全 文 ：·836· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
制剂与质量
葛根素在Caco一2细胞模型中的吸收特性
崔升淼1，赵春顺2，何仲贵3+
(1．广东药学院中药学院，广东广州 510006；2．中山大学药学院，广东广州510080；
3．沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016)
摘要：目的研究葛根素在Caco一2细胞中的吸收特性。方法改变药物浓度、实验温度和使用合适的抑制剂，测
定葛根素在Caco一2细胞中的跨膜转运特性。结果葛根素在Caco-2细胞的转运呈现较强的方向性，随着葛根素质
量浓度的增加，其表观渗透率(PDR)降低(2．1～1．4)。随着温度升高PDR增大。当加入代谢抑制剂KCN和2，4-二
硝基苯酚时，葛根素的PDR降低(由1．7分别降至1．0和1．2)。当加入100mg／L维拉帕米时，A面到B面的表观
渗透系数Papp(A—B)从(o．84±0．18)X10-7cm／s增加到(1．01土0．17)×10～cm／s，而B面到A面的Papp(B—
A)从(1．43土0．18)×10-7cm／s降低到(1．11士0．24)×10-7cm／s。结论葛根素在Caco一2细胞模型中的转运受到
P一糖蛋白的外排作用。
关键词：葛根素；Caco一2细胞；P一糖蛋白
中图分类号：R269．1 文献标识码；A 文章编号：0253—2670(2007)06—0836—04
UptakingcharacteristicsofpuerarininCaco一2modelsystem
CUISheng—mia01，ZHAOChun—shun2，HEZhong—gui3
(1．CollegeofChineseMateriaMedica，GuangdongPharmaceuticalUn versity，Guangzhou510006，China；2．School
ofPharmaceuticalSciences，SunYat—senU iversity，Guangzhou510080，China；3．SchoolofPharmacy，
ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)
Abstract：ObjectiveTos udytheuptakingcharacteristicsofpuerarininCaco-2modelsystem。
MethodsThetransepithelialransportingcharacterofpuerarinacrossCaco一2cellswasinvestigatedby
changingtheconcentration，temperatureofdrugandusingappropriateinhibitors．ResultsThetransport
ofpuerarinacrossCaCO一2cellmonolayerswasdirectional．Withtheincreaseoftheconcentrationofpue—
rarin，thepermeabilityd rectionratio(PDR)wasdecre sedfrom2．1to1．4．Withtheincreaseoft mper—
ature，PDRwasincreased．Whenthemetabolicinhibitors，KCNand2，4一dinitrophenol，wereadded，the
PDRwasdecreasedfrom1．7tO1．0and1．2，respectively．When100mg／LV rapamilwasadded，the
permeabilitycoefficientofapicaltobasolateralwasincreasedfrom(O．84±0．18)×10-7cm／stO(1．01±
0．17)×10—7cm／s，andthepermeabilitycoefficientofbasolateraloapicalwasdecreasedfrom(1．43±
0．18)×10-7cm／sto(1．11土0．24)×10～cm／s．ConclusionThevac ationbyP—glycoproteinaff ctsthe
puerarintransepithelialransportc ossCaco一2cells．
Keywords：puerarin；Caco一2cells；P—glycoprotein
葛根素是从豆科植物野葛中提取的有效成分，
具有扩张冠脉、增加冠脉血流量、降低血压、减慢心
率、降低心肌耗氧量等作用[13，临床上主要用于治疗
冠心病、心绞痛并发呼吸道和肺部感染、眼底病、心
肌炎等多种疾病。葛根素口服给药时生物利用度
差L2]。Caco一2细胞模型(thehumancolonadenocar—
