全 文 ：·1008· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月
试验，可以得到各重金属的脱除率分别为55．2％、
59．2％、52．0％。表5的结果表明，超临界配合萃取
后橘红中的重金属量可达到FDA标准。
表4最佳工艺的萃取效果
Table4 Extractiveeffectsunderoptimumtechnics
3结论
在本实验中使用NaDDC作为超临界C0：萃取
橘红中重金属的配合剂，研究了压力、温度及配合剂
用量对重金属萃取效率的影响。采用L。(34)正交表
设计试验，确定了最佳萃取条件，萃取后的药材中重
金属的量显著下降，为降低中药材中重金属开辟了
一条新的思路和研究方法。通过实验研究得到超临
界C0：萃取橘红中的重金属的较佳萃取条件为压
力25MPa、温度60‘C、配合剂量2g、萃取时间3h；
压力对铜的萃取影响很大，随着压力增大，萃取率增
大；温度对各离子的萃取率影响都很大；萃取时间对
铜的萃取率影响较大，但对砷、铅的影响不明显。
就超临界CO：萃取中药中重金属，笔者认为今
后的工作应从以下两个方面入手：一是对配合萃取
本身的机制的研究，通过选用适宜的配合剂与改性
剂，取得更多的热力学与动力学数据，建立超临界流
体萃取重金属的理论模型；二是对样品的研究，从重
金属形态与基体的角度进行研究，一方面可以提高
萃取的选择性与效率，一方面可以在保持中药有效
药性的前提下，将有毒重金属萃出，降低其量，才能
使配合萃取重金属的科研有意义。
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肠内菌群对积雪草苷的代谢转化研究
翁 骏，吕秋军。，田 瑛，张敏，卞广兴，温利青
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850)
摘要：目的通过离体、在体实验研究大鼠肠道内菌群对积雪草苷的代谢作用，并确定代谢产物的化学结构。方
法将积雪草苷加入大鼠肠内细菌的菌酶溶液中，温孵一定时间后，以TLC和LC—MS法检测体外实验代谢产物，
LC—MS法检测在体实验大鼠尿、血中的代谢产物。结果发现了3个积雪草苷的代谢产物，鉴定了代谢产物的结
构。结论积雪草苷可被大鼠肠内菌群代谢，原形物和代谢产物均为吸收入血成分。
关键词：积雪草苷；肠内菌群；代谢物
中圈分类号：R286．02 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2006)07—1008—04
Metabolismandtransformationof siaticosidebyint stinalflora
WENGJun，LUQiu—jun，TIANYing，ZHANGMin，BIANGuang—xing，WENLi—qing
(InstituteofRadiationMedicine，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，China)
Keywords：asiaticoside；intestinalflora；me abo ites
积雪草苷(asiaticoside)为五环三萜类皂苷，是伞形科植物积雪草Centellaasiatica(L．)Urban的
收稿日期：2005—09—23
作者简介：翁骏(1978)，男，北京市人，在读硕士生，研究方向为新药筛选。E—mail：wengjunpharm@hotmail．com
*通讯作者 吕秋军Tel：(010)66932201E—mail：lqj66@yahoo．eom．cn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月·1009·
主要活性成分，可刺激成纤维细胞的胶原合成[1]，临
床用于促进创伤愈合跚、治疗麻风病E3]和溃疡‘“。笔
者发现积雪草苷有其他显著在体药理活性，但其口
服生物利用度很低。因此用离体方法研究大鼠肠道
