全 文 ：川芎嗪对花生四烯酸诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用
王 1, 2 ,周 新1* ,汪炳华2,张 冀2,陈丽达2,李小明2
( 1. 武汉大学中南医院 基因诊断中心,湖北 武汉 430071;
2. 武汉大学医学院生物化学与分子生物学系,湖北 武汉 430071)
摘 要:目的 研究川芎嗪 ( TMP ) 对花生四烯酸 ( AA , 160 mo l/ L ) 诱导的血管内皮细胞株 ECV304 损伤和凋
亡的保护作用及其机制。方法 MTT 法检测细胞存活率, 比色法测乳酸脱氢酶 ( LDH) 释放率和细胞丙二醛
( MDA ) 含量, Hoechst 33258 荧光染色法观察细胞核形态变化并测定细胞凋亡率,琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 降
解。结果 TM P ( 0. 25～1. 0 mmol/ L ) 能浓度依赖性地抑制 AA 引起的细胞存活率下降 ( P< 0. 05) ,并降低细胞
LDH 释放率和 MDA 含量 (P < 0. 05)。AA 处理 24 h 后的细胞呈典型的凋亡核固缩表现, 凝胶电泳显示 DNA 凋
亡梯带, TMP ( 0. 25～1. 0 mmo l/ L ) 能降低其凋亡率 ( P< 0. 05)。结论 TMP 对 AA 引起的 ECV304 细胞损伤和
凋亡具有保护作用, 其机制可能与其抗脂质过氧化作用有关。
关键词: 川芎嗪; 花生四烯酸; 内皮细胞; 细胞凋亡; 脂质过氧化
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0177 04
Protective effect of tetramethylpyrazine against apoptosis of vascular
endothelial cells induced by arachidonic acid
WANG Yun1, 2 , ZHOU Xin1 , WANG Bing-hua2 , ZHANG Ji2, CHEN Li-da2 , L I Xiao-ming 2
( 1. Gene Diagnosis Center of Zhongnan Hospit al, Wuhan Univ ersity , Wuhan 430071, China ; 2. Depart ment
of Bio chemist ry and Mo lecula r Biolo gy , Schoo l o f Medicine, Wuhan Univ ersit y, Wuhan 430071, China)
Abstract: Object T o study the pro tective ef fect of tet ramethy lpy razine ( T MP) against apopto sis of
vascular endo thelial cell line ECV304 induced by 160 mo l/ L arachidonic acid ( AA) . Methods T he via-
bility and damaged deg ree of ECV304 cells were monitored by MT T assay . The release of lactate dehydro-
genase ( LDH) and malondialdehyde ( MDA) content in ECV304 cells w ere measured by colo rimetr ic assay .
Hoechst 33258 dyeing w as used to observe AA-induced morpholog ical changes and count apoptot ic rat io .
Agaro se gel elect ropho resis was used to detect DNA fragmentat ion. Results T MP ( 0. 25—1. 0 mmo l/ L )
pr evented the inhibitory effect o f viability induced by AA ( P< 0. 05) . T MP ( 0. 25—1. 0 mmol/ L ) part ly
pr evented the increase in the release of LDH and MDA contents induced by AA ( P< 0. 05) . Cells tr eated
by 160 mol/ L AA show ed typical morpholog ical changes of apopto sis. A “DNA ladder”was also ob-
served. T MP ( 0. 25—1. 0 mmol/ L ) part ly decreased the rat io of apopto tic cells ( P< 0. 05) . Conclusion
TMP has pro tect ive effect on injury and apopto sis o f ECV304 cells induced by AA and the mechanism of it s
act ion w ould be related to ant il ipid perox idat ion.
