850)
摘 要：目的 研究经关木通染毒后大鼠尿液的代谢表型改变及其与组织病理和尿液、血浆生化指标的相关性，探
讨代谢组学在中药毒理学研究中的应用。方法关木通分4个剂量组：36、32、28、24g／kg，Wistar大鼠连续ig给药
6d，12h后收集尿样，测定1H—NMR谱，并进行血浆生化指标和肾脏组织病理学检查。结果染毒后，大鼠肾脏出
现不同程度的炎症坏死，尿样中氧化三甲胺、柠檬酸、牛磺酸、肌酐、甜菜碱等代谢物均有不同程度的下降，而醋酸、
丙氨酸则显著上升。主成分分析表明，给药组与对照组的代谢谱有明显差异，能够被区分开，而造成组间差异的主
要影响因素是醋酸和氧化三甲胺的变化。不同剂量条件下，各组动物的代谢谱也各不相同，与肾脏病理和血浆生化
改变相一致。结论关木通能够对肾脏造成损害，且大鼠尿液的代谢物谱与关木通毒性作用强度密切相关，代谢组
学分析方法在毒理学研究中有着广泛的应用前景。
关键词：关木通；肾毒性；代谢组学；核磁共振；模式识别
中图分类号：R285．53 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0725—06
收稿日期：2005—02—26
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30371705)；国家高技术研究发展计划项目(2002AA22342D)
作者简介：赵剑宇(1974一)，男，湖南人，在读硕士研究生，主要从事中药毒性的代谢组学研究。
*通讯作者颜贤忠Tel：(010)66930305E—mail：yanxz@nic．bmi．ac．cn
万方数据
芫花根总黄酮含药血清对小鼠细胞免疫功能的影响
作者： 高晓雯， 郑维发， 彭烨城， GAO Xiao-wen， ZHENG Wei-fa， PENG Ye-cheng
作者单位： 徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(5)
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引证文献(4条)
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3.谭秦莉.刘冬.李玉宝.彭代银 总黄酮化合物药理作用研究进展[期刊论文]-安徽中医学院学报 2009(3)
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