菌群对积雪草苷的代谢作用，并检测积雪草苷口服
后吸收入血的成分，以期阐明其发挥药效的物质
基础。
1实验材料
SD雄性大鼠(200～250g)购自军事医学科学
院实验动物中心，清洁级。积雪草苷(Fluka，质量分
数≥98．5％)。
Waters2695高效液相色谱仪，Waters2487
UV检测器；FinniganMAT公司LCQ液相色谱一电
喷雾质谱仪；ShiseidoCapcellpakC18反相色谱柱
(150mm×4．6mm，5弘m)；THZ～95型台式恒温
振荡培养箱；固相萃取柱ASISepedTMC。8／18(100、
500mg)；Millipore超纯水系统。
色谱用硅胶GF254(青岛海洋化工有限公司)；
乙腈(FisherScientific)；考马斯亮蓝蛋白测定试剂
盒(南京建成生物工程研究所)；厌氧培养液E53[-37．5
mLA液(0．78％K2HP04)和37．5mLB液
(0．47％KzHP04，1．18％ NaCl，1．2％
(NH。)2S04，0．12％CaCl2，0．25％MgS04·H。O，
混匀，再加入0．5gL一半胱氨酸，2mL25％L一抗坏
血酸，50mL8％Na：CO。，牛肉膏1g，蛋白胨1g，
营养琼脂1g，加蒸馏水至1L，最后调pH7．5～
8．o]；人工胃液和人工肠液按《中国药典>>2005年版
配制。
2实验方法
2．1制备微生物粗酶悬浮液卟1
2．1．1厌氧菌株的活化：取一段大鼠的结肠，取出
新鲜粪便，按2g：19mL的比例加入厌氧培养液中
得肠菌培养液。在无菌条件下，从厌氧菌贮备液内取
出20扯L菌液，加到10mL新的厌氧培养液中，然
后在37‘C厌氧培养24h。
2．1．2厌氧菌株的预培养：在无菌条件下，从活化
的厌氧菌液中取出0．1mL菌液，加入到10mL新
的厌氧培养液，然后在37。C厌氧培养24h。
2．1．3厌氧菌株的扩大培养：在无菌条件下，从预
培养的厌氧菌液中取出1mL菌液，加到100mL新
的厌氧培养液中，然后在37℃厌氧培养24h，备用。
2．1．4微生物粗酶的提取：将扩大培养的厌氧菌液
在7000r／min、4℃条件下离心10min；倾去上清
液，沉淀用0．9％NaCl溶液悬浮，然后在7000
r／rain、4℃条件下再次离心10min。弃去上清液，将
沉淀用21mL0．2mol／LpH7．0的磷酸盐缓冲液
悬浮，即得微生物粗酶的悬浮液。用Bladford法测
定微生物粗酶的蛋白质质量浓度为515．7pg／mL。
2．2积雪草苷体外代谢产物的制备和提取：将微生
物粗酶的悬浮液分成两份，各10mL，分别加入积雪
草苷使质量浓度为0．1mg／mL，37‘C恒温培养箱
中振荡培养，于24、48h取出后加入10mL冷乙腈
终止反应。涡旋振荡30S后以4500r／min离心3
min沉淀蛋白。N。吹去上清液中乙腈，剩余液体用
500mg固相萃取柱萃取。甲醇洗脱液用N：吹干，然
后以流动相1mL重建得样品，滤过后进LC—MS分
析。同时以温孵粗酶空白溶液和药物的磷酸盐缓冲
液(o．1mg／mL)48h作为对照。
2．3 LC—MS和TLC法检测条件
2．3．1色谱条件：检测波长为204am，体积流量为
1 mL／min，柱温26。C，流动相A为乙腈，流动相B
为含10％乙腈的水溶液。梯度洗脱程序：0～25
min，A：12％一50％，B：88％—+50％；25～30min，
A：50％，B：50％；30～40min，A：50％—，12％，B：
50％～88％。
2．3．2质谱条件：负离子检出模式；喷雾电压4．5
kV，鞘气(N2)流速：50arb；辅助气(He)：5arb；毛细
管温度：320℃；毛细管电压：12V；扫描范围300
1 200。
2．3．3TLC法检测条件：硅胶板硅胶厚度约为
0．25mm，展开溶剂系统为氯仿一甲醇一水(65：35：
10)；醋酐一浓硫酸一无水乙醇(1：1：10)显色。
2．4积雪草苷在人工胃液和人工肠液的稳定性考
察：精密称取积雪草苷1．0mg，加入20弘LDMSO
溶解，与10mL37。C人工胃液充分混合，在0、1、2、
