全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 841·
CCI。损伤后，培养液中的AI，T和AST活性显著升
高，细胞增殖活性明显降低，FACS明显降低肝细胞
ALT和AST活性，显著促进肝细胞增殖，具有促
进体外培养肝细胞生长的作用，从细胞水平证实了
FACs对肝细胞的保护作用。
RefeFellce$!
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麻黄汤对大鼠大脑额叶皮层氨基酸类神经递质水平的影响
魏凤环，罗佳波+，谭晓梅，贺丰
(南方医科大学中医药学院．广东广州 510515)
摘要：目的研究麻黄汤(HED)对大鼠额叶皮层中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和7一氨基丁
酸(GABA)等氨基酸类神经递质水平的影响，及其量效和时效关系。方法2，4-二硝基氟苯为衍生化试剂，HPI，C—
uV法测定大鼠额叶皮层中氨基酸水平。结果给药5d，HEDl5、18g／kg剂量组Asp、Glu和GABA水平与空白
对照组相比有显著性升高，Gly无显著性改变。4种氨基酸均在ig5d时，与空白对照组相比有显著性升高。结论
HED显著升高了大鼠额叶皮层中氨基酸水平，并呈现一定的量效、时效关系。在试验剂量范围内15g／kg是较敏感
的剂量{给药5d是最佳时间。
美键词：麻黄汤l氨基酸l量效关系
中圈分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12—1841—04
EffectofHerbaEphedraeDecoctiononlevelsofaminoacidneurotransmitters
inprefrontalcortexofrats
WE／Feng—huan，LUOJia—bo，TANXiao—mei，HEFeng
(SchoolfTraditionalChineseMedicine，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China)
Keywords：HerbaEphedraeDecoction(HED)；aminoacid dose—effectrelationship
麻黄汤(HerbaEphedraeDeeoction，HED)由
麻黄配伍桂枝、杏仁、炙甘草组成。具有发汗解表、宣
肺平喘的功效。现代研究表明，麻黄中的主要活性成
分左旋麻黄碱和右旋伪麻黄碱具有增强小鼠自主活
动、升高动脉血压、增加心率、导致神经变性等不良
反应[1“]，在临床应用中体现的是产生失眠．震颤、
心悸等。有学者认为麻黄碱致神经变性的原因，可能
与谷氨酸(glutamicc d，Glu)的过量释放有关“J。
Gtu和天冬氨酸(asparticacid，Asp)是脑部重要
的兴奋性神经递质，7一氨基丁酸(7一aminobutyric，
GABA)及甘氨酸(glycin，Gly)是脑部重要的抑
制性神经递质。本实验根据HED中主要成分所产
生的上述中枢神经系统的不良反应，及脑组织中氨
基酸类神经递质的性能，研究了HED对大鼠大脑
皮质额叶中氨基酸水平的影响。
1材料
1．1 动物与试药：SPF级Wistar大鼠，体重为
(2l5±15)g，雌雄兼用，由南方医科大学实验动物
中心提供。麻黄汤参考文献方法制备o]，浓缩至含麻
黄生药1．5g／mL，作为麻黄汤储备液。氨基酸对照
品均购自Sigma公司}2，4-二硝基氟苯(DNFB，日
本)；乙腈、甲醇为色谱纯(Merck，德国)；醋酸钠、
冰醋酸等试剂均为国产分析纯。
1．2仪器：HP一1100高效液相色谱仪(美国安捷
鉴銎最省；留蒙省蔡警学基金重点资助项目(。。。。。。；。)
尊翥帮雍挚罨蕹装76名：毫蛊：≯涂；甓志生翌臻穿f譬邕#翌嚣蔓篓尊及中药新药的研究开发。E。“i“8””8486@”h⋯
万方数据
·1842· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
伦)，ODSC18(250mm×4．6mm，i0”m，中国科学
院大连化学物理研究所)，UV检测器；Sonicator
XL2020细胞超声粉碎仪(美国)；Beckmanj221低
温高速离心机(美国)；410A型pH计(美国ORI—
ON)；DenverAB250D分析天平(美国)；Eppendorf
定量移液器(德国)。
2方法与结果
2．1 HED对大鼠额叶皮层氨基酸水平影响的量效
关系：取大鼠42只，雌雄各半，随机分为7组，每组
6只。给药组剂量以麻黄生药计分别是6、9、12、15、
18、24g／kg(按16mL／kg分别稀释麻黄汤储备
液)，ig给药，对照组ig等体积水。连续给药5d，在
末次给药1h后，处死动物，快速断头，在冰台上快
速剥离脑，取两侧额叶并快速称重，迅速放于冰
箱一20℃保存。
2．2 HED对大鼠额叶皮层氨基酸水平影响的时效