cinomacellines)是进行药物的肠道摄取和代谢研
究最好的体外模型[3~5]。国外近20年来已广泛采
用，国内一些实验室也建立了Caco一2细胞体外吸收
模型和损伤模型。Caeo一2细胞与人小肠上皮细胞形
态相似，具有细胞极性和紧密连接，存在各种代谢酶
和转运系统，如谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、葡萄糖
醛酸酶、二肽、P一糖蛋白、糖、维生素B，。等各种主动
转运体。本实验旨在运用Caco一2细胞模型研究葛
根素的吸收机制，探讨时间、温度、药物浓度和各种
抑制剂对细胞摄取药物的影响。
收稿日期：2006一10—08
基金项目：崔升淼(1974一)，女，辽宁大连人，博士，讲师，从事中药新剂型及药动学研究。E—mailcuishengmiao@yahoo．corn
*通讯作者何仲贵Tel：(024)23986321E—mailhezhonggui@gmail．corn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·837·
1材料
XD一101型倒置生物显微镜(南京江南光电股
份有限公司)，低速离心机(北京医用离心机厂)，
DL—CJ一2F洁净工作台(哈尔滨东联电子技术开
发有限公司)，德国HearousCO。培养箱，跨膜电阻
仪，Transwell细胞培养板(CorningCostar，美国)。
葛根素(质量分数为99．2％，烟台鲁银药业有
限公司)，DMEM培养基(Dulbecco7 SModifiedEa—
gle
7
Smedium，Gibieo)，新生牛血清(56℃失活30
min，郑州佰安生物工程有限公司)，非必需氨基酸
(美国Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。
Caco一2细胞株购于美国ATCC(American
TypeCultureCollection，Roehville)公司，实验所
用的细胞传代数为40～60代。
2方法与结果
2．1 细胞的培养：将浓度为2×106～3×106／mL
Caco一2细胞液0．5mL种植在Transwell(碳酸聚酯
多孔膜插件)上，并用小镊子将插件取出，向孔中加
入1．5mL培养液。2h更换1次培养液，培养3周
后细胞形成紧密单层，可用于实验。
2．2溶液的配制
2．2．1 HBSS溶液的制备：用蒸馏水配制，含刁与℃aCl。·
2H201．3mmol／L，KCl5．4mmol／L，KH2P040．44
mmol／L，MgCl2·6H200．49mmol／L，NaCl137
mmol／L，Na2HP04·12H20．5mmol／L，D—Glu—
cose5．5mmol／L，NaHC034．2mmol／L，即得。
2．2．2葛根素溶液的制备：精密称取葛根素适量，
用HBSS溶液溶解，制得100、200、500mg／L葛根
素溶液。
2．3数据分析Ⅲ：采用表观渗透系数(Papp)和表观
渗透率(PDR)表示。
Papp—dQ／dt·1／(A·Co)
C。是葛根素所在面(donor)的葛根素初始质量浓度，
dQ／dt是在接受面(receiver)葛根素出现的速率，A是聚碳酯
膜的表面积。
渗透方向率，即表观渗透率PDR—P(B—A)／P
(A—，B)
P(B---A)是葛根素从B面到A面的表观渗透系数，
P(A-,-B)为葛根素从A面到B面的表观渗透系数。
2．4葛根素在Caco一2细胞上的吸收：将培养好的
Caco一2细胞用HBSS溶液洗涤3次，最后一次置于
37℃培养箱中培养30min后取出。A面一B面实
验：将0．5mL待测液放入A面，1．5mLHBSS放
入B面；B面一A面实验：将0．5mLHBSS放人A
面，1．5mL待测液放入B面，将Transwell板于恒
温摇床(37℃，50r／min)中孵育2h，每0．5h从受
药侧取出0．1mL，并补加0．1mLHBSS。取出的溶
液采用HPLC法测定。
2．4．1吸收时间对葛根素吸收的影响：以200mg／L
葛根素溶液作为待测液进行药物转运实验，分别测
定葛根素在A面和B面的吸收与吸收时间的关系，
见图1。结果表明随着孵育时间的延长，无论是A
面一B面还是B面一A面，葛根素的吸收量均呈增
加趋势，但A面的吸收量要显著高于B面(P<
0．05)，说明葛根素在Caco一2细胞上的转运具有一
定的方向性。
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图1葛根素在Caco一2细胞中的转运(n一3)
Fig．1Timecurvesofpuerarintransport
inCaco一2cells(掸一3)
2．4．2 质量浓度对葛根索吸收的影响：以100、
200、500mg／L葛根素溶液作为待测液进行转运实
验，结果见表1。可见随着葛根素质量浓度的增加，