Key words : tetr amethylpyrazine; arachidonic acid; endothelial cells; cell apoptosis; lipid per oxidation
近年研究表明, 血管内皮细胞凋亡在动脉粥样
硬化 ( athero scler osis, A S) 病变的发生、发展过程
中具有重要作用[ 1] ,因此,抗血管内皮细胞凋亡药物
的研究将为临床防治 AS 提供新途径。实验发现,
AS 斑块处积聚的大量游离花生四烯酸 ( arachidon-
ic acid, AA) 能诱导动脉壁中多种细胞凋亡,其机
制可能与其促细胞脂质过氧化作用有关[ 2～4]。川芎
嗪又称四甲基吡嗪 ( tetr amethylpyrazine, T MP) ,
是从川芎总生物碱中提取的有效成分。研究表明
T MP 对缺血再灌注损伤所致肾脏细胞凋亡具有保
护作用[ 5]。本实验应用 AA 诱导血管内皮细胞株
ECV304 凋亡, 观察 TMP 对 ECV 304 细胞凋亡的
保护作用并探讨其可能机制。
1 材料
DMEM 培养基、新生小牛血清 ( calf serum ,
CS) , Gibco 公司产品;花生四烯酸 ( AA) , Sigma 公
·177·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 2 期 2004年 2月
收稿日期: 2003-06-09基金项目:湖北省自然科学基金资助项目 ( NO2003ABA188)作者简介:王 ( 1975—) ,女,上海人, 2001级在读博士研究生,主要从事动脉粥样硬化分子机制的研究。
* 通讯作者 Tel: ( 027) 87317802 E-m ail : zh ou xjyk@ pub lic. w h. h b. cn
司产品 ( HPLC, 纯度≥95%) ,用无水乙醇溶解,临
用前用无血清 DMEM 培养基稀释, 其中乙醇终浓
度低于 0. 25% (此浓度对细胞无毒性) ;盐酸川芎
嗪 ( TM P) , 北京第四制药厂生产, 批号 010723, 临
用前用 无血清 DMEM 培养基稀 释; Hoechst
33258、胰蛋白酶 ( 1∶250)、噻唑蓝 ( MT T )、蛋白酶
K 等, Sigma 公司产品; T r itonX-100, Bio-Rad 公司
产品;丙二醛 ( MDA) 检测试剂盒,南京建成生物工
程研究所产品;其余试剂均为国产分析纯。
2 方法
2. 1 细胞培养:血管内皮细胞株 ECV304 购自武
汉大学典型生物保藏中心。将 ECV304细胞接种于
含 10%CS, 100 U/ mL 青霉素, 100 g/ mL 链霉素
的 DMEM 培养基 ( pH 7. 2) 中,置 37 ℃, 5% CO 2
培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。
2. 2 MTT 法检测细胞存活率: 将生长良好的
ECV304 细胞制备成 5×104/ mL 的细胞悬液, 按每
孔 0. 1 mL 接种于 96孔板, 37℃, 5%CO 2温育 24 h
后换无血清培养基继续培养 24 h,使细胞同步化至
G 1期, 然后随机分为 8 组: 正常对照组加无血清
DMEM 培养基; AA 损伤组加入终浓度为 160
mol/ L AA; T M P 组分别加入终浓度为 0. 25,
0. 50, 1. 00 mmol / L TMP; TM P 保护组先分别加入
0. 25, 0. 50, 1. 00 mmol / L TMP 预保护 3 h 后, 再
加入 AA 160 mol/ L。各组细胞作用 24 h 后, 每孔
加入 MT T ( 5. 0 g/ L ) 20 L, 37 ℃ 孵育 4 h, 弃上
清液,每孔加入二甲基亚砜 100 L,静置 30 min 后
于波长 570 nm 处测定吸光度 ( A 570 nm ) 值, 以
A 570 nm值表示细胞存活率。
2. 3 乳酸脱氢酶 ( LDH) 释放率测定: ECV 304 细
胞以 1×105 / mL 接种于 24 孔板, 37 ℃, 5% CO2温
育 24 h, 无血清同步化处理后随机分组同 2. 2 项。
作用 24 h 后, 收集培养上清液, 每孔加入 0. 5 mL
细胞裂解液 ( 150 mmol/ l NaCl , 150 mmol/ L T ris-
HCl, 1 mmol / L EDTA , 1% T ritonX-100) , 4 ℃静
置 15 m in 后振荡数分钟,收集细胞裂解液, 用比色
法分别测定培养上清液和细胞裂解液中的 LDH 活
性,计算 LDH 释放率。
LDH 释放率= 上清液中 LDH 活性/ (上清液中 LDH
活性+ 细胞裂解液中 LDH 活性)×100%
2. 4 MDA 含量测定: ECV304 细胞以 1×105/ mL
接种于 24孔板,细胞处理及分组同 2. 3 项。作用 24
h 后, 弃去培养基,用 PBS 洗 3 次后每孔加入 0. 5
