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赤芍 HPLC指纹图谱的研究
张克荣 ,毕开顺
(沈阳药科大学 ,辽宁 沈阳　 110016)
摘　要: 目的　建立赤芍的 HPLC指纹图谱 ,为科学评价与有效控制赤芍质量提供新方法。 方法　采用 HPLC法 ,
测定了 18个不同产地赤芍样品。色谱条件: Hypersil C18柱 ( 200 mm× 4. 6 m m　 5μm) ,流动相为乙腈 -0. 025 mol /
L H3PO4-四氢呋喃 ( 9. 5∶ 90. 5∶ 1. 25) ,流速 0. 8 m L /min,检测波长 254 nm ,柱温为室温。结果　本研究建立的分
析方法有较好的重复性 ,不同产地赤芍药材色谱峰面积比值有一定的差异。 结论　色谱指纹图谱分析法能简便快
速地区分不同来源的赤芍药材 ,为全面控制赤芍药材的质量提供了依据。
关键词: 赤芍 ;高效液相色谱法 ;指纹图谱
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 1048 04
Study on f ingerprints of Red ix Paeoniae Rubra by HPLC
ZHANG Ke-rong , BI Kai-shun
( Shenyang Pharmaceutical Univ er sity , Shenyang 110016, China )
Abstract: Object　 To study the HPLC fingerprints and establish a sensi tive and speci fic method fo r
cont rolling th e quality o f Radix Paeoniae Rubra ( RPR) . Methods　 The HPLC method w as applied fo r
quality a ssessment of RPR. Al l 18 samples co llected f rom dif ferent places were determined A Hypersil-C18
column ( 200 mm× 4. 6 mm, 5μm) w as used w ith the mobile phase being acetoni t ri l-0. 025 mo l /L H3 PO4:
T HF ( 9. 5∶ 90. 5∶ 1. 25) , f low rate being 0. 8 mL /min, detecting w aveleng th being 254 nm , the co lumn
tempera ture being at room temperture. Results　 This method had a good repeatabi li ty and reproducibility,
·1048· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-04-09作者简介:张克荣 ( 1975- ) ,女 ,河北省保定市人 ,硕士 ,现在从事中药质量标准的研究。 　 E-mail: lkmn-09@ 163. com
* 通讯作者　　 Tel: ( 024) 23843711- 3363　 E-mail: ksbi@ mail. sy. ln. cn
and the ratio of peaks area of dif ferent habitat samples w ere di fferent. Conclusion　 The method is sui t-
able to di fferentia te RPR form dif ferent sources conveniently , and can be used as a quality cont rol method
fo r this herb.
Key words: Radix Paeoniae Rubra ( RPR) ; HPLC; fingerprints
　　赤芍为毛茛科芍药 Paeonia lact if lora Pall. 或