3、4h点各取1mL，以三氯醋酸沉淀蛋白，上清液用
100mg固相萃取柱萃取，甲醇洗脱液挥干后以流动
相1mL重建得样品，滤过后进HPLC分析。同法，
将积雪草苷与人工肠液共温孵，于0、4、8、12、24h
取样1mL，前处理后HPLC分析。以0h组测得的
积雪草苷的量为100％，依据各组峰面积与0h组的
峰面积之比求出经一段时间后未变化的积雪草苷占
原加入药物的比例。
2．5在体实验方法：大鼠于代谢笼中饲养7d，适应
周围环境后收取空白尿液。禁食12h，灌胃积雪草
苷，剂量为50rag／(kg·d)，期间自由饮用糖盐水，
24h内收集尿液。第2次给药后6h用乙醚麻醉大
鼠，腹主动脉取血约5mL，分离得血浆。血浆和尿液
万方数据
·1010· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月
以等量10％三氯醋酸沉淀蛋白后用C。。固相萃取柱
萃取，收集甲醇洗脱液，挥干后以流动相溶解残渣，
滤过，取滤液进行LC—MS分析。
3实验结果
3．1 离体培养肠道菌对积雪草苷的代谢转化作用
3．1．1TLC检测结果：见图1。薄层色谱检查结果
表明24h后，除原形物外另外检出3个代谢物斑
点；48h后，原形物不能用薄层色谱法检出，仍出现
3个代谢物斑点。
a一积雪草苷
b一积雪草酸
c一代谢产物(24h)
d一代谢产物(48h)
a—asiaticoside
b—asiaticacid
C-metabolites(24h)
d—metabolites(48h)
图1 积雪覃苷及其代谢严物的TLC图谱
Fig．1TLChromatogramofasi ticoside
anditsmetabolites
3．1．2I．C—MS检测结果：由于积雪草苷和其苷元
积雪草酸极性相差很大，为了得到满意的分离结果，
采用乙腈和含10％乙腈的水溶液为洗脱溶剂进行
梯度洗脱。见图2，检测30min，积雪草苷各代谢产
物分离结果较好，与对照品对照可知10．66min峰
为积雪草苷，25．08min处为苷元积雪草酸。对样品
进行一级质谱全扫描，大部分产物在负离子模式下
响应较好。将积雪草苷置磷酸盐缓冲液温孵48h
OH
H
14．70
lO．62 B
』_。．r．．【一i—J”
0 5 10 15 2U 25 30U 5 10 15 2U 2， 30
t{rain
图2积雪草苷与大鼠肠道菌酶温孵24h后液相色
谱图(A)和负离子模式下总离子流图(B)
Fig．2LC-UVChromatogram(A)andnegativeion
totalioncurrentchromatogram(B)of
asiaticosideandtsmetabolitesformed
followingincubationw thenzymesof
intestinalflorafor24h
后，无其他产物生成。
各时间点色谱峰的质谱检测结果为：10．66rain
处出峰物质m／z957．71为积雪草苷的准分子离子
峰EM—H]一；11．37rain处研／z811．53为失去1个
端基鼠李糖；14．81rain处m／z649．42为失去1个
葡萄糖和1个鼠李糖；25．08rain处m／z487．37为
积雪草酸，生成量少，其在正离子和负离子模式下响
应值都较低，SIM模式下可检出；其他时间点出峰
由TLC图谱和菌酶空白图谱予以排除。
3．2 积雪草苷在人工胃液和人工肠液中的稳定性：
以0h时积雪草苷的量为100％，在人工胃液中温孵
4h和在人工肠液中温孵24h后，剩余率均大于
98％。胃液和肠液对积雪草苷基本无影响。
3．3大鼠在体实验代谢转化测定结果：见图3。
在体实验表明，大鼠口服积雪草苷吸收较差，尿
图3积营草苷经大鼠肠内菌群代谢途径
Fig．3Metabolicrouteofasiaticosidebyint stinalflorainrats
CH．OH
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月·1011·
液和血液均需较大程度浓缩后才能检出。口服积雪