Papp(A—B)也相应的增大(P<0．05)，而Papp
(B—A)略有降低，且PDR也逐渐降低。
表1不同浓度的葛根素在Caco一2细胞中的转运(n一3)
Table1 Transportofpuerarinatdifferentco centrations
inCaco一2cells(撑一3)
2．4。3温度对葛根素吸收的影响：将200mg／L葛
根素待测液分别加入A面和B面，于4、15、25、37
℃时测定葛根素的Papp，见图2。结果表明随着温
度下降其相应的Papp(B—A)也迅速下降，而Papp
(A—B)略有增加，且随着温度升高PDR增大。
2．4．4代谢抑制剂对葛根素吸收的影响：分别测定
200mg／L葛根素在无代谢抑制剂、1mmol／L
KCN、1mmol／L2，4一二硝基苯酚的表观渗透系数，
见表2。结果表明，A面到B面的Papp(A—B)的升
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
‘
要
宣
量
0 10 ZU 30 4U
￡『【c
图2温度对葛根素转运的影响白一3)
Fig．2Effectof emperatureontransport
ofpuerarin(露一3)
高，而B面到A面的Papp(B--+A)降低，且两者的
比值PDR趋近于1，说明葛根素在Caco一2细胞转
运可被非竞争性抑制剂KCN和2，4一二硝基苯酚抑
制，表明葛根素在Caco一2细胞转运部分是由载体介
导的。
表2代谢抑制剂KCN和2，4-二硝基苯酚对葛根素
转运的影响饧一3)
Table2 EffectoflnhibitorsKCNand2，4-dinitrophenol
ontransportofpuerarinQ一3)
2．4．5P一糖蛋白抑制剂对葛根素吸收的影响：分别
测定200mg／L葛根素在无P一糖蛋白抑制剂维拉帕
米和有100mg／L维拉帕米的表观渗透系数，见表
3。结果表明，A面到B面的Papp(A—B)升高，而B
面到A面的Papp(B—A)降低，且两者的比值趋近
于1，说明葛根素在Caco一2细胞转运的有向性
消失。
表3维拉帕米对葛根素转运的影响(n一3)
Table3 EffectofinhibitorVerapamilontransport
ofpuerarin白一3)
3讨论
实验结果表明葛根素的跨细胞转运呈现较强的
方向性，A—B的转运速率小于B—A的，说明葛根
素的跨细胞转运除被动扩散外，还存在着外排泵的
作用，而且葛根素转运的有向性(PDR值)随着葛根
素质量浓度的增加趋于降低，且这种有向性可被P一
糖蛋白的抑制剂维拉帕米抑制，也可被代谢抑制剂
KCN和2，4一二硝基苯酚抑制，同时也受温度的影
响。参与葛根素在Caco一2细胞中转运的载体可能是
P一糖蛋白，即葛根素可能是P一糖蛋白的底物。
以上结果可解释为：由于P一糖蛋白的作用，使
葛根素的跨细胞转运具有一定的方向性。P一糖蛋白
(P—glycoprotein)是由多药耐药(muhidrugresis—
tance，MDR)基因编码的分子量为170kD的膜蛋
白，由1280个氨基酸组成，属于ABC(ATPbind—
ingcassert)家族的成员，系一种能量依赖性的药物
外排泵，通过ATP供能[6]。该蛋白具有能量依赖性
地将药物从肠浆膜转运到肠黏膜而排入肠腔的作
用，从而导致药物吸收量减少。P一糖蛋白存在于Ca—
CO一2细胞的A面的细胞膜上，它将细胞内葛根素作
为底物排出细胞外，使得A—B的转运速率减慢，而
B—A的转运速率增大。作为载体，P一糖蛋白的主动
外排能力随底物浓度增加会趋于饱和，即达到一定
浓度后主动部分不再增加，外排作用增加减缓，而
A—B不减缓，故两者比率PDR会下降。维拉帕米是
P一糖蛋白的专属抑制剂，100mg／L维拉帕米基本抑
制了P一糖蛋白对葛根素的外排作用，使A—B和
B—A的转运速率相近，有向性消失。
对温度敏感是载体介导转运的共同特征[7]。载
体是存在于细胞膜上的蛋白体，在合适的温度下才
有活性。当温度下降时，其活性逐渐减弱直至失活，
因此它的功能受温度的影响很大。如果药物的吸收
是由载体介导的，这些载体可被一些抑制剂如
KCN、2，4一二硝基苯酚、NaCN、ouabain和dipyri—
damole所抑制E8,93。上述实验结果证明了葛根素在
Caco一2细胞转运的方向性可被KCN和2，4一二硝基
苯酚所抑制，这进一步证明了葛根素在Caco一2细胞
转运部分是由载体介导的。
可见葛根素经肠黏膜吸收存在外排泵P一糖蛋
白的作用，这可能是葛根素口服生物利用度低的原
因之一。
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圆背角无齿蚌中抗肿瘤活性组分的提取工艺研究
柯乾坤1，胡水根”，刘 娟2，陈正伟2，卞俊1，王朝武1，蔡定国1
(1．解放军第四一一医院南京军区药学专科中心，上海200434；2．江西中医学院，江西南昌330006)