川赤芍 P . veitchii Lynch. 的干燥根。药材主产于内
蒙古、辽宁、河北、黑龙江、吉林等地 ,此外 ,甘肃、山
西、青海等地亦产 [1 ]。其味苦 ,微寒 ,归肝经。具有清热
凉血 ,散瘀止痛之功能 [2 ]。赤芍根主要含有芍药苷、芍
药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酰羟基
芍药苷等苷类成分 [3 ]。目前 ,多用芍药苷的含量控制
赤芍的质量 ,但这样不能反映赤芍中其他成分的情
况 ,难于真正控制其质量。 鉴于中药具有复杂的化学
成分 ,而其活性成分常常不甚明确的状况 ,国内外学
者逐渐认识到色谱指纹图谱方法是评价植物药质量
的有效方法之一 [ 4～ 7]。本实验采用 RP-HPLC方法建
立赤芍的指纹图谱 ,并考察了赤芍药材与产地之间的
关系 ,为全面控制赤芍的质量提供了新方法。
1　仪器与试药
LC- 10AD液相色谱仪 (日本岛津公司 ) ,
SPD- 10A检测器 (日本岛津公司 ) , C- R6A数据
处理机。
芍药苷对照品购于中国药品生物制品检定所 ,
批号为 0736- 200116;赤芍批号: 1093- 200001、川
赤芍批号: 1092- 200001,对照药材均购于中国药品
生物制品检定所。赤芍药材样品见表 1(经沈阳药科
大学孙启时教授鉴定 )。
表 1　赤芍样品来源
Table 1　Origins of RPR samples
样品号 样品来源 样品号 样品来源
1 中国药品生物
　制品检定所
9
10
辽宁
宁夏
2 中国药品生物
　制品检定所
11
12
吉林长春
内蒙赤峰
3 山东曹县 13 内蒙古Ⅱ
4 甘肃兰州 14 内蒙古Ⅲ
5 安徽亳州 15 山西
6 吉林市 16 内蒙古 (购于河北 )
7 河南 17 辽宁沈阳
8 内蒙古Ⅰ 18 四川中江
2　方法和结果
2. 1　对照品溶液的制备:精密称取芍药苷对照品适
量 ,用甲醇配制成 0. 25 mg /mL的溶液。
2. 2　供试品溶液的制备:精密称取赤芍粉末 1. 0 g ,
加入 50%乙醇溶液 10 mL,回流提取 3次 ,每次 2
h,滤过 ,合并滤液 ,旋转蒸发回收溶剂 ,残渣用甲醇
溶解并定容于 10 mL量瓶中 ,再精密量取 0. 5 mL
置 5 mL量瓶中 ,用流动相稀释至刻度 ,过 0. 45μm
微孔滤膜 ,续滤液作为供试品溶液 ,备用。
2. 3　色谱条件: Hypersil C18柱 ( 200 mm× 4. 6 mm,
5μm) (大连依利特科学仪器有限公司生产 ) ;流动
相: 乙腈-0. 025 mol /L H3 PO4 -四氢呋喃 ( 9. 5∶
90. 5∶ 1. 25) ;流速: 0. 8 mL /min; 检测波长: 254
nm;柱温:室温。
2. 4　精密度试验:精密称取 14号样品 ,按供试品溶
液制备方法操作 ,连续进样 5次 ,记录指纹图谱。 结
果表明 ,各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积
比值基本一致 ( RSD为 0. 6%～ 2. 5% ) ,符合指纹图
谱要求 [4 ]。
2. 5　重现性试验:精密称取 14号样品 5份 ,按供试
品溶液制备方法操作 ,记录指纹图谱。 结果表明 ,各
色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一
致 ( RSD为 1. 0% ～ 3. 6% ) ,符合指纹图谱要求。
2. 6　稳定性试验:精密称取赤芍对照药材 ,按供试
品溶液制备方法操作 ,分别在 0, 2, 4, 8, 16, 24 h测
定 ,记录指纹图谱。 结果表明 ,各色谱峰的相对保留
时间和其相对峰面积比值基本一致 ( RSD为
1. 2% ～ 4. 3% ) ,符合指纹图谱要求。
2. 7　赤芍的指纹图谱: 测定了 18个不同产地赤芍
样品 ,共获得 27个色谱峰。 典型色谱图见图 1。 其
中 , 16号峰为赤芍主要指标成分芍药苷 ,将其作为
内参比峰。以其色谱峰对内参比峰的相对保留时间
定性 ,按下式计算各色谱峰相对于其内参比峰的峰
面积比 X。
　X = Ai j /Ai sW i　 Ai j: 第 i个样品第 j个组份的峰面