草苷后，能在尿液中检测到原形物、代谢产物M1、
代谢产物M2、代谢产物M3(苷元)；在血液中检测
到原形物、代谢产物M1、M2。血液中未检测到苷元
积雪草酸可能是由于得量太少，低于质谱检测限。实
验结果表明，积雪草苷在大鼠体内经代谢后可生成
3种代谢产物，部分原药和代谢产物吸收入血，经尿
液排出。
4讨论
国内文献中对天然药物的肠道细菌代谢研究多
采用将药物直接加入肠细菌培养液中温孵，再经过
有机相反复提取和处理后进行分析，但此法培养液
中的杂质不易除去，对分析仪器和结果解释都造成
很大影响。本实验采用肠菌粗酶与积雪草苷共孵育，
克服了上述缺点，结合TLC和LC—MS法给出明确
色谱和质谱图，阐明肠道菌群对积雪草苷的代谢转
化行为，用药量小且重现性很好。
从本实验结果可知积雪草苷可以在肠道内被代
谢，皂苷糖基应是由肠内菌分泌的苷键水解酶系水
解。推测积雪革苷在肠道内的代谢呈阶梯式，糖基逐
个被水解，直至全部转化为苷元。在本实验室另外的
实验中，大鼠肝脏微粒体对积雪草苷及其苷元积雪
草酸不产生代谢转化，预测积雪草苷进人体内除糖
基水解外无其他代谢作用，无首关效应，积雪草苷和
其代谢产物进入血液循环，共同发挥药效作用。
综上所述，积雪草苷口服后会被肠道菌群所代
谢。代谢产物随着端基糖的失去相对分子质量和极性
逐渐减小，吸收可能会有所变化，但吸收入血的量和
代谢产物对发挥药效的贡献大小还需进一步研究。
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氮酮和油酸增强黄芩苷经皮渗透作用的研究
杨巧丽1，周雪琴1’孙，张志慧1，王雷3，王学艳3，刘东志2，姚康德1
(1．天津大学高分子材料研究所，天津300072；2．天津大学化工学院，天津300072；
3．天津市长征医院药剂科，天津300021)
摘要：目的研究氮酮、油酸及两者配伍对黄芩苷透皮吸收的促进作用。方法透皮吸收研究以改进型Franz扩
散池为模型，采用HPLC法测定黄芩苷透过量，以均匀设计法考察氮酮、油酸及两者配伍对黄芩苷透皮吸收的影
响。结果 氮酮体积分数为10％时，黄芩苷24h累积透过量为466．11／tg／cm2，油酸体积分数为14％时，24h累积
透过量为77．34tzg／cm2，氮酮与油酸以10％：0．5％配伍后24h累积透过量为641．88／tg／cm2，促渗性能为
146．69。结论氮酮和油酸对黄芩苷的透皮吸收均有促进作用，两者配伍可产生协同促进作用，氮酮与油酸以
10％：O．5％配伍后促渗效果最好。
关键词：黄芩苷；氮酮；油酸；透皮吸收
中图分类号：R286．02 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)07—1011—03
Enhancementofbaicalinpercutaneouspenetrationbyazoneandoleica id
YANGQiao—lil，ZHOUXue—qinl“，ZHANGZhi—huil，WANGLei3，
WANGXue—yan3，LIUDong—zhi2，YAOKang—de
1
收稿日期：2005—09—30
基金项目：天津市自然科学基金资助项目(033610411)
作者简介：杨巧丽(198l一)，女，河北省石家庄市人，天津大学硕士研究生，研究方向为药物经皮渗透。
Tel：(022)27400911 E—mail：xiaozhaoy@eyou．com
*通讯作者周雪琴
万方数据
肠内菌群对积雪草苷的代谢转化研究
作者： 翁骏， 吕秋军， 田瑛， 张敏， 卞广兴， 温利青， WENG Jun， L(U) Qiu-jun， TIAN
Ying， ZHANG Min， BIAN Guang-xing， WEN Li-qing
作者单位： 军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(7)
被引用次数： 6次

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