摘要：目的优选圆背角无齿蚌中有效组分的最佳提取工艺。方法选用L。(34)正交试验，以水提次数、醇沉体
积分数、盐溶的氯化钠质量浓度为因素进行比较，对影响圆背角无齿蚌中有效组分的提取工艺进行优选。采用硫
酸一苯酚法和凯氏定氮法测定含糖量和含氮量。以综合加权评分法比较实验结果。结果 最佳提取工艺为在4℃以
下用4倍蒸馏水量，提取1次，醇沉时的乙醇体积分数为70％，盐析的氯化钠溶液质量浓度为8％。结论优选的圆
背角无齿蚌中有效组分的提取工艺可行。
关键词：圆背角无齿蚌；正交试验；硫酸一苯酚法；凯式定氮法
中圈分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)06—0839—03
ExtractiontechniquesofantitumoreffectveconstituentfromWoodianaanatonta
KEQian—kunl，HUShui-genl，LIUJuan2，CHENZheng—wei2，BIANjunl，
WANGChao～WUl。CAIDing—gu01
(1．ResearchCenterofPharmacy，411HospitalofPLA，Shanghai200434，China；2．JiangxiCollege
ofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China)
Abstract：ObjectiveTooptimizethextractionofeffectveconstituentfromWoodianaanatonta．
MethodsL9(34)Orthogonaltestwasusedwiththreefactors，includingtimesofwaterxtracting，con—
centrationofethanolprecipitation，andconce trationofsodiumchloride．Thecont ntsofpolvsaccharides
andglycoproteinwasdeterminedbysulphoacid—phenolandt stingnitrogen．Thetestresultswerecorn—
paredbycomprehensireweightedscore．ResultsTheoptimumtechnologywas：onceofwaterxtraction
byfour—foldamountofdistilledwaterat4℃，theconcentrationofsodiumchlorideto8％，theconcentra—
tionofethan01precipitationo70％．ConclusionTheoptimalextractionmethodf reffectiveconstituents
inW．anatontaiSfeasibile．
Keywords：WoodianaanatontaLe ；orthogonaltest；sulphoacid—phenolmethod；methodoftesting
nitrogen
本课题组对贝壳软体动物进行抗肿瘤作用筛选
发现圆背角无齿蚌WoodianaanatontaLe 和海洋
蛤具有类似的抗肿瘤活性‘1’2|。因此对圆背角无齿蚌
抗肿瘤活性组分进行了提取分离，得到抗肿瘤活性
成分的有效组分跚。进一步的药理实验表明圆背角
无齿蚌抗肿瘤活性组分的脂质体1：1服给药对4种瘤
株显示较强的抗瘤作用，同时具有一定的免疫功能。
为了给圆背角无齿蚌抗肿瘤活性组分临床前研究提
收稿日期：2005一10—20
基金项目：上海市科委重点基金项目(03DZl9504)
作者简介：柯乾坤(1974一)，男，硕士，从事新药研究与开发。Tel：(021)65927686E—mail：keqkun@163．com
*通讯作者胡水根
万方数据
葛根素在Caco-2细胞模型中的吸收特性
作者： 崔升淼， 赵春顺， 何仲贵， CUI Sheng-miao， ZHAO Chun-shun， HE Zhong-gui
作者单位： 崔升淼,CUI Sheng-miao(广东药学院中药学院,广东,广州,510006)， 赵春顺,ZHAO Chun-
shun(中山大学药学院,广东,广州,510080)， 何仲贵,HE Zhong-gui(沈阳药科大学药学院
,辽宁,沈阳,110016)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(6)
被引用次数： 4次

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大学学报（自然科学与工程版） 2011(2)
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