mL 细胞裂解液,待细胞充分裂解后, 参照 MDA 检
测试剂盒说明书测定细胞 MDA 含量。细胞蛋白质
定量采用 Low ry 法。
2. 5 细胞凋亡的检测
2. 5. 1 Hoechst 33258 荧光染色法观察细胞核形
态变化: ECV304 细胞以 1×105 / mL 接种于直径为
35 mm 培养皿中,细胞处理及分组同 2. 2 项。作用
24 h 后,细胞用预冷 PBS 洗 3次, 4% 预冷多聚甲
醛室温固定 30 min 并轻微搅拌,预冷 PBS 洗 3 次
后用终浓度为 2. 5 g/ mL 的 DNA 染料 Hoechst
33258 室温避光染色 5 m in, PBS 洗 3 次后于荧光
显微镜下 (激发光波长 340 nm) 观察并拍照。每个
培养皿任选 10 个视野计数固缩核和细胞核总数来
计算细胞凋亡率。
细胞凋亡率= 固缩核数/细胞核总数×100%
2. 5. 2 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 降解:
ECV304 细胞以 1×106 / mL 接种于 50 mL 培养瓶
中,细胞处理及分组同 2. 2 项。收集作用 24 h 后的
各组细胞, 参照文献 [ 6]方法提取 DNA, 加 T E 缓冲
液充分溶解后在 1. 5% 琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙
锭染色后于紫外灯下观察并拍照。
2. 6 统计学分析: 实验结果以 x±s表示,采用方差
分析和 t 检验判定差异显著性。
3 结果
3. 1 T MP 对正常及 AA 损伤 ECV304 细胞存活
率的影响: 与正常对照组比较, 各浓度 T MP 对
ECV304 细胞的 A 570nm值无显著影响 ( P> 0. 05) :
160 mol/ L A A 处理的细胞 A 570nm值明显低于正常
对照组 ( P< 0. 01) ;而 T MP ( 0. 25～1. 00 mmo l/ L )
可浓度依赖性地减轻 AA 引起的 A 570 nm值的下降
( P< 0. 05)。结果见表 1。
表 1 TMP 对 ECV304 细胞存活率的影响 ( x±s, n= 6)
Table 1 Effect of TMP on viability
of ECV304 cells ( x±s, n= 6)
组 别 AA
/ ( mol·L- 1)
T MP
/ ( mm ol·L- 1) A 570 nm
正常对照 0 0 0. 85±0. 06
AA 损伤 160 0 0. 42±0. 11* *
TMP 0 0. 25 0. 83±0. 09
0 0. 50 0. 79±0. 16
0 1. 00 0. 80±0. 14
TMP 保护 160 0. 25 0. 56±0. 08* * △
160 0. 50 0. 61±0. 11* △
160 1. 00 0. 69±0. 18* △
与正常组比较: * P < 0. 05 * * P < 0. 01
与 AA 损伤组比较: △P < 0. 05
* P < 0. 05 * * P < 0. 01 v s n or mal gr ou p
△P < 0. 05 v s AA injured group
·178· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 2 期 2004年 2月
3. 2 T MP 对 AA 损伤的 ECV 304 细胞释放 LDH
和细胞 MDA 含量的影响: 160 mo l/ L AA 处理的
细胞的 LDH 释放率和细胞 MDA 含量显著高于正
常对照组 ( P< 0. 01) ; T MP ( 0. 25～1. 0 mmol/ L )
可部分抑制 AA 引起的 LDH 释放率和细胞 MDA
含量增加 ( P< 0. 05)。结果见表 2。
表 2 TMP 对 ECV304 细胞释放 LDH 和细胞
MDA 含量的影响 ( x±s, n= 3)
Table 2 Ef fect of TMP on release of LDH and MDA
content of ECV304 cells ( x±s, n= 3)
组 别 TM P
/ ( mmol·L- 1)
LDH 释放率
/ %
细胞 MDA 含量
/ ( mol·g- 1)
正常对照 0 18. 4±2. 6 1. 95±0. 08
AA 损伤 0 66. 4±5. 8* * 3. 48±0. 12* *
TM P 0. 25 18. 2±2. 3 1. 97±0. 13
0. 50 17. 9±2. 8 1. 93±0. 07
1. 00 18. 5±3. 1 1. 89±0. 09
TM P 保护 0. 25 52. 3±4. 5* * △ 3. 12±0. 06* * △
0. 50 46. 8±8. 6* △ 2. 91±0. 15* △
1. 00 40. 2±5. 1* △△ 2. 59±0. 17* △△
与正常对照组比较: * P< 0. 05 * * P < 0. 01