积 , Ai s:第 i个样品的参比峰面积 ,W i:样品质量 ( g)。
2. 8　数据处理
2. 8. 1　系统聚类分析: 系统聚类分析是一种无管
理、无指导的模式识别方法。 可依据所测样品的数
据 ,对样品进行分类。 本研究以经形态学鉴定的 18
个不同批次和产地的赤芍样品为研究对象 ,进行指
纹图谱研究 ,获得包括芍药苷 ( 16号峰 )在内的 27
个色谱峰。将各色谱峰相对于内参照物色谱峰的峰
面积量化 ,得到 18× 27阶原始数据矩阵 ,运用 SPSS
软件对其进行系统聚类分析 ,采用离差平方和法
·1049·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
Ⅰ -山东曹县　Ⅱ -内蒙古Ⅰ 　Ⅲ -沈阳　Ⅳ -四川中江
Ⅰ -Shandong Caoxian　Ⅱ -Neimenggu I
Ⅲ -Sh en yang　Ⅳ -Sichuan Zh ongjiang
图 1　赤芍样品色谱指纹图谱
Fig. 1　 Fingerprint of RPR samples
(W ard s M ethod) ,利用欧氏距离 ( Euclidean)作为
样品的测度。 18个样品基本可分为两大类 ,第 1类
为赤芍 ,第 2类为川赤芍。 聚类谱系图见图 2。
图 2　赤芍样品聚类谱系图
Fig. 2　 Hierarchical clustering analysis f igure of RPR
2. 8. 2　相似度分析:指纹图谱反映的是样品整体的
特征 ,进行指纹图谱比较 ,可以反映样品之间的亲疏
程度 ,但是单纯的直观比较指纹图谱的峰的多少和
峰的大小 ,只是定性比较 ,而且又带有个人的主观
性。相似度可以定量的描述指纹图谱 ,本实验用相似
度分析对样品进行了比较 ,可以定量的、客观的对样
品进行评价。用沈阳药科大学计算机中心编制的“指
纹图谱相似度计算软件” ,以夹角余弦、相关系数和
欧氏距离作为测度 ,分别计算各样本的相似度 ,结果
见表 2。
表 2　相似度分析结果
Table 2　 Results of similarity analysis
No 欧氏距离 夹角余弦 相关系数
1 0. 99 0. 99 1. 00
2 0. 44 0. 66 0. 57
3 0. 86 0. 86 0. 84
4 0. 51 0. 51 0. 38
5 0. 90 0. 90 0. 90
6 0. 96 0. 97 0. 97
7 0. 95 0. 95 0. 95
8 1. 00 1. 00 0. 99
9 0. 93 0. 94 0. 95
10 0. 73 0. 68 0. 59
11 0. 99 1. 00 0. 99
12 0. 90 0. 90 0. 92
13 0. 95 0. 97 0. 96
14 0. 93 0. 93 0. 96
15 0. 86 0. 84 0. 80
16 1. 00 1. 00 1. 00
17 0. 96 0. 97 0. 97
18 0. 66 0. 54 0. 54
　　由表 2可知 ,相似度在 0. 80～ 1. 00可归为一
类 ,为赤芍样品 ,相似度小于 0. 79归为川赤芍。本试
验结果显示 ,采用两种不同检验方法 ,结果是一致
的 ,得到两种不同方法之间的相互认证。
3　讨论
3. 1　本实验过程中 ,选择了几种流动相系统:甲醇-
水 ( H3 PO4 调至不 同 pH ) ; 乙腈 -水 -四氢呋 喃
( H3 PO4调至不同 pH) ;甲醇 -乙腈-水 ( H3 PO4调至
不同 pH) ;乙腈-水 ( H3 PO4调至不同 pH)。 结果表
明: 流动相以乙腈-0. 025 mo l /L H3 PO4-四氢呋喃
( 9. 5∶ 90. 5∶ 1. 25)系统为最佳 ,各色谱峰分离度较
好 ,保留时间适中。
3. 2　本实验对甲醇、 95%乙醇索氏提取 ,甲醇、 95%
乙醇、丙酮 -水 ( 7∶ 3)回流提取 ,对提取溶剂、提取方
法进行了考察。结果表明 ,乙醇回流提取后所得色谱
峰的峰数为最多。后又对 50% , 75% , 95%乙醇回流
提取进行试验 ,结果差异不明显。本实验采用 50%
乙醇作为提取溶剂进行回流提取。