与 AA 损伤组比较: △P < 0. 05 △△P < 0. 01
* P < 0. 05 * * P< 0. 01 v s normal group
△P < 0. 05 △△P< 0. 01 v s AA injured gr ou p
3. 3 T MP 对 AA 诱导 ECV304细胞凋亡的影响
3. 3. 1 Hoechst 33258 染色检测细胞凋亡率:细胞
经 Hoechst 33258 染色后,正常对照组细胞核较大
且染色均匀; 160 mol/ L A A 处理 24 h 后的
ECV304 细胞核内可见浓染致密的颗粒状荧光,呈
现出凋亡细胞典型的核固缩、核碎裂表现, 其细胞凋
亡率为 56. 3%; TMP 保护组细胞核形态趋于正常,
0. 25, 0. 50, 1. 00 mmol/ L TMP 能使细胞凋亡率分
别降至 49. 6%, 44. 8% , 39. 4%。
3. 3. 2 DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱: 160 mo l/ L
AA 处理 24 h 后的 ECV304 细胞可观察到典型的
凋亡阶梯状 DNA 区带图谱 ( DNA ladder) ;正常对
照组细胞 DNA 未出现类似改变; 1. 0 mmol / L
TMP 保护组的 DNA 梯状条带变浅,介于正常组与
AA 损伤组之间,见图 1。
4 讨论
AA 是一种多不饱和脂肪酸, 通常以酯化的形
式存在于膜磷脂的 sn-2 位上。细胞受到外界刺激
时, 通过活化磷脂酶 A 2水解膜磷脂而释放游离
AA
[ 2]。AA 在脂加氧酶 ( LPO) 的催化下生成脂质
过氧化物 ( LOOH) , LOOH 可分解为包括 MDA 在
内的多种细胞毒性终产物; 此外, LOO·还可通过
环氧化作用进一步攻击蛋白质、核酸和具有双键的
1-DNA ladder 2-正常对照组细胞 3-160 m ol / L AA 损伤
组细胞 4-1. 0 mm ol/ L TMP 预保护组细胞
1-DNA ladder 2-normal cell s 3-cell s t reated w ith 160
mol /L AA 4-cell s pret reated w ith 1. 0 mmol/ L T MP
图 1 DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig. 1 Agarose gel electro-phoresis of DNA
不饱和化合物, 同时产生更多的自由基[ 7]。因而, 脂
质过氧化是 AA 发挥其细胞毒和致凋亡作用的重
要机制之一 [ 2～4, 6]。本实验结果显示,经 160 mol/ L
AA 处理的 ECV304细胞的 MDA 含量较正常组细
胞显著增加, 表明 AA 损伤 ECV304 细胞及其致凋
亡效应与其促进细胞脂质过氧化作用密切相关。
T MP 是从中药川芎中提取的有效生物碱四甲
基吡嗪。研究表明 TMP 能清除氧自由基, 拮抗
H 2O 2引起的血管内皮细胞氧化损伤[ 8]。本实验为研
究 T MP 能否拮抗 AA 对内皮细胞的损伤,在加 AA
前 3 h, 先加入 TMP 进行预保护。实验结果显示,
T M P 能浓度依赖性地抑制 AA 引起的细胞存活率
降低、LDH 释放增加及 ECV304 细胞凋亡。文献报
道 T MP 能促进正常血管内皮细胞增殖[ 8] ,因此, 本
实验也检测了 TMP 对正常 ECV 304 细胞增殖的影
响,结果表明 TMP 对正常 ECV 304细胞的A 570值无
明显影响,提示其未影响 ECV304 细胞的生长和增
殖, 从而排除因 T MP 促进 ECV 304 细胞增殖而造
成其抗凋亡假象的可能。本实验首次发现 TMP 在一
定程度上能拮抗 AA 致血管内皮细胞凋亡, 为该药
临床用于 AS 治疗提供有益的实验依据。文献报道
T MP 能通过增加 SOD 活性, 减轻脂质过氧化损伤
来抑制细胞凋亡[ 5]。本实验也发现,随着 T MP 浓度
的增加, AA 所致的 ECV304 细胞 MDA 生成量也
相应减少, 与其相应浓度下抑制 A 570值下降、LDH 释
放率增加及凋亡率等变化相一致,提示 TMP 抗 AA
诱导 ECV304 细胞凋亡可能与其抗脂质过氧化作用
有关,但其详细机制还有待进一步研究。
·179·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 2 期 2004年 2月
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复方决明提取物的降压作用机制研究
陈素红1 ,吕圭源2 ,施 斌3,李万里2,张丽英2
( 1. 上海中医药大学,上海 210032; 2. 浙江中医学院, 浙江 杭州 310053; 3. 复旦大学药学院, 上海 210032)
摘 要: 目的 探讨复方决明提取物抗高血压的作用机制。方法 放射免疫分析法测定自发性高血压大鼠 ( SHR)
血浆中血管紧张素Ⅱ ( ANGⅡ) 和肾素活性 ( RA )、内皮素 ( ET )、心钠素 ( ANP )、醛固酮 ( ALD ) 等血压相关物质
的含量, 利尿实验测定尿量。结果 不同剂量的复方决明提取物均能降低 SHR 大鼠血浆的 ANGⅡ 含量和 RA,但
对 ALD , ET , ANP 及尿量均无影响。结论 复方决明提取物的降压作用与降低肾素-血管紧张素有关, 而与 ALD ,
ET , ANP 及尿量无明显关系。
关键词: 复方决明提取物; 高血压; 血管紧张素Ⅱ; 肾素活性; 醛固酮; 心钠素; 内皮素
中图分类号: R286. 24 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0180 03
Studies on mechanism of antihypertension effect of extracts from Compound Jueming
CHEN Su-hong
1
, LU
¨ Gui-yuan2, SHI Bin3 , L I Wan-li2, ZHANG Li-ying2
( 1. Shangha i Univ ersity of T radit ional Chinese M edicine, Shanghai 210032, China ; 2. Zhejiang Colleg e of T radit ional
Chinese Medicine, Hang zhou 310053, China ; 3. Colleg e of Pharmacy , Fudan Univ ersity , Shanghai 210032, China)
Abstract: Object T o probe into the ant ihypertension activity mechanism of ex tr acts f rom Compound
Jueming ( CJ) . Methods T he method of radio immunoassay w as used to assay the concentrat ion of the re-
lated substances on spontaneously hypertensiv e rats ( SHR) such as angiotensin Ⅱ ( ANGⅡ) , renin act ivi-
ty ( RA) , endothelin ( ET ) , at rial natr iuret ic polypept ide ( ANP) , aldosterone ( ALD) , and urine. Results
All of the three doses ( 9. 5, 7. 2, and 4. 8 g / kg) o f ex tr acts f rom CJ reduced A NG Ⅱ and RA , but had no
inf luence on ALD, ET, ANP, and urine in SHR. Conclusion The antihypertension ef fect of ext racts
fr om CJ is related to decr easing of renin-angiotensin, but not to ALD, ET , ANP, and ur ine.
Key words: ext racts f rom Compound Jueming ( CJ) ; hypertension; ang io tensin Ⅱ ( ANG Ⅱ) ; renin
act ivity ( RA) ; aldosterone ( ALD) ; at rial nat riur et ic polypeptide ( ANP) ; endo thelin ( ET )
复方决明提取物是对具有降压作用的中药经动
物实验筛选, 按照中医药理论以决明子为主进行组
方,用现代提取工艺制得。本研究在药效实验的基础
上, 通过测定血浆中血管紧张素Ⅱ ( ANGⅡ) 和肾
素活性 ( RA )、内皮素 ( ET )、心钠素 ( ANP)、醛固
酮 ( ALD) 等血压相关物质的含量及尿量, 探讨复
·180· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 35 卷第 2 期 2004年 2月
收稿日期: 2003-07-18基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39470860)作者简介:陈素红( 1973—) ,女,浙江金华人,主管药师, 浙江中医学院中药学硕士毕业, 2001年考入上海中医药大学攻读中药学博士学位,现主要参与国家十五重大科技专项 (863计划, 2003AA2Z3254)、教育部重点项目 ( 2000176) 及浙江省自然科学基金重大项目等课题的研究,从事心血管中药药理研究及中药新产品开发。Tel: ( 0571) 86613601 E-mail: ch ensuhong@ x263. net