3. 3　本实验还对检测波长进行了选择 ,分别在
210, 230, 254, 282 nm处检测。结果表明 , 282 nm处
各色谱峰之间分离良好 ,但峰数少 ;在 210, 230 nm
检测 ,由于赤芍中芍药苷的含量最高 ,达到 60%左
右 ,必须具有相当的浓度 ,才能检测到指纹图谱中峰
·1050· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
面积小的特征峰 ,本实验采用 254 nm检测兼顾峰
数、分离度。有时 ,有的品种某一种成分含量很高 ,在
色谱图中占绝对优势 ,其他特征很弱 ,虽然这本身就
是特征 ,但有时为了区别用药材作起始原料和单一
成分直接投料 ,可使用不同的检测波长 ,突出其他特
征 ,相互参照辨认。并且避免图谱中仅有一种成分偏
高的现象 [8 ]。本研究为避免芍药苷成分偏高 ,并且为
图谱中除突出芍药苷色谱峰特征外 ,也同时突出其
他特征 ,故选 254 nm检测。
3. 4　色谱指纹图谱是通过对各样本色谱图进行比
较 ,来反映产品化学成分的差异。在指纹图谱相似度
计算中 ,一般将所选取的色谱峰同时作比较计算 ,反
映了指纹图谱的整体相似性 ,可对中药产品质量作
出较全面、准确地评价。
3. 5　目前 ,中药材的鉴别和分类很大程度上还依赖
于经验和表观分析 ,也缺乏从分析数据中获取评价
依据的统一、使用的方法。相似度计算方法数学概念
简单 ,数据处理过程简便、快速 ,在定量计算色谱指
纹谱相似度方面有其优势。 聚类分析在数据分类等
方面有效。本实验将两者结合起来发挥各自优势 ,使
中药指纹图谱质量控制更全面。
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三七及其栽培土壤中几种重金属元素含量的测定
冯光泉 ,张文斌 ,陈中坚 ,王　勇 ,崔秀明
(云南省文山州三七科学技术研究所 ,云南 文山　 663000)
摘　要: 目的　通过对 3年生三七块根及其根际栽培土壤样品中 3种主要的重金属元素含量进行检测 ,了解三七
和土壤中重金属元素残留量的存在情况 ,为三七 GAP栽培提供依据。方法　在三七的主产区选择了 48个点 ,每点
分别采集三年生三七块根及其根际栽培土壤样品 ,进行砷、铅、汞 3种主要的重金属元素残留量的检测分析。 结果
　三七及其栽培土壤中 3种重金属元素残留量大多符合标准规定 ,只有少数高于规定标准。 结论　三七主产区的
土壤环境质量均符合 GAP对栽培土壤的要求。
关键词: 三七 ;土壤 ;重金属元素
中图分类号: R282. 6　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 1051 04
Determination on res idues of several heavy metal elements
in Panax notoginseng and its cultivating soil
FEN G Guang-quan, ZHANG Wen-bin, CHEN Zhong-jian, WANG Yong , CU I Xiu-ming
( Wenshan Prefectur e Institute o f Sanqi in Yunnan Prov ince, Wenshan 663000, China)
Key words: Panax notoginseng ( Burki ll) F. H. Chen; soi l; heavy metal elements; determina tion
·1051·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-02-21基金项目:云南省中药现代化资助项目 (2000ZY001) ;云南省自然科学基金资助项目 ( 2001C0083M)作者简介:冯光泉 ,女 ,云南文山人 ,高级农艺师 , 1986年毕业于云南农业大学植保系 ,主要从事三七 GAP栽培研究工作 ,主持和承担多项云南省自然科学基金项目、国家中药现代化项目及云南省中药现代化项目 ,发表论文 10余篇。
* 通讯作者　 Tel: ( 0876) 2122577　 E-mail: sanqi f lx163@ . com