关系：取大鼠48只，雌雄各半，随机分为8组，每组
6只。由量效关系试验结果选取在该剂量范围内最
佳剂量，分别ig给药1、3、5、7、9d，同时分别设有对
照组，ig等体积水，于末次给药lh后处死动物，同
上法操作。
2．3对照品溶液的制备：精密称取Asp6．38mg、
Glu17．64mg、Gly2．40mg、GABA4．94mg，置10
mI，量瓶中，0．1mmol／L盐酸稀释至刻度，即得混
合对照品储备液。
2．4 样品溶液的制备：取大鼠大脑额叶样品，加
0．1mmol／L稀盐酸(1：5)，超声粉碎(温度：4uc；
间隔：运行2S、停5s；强度：20％，共15次)。4℃、
12000r／min离心10min，取上清液200pL，加入
0．1mol／I．NaHC03100pL和2，4一二硝基氟苯衍
生化试剂20pL，涡旋混匀，置60℃水浴60min，
加入0．1mmol／L磷酸盐缓冲液稀释至1mL口]，混
合后12000r／rain高速离心10min，取上清液，用
0．45pm滤膜滤过，待测。
2．5色谱条件：色谱柱ODSC，。(250mm×4．6
mm，10肛m)，流动相：乙睛(A)和0．1tool／L醋酸
钠(冰醋酸调pH6．40)(B)，梯度洗脱(表1)，波长
360nm，柱温21℃，进样量5“L，运行26min。
2．6标准曲线的制备：取混合对照品储备液递次稀
释，分别得Asp：0．06、0．12、0．24、0．48、0．96pmol／
mL；Glu：0．15、0．30、0．60、1．20、2．40／1mol／mI。；
Gly：0．04、0．08、0．16、0．32、0．64pmol／mL；
GABA：0．06、0．12、0．24、0．48、0．96pmol／mL的
系列对照品溶液。依次取200”L对照品溶液，其余
表1梯度洗脱条件
Table1 Conditionsofgradientelation
同2．4项：“加入0．1mol／LNaHC031 0pL⋯⋯用
0．45pm滤膜滤过”操作，按照2．5项色谱条件测
定，色谱图见图1。以浓度(x)对应峰面积(y)进
行回归，分别得如下线性关系。Asp：Y一13 7．8x+
16．792(r一0．9994)，线性范围：0．06～0．96>tool／
mL；Glu：Y一1244．8X+18．5(r一0．9998)，线
性范围：0．15～2．40pmol／mI。；Gly：Y一1934．7
x+0．5833(r一0．999)，线性范围：0．04～0．64
bemol／mL；GABA：Y=1205．3X+23．833(，一
0．9992)，线性范围：0．06～0．96pmol／mL。
ii6i
5 10 15 20
f，mln
5 10 15 20
A对照品B一样品 1一Asp2-Glu3-Gly4GABA
A—ref『erencesubst一⋯Bsample
1一Asp2-Glu3Gly4GABA
圈l Asp、Glu、Gly、GABA高效液相色谱图
Fig．1HPLCchromatogramsofAsp,Glu，Gly，andGABA
2．7加样回收率试验：把对照组剩余的匀浆液混
匀，取出9份，每份200pL，分成3组，分别加高、
中、低3种质量浓度的混合对照品液各20pI。。按照
2．4项下“加入0．1mol／LNaHC03100pL⋯⋯用
0．45“m滤膜滤过”操作，按照2．5项下色谱条件测
定。结果低、中，高3种质量浓度的回收率Asp；
92．7％～99．8％，RSD=3．46％；Glu：90．5％～
102．6％，RSD=2．59％；Gly：89．3％～96．5％，
RSD=3．79％；GABA：94．7％～106．7％，RSD一
3．79％。
2．8精密度试验：取对照组样品一份，12h内连续
测定4次，采用标准曲线法测定浓度，得氨基酸样
品的日内RSD，Asp：RSD一1．58％；Olu：RSD一
2．68％；Gly：RSD一1．23％；GABA：RSD一
2．03％。取对照组样品一份，72h内连续测定4次，
用随行标准曲线进行分析，得氨基酸样品的H间
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 843·
RSD。Asp：RSD=3．08％；Glu：RSD一4．05％；
Gly：RsD一3．13oA；GABA：RSD一2．03％。
2．9重现性试验：将各组剩余匀浆液上清液混合，
取出5份，分别按照样品处理方法进行处理、分析。
测得各氨基酸浓度，Asp：6．23gmol／mL，RSD一
2．04％；Glu：15．60pmol／mL，RSD一1．64％；
Gly：7．34tLmol／mL，RSD=1．64％；GABA：7．46
Ftmol／mL，RSD=3．08％。
2．10样品测定：将2．1项和2．2项得到的匀浆样
品按照2 4项方法处理，按照2．5项色谱条件测
定，色谱图见图1。
量效结果表明，将相邻剂量组结果分别进行t
检验，其中15g／kg剂量组与相邻的两个剂量组
12、18g／kg均有统计学差别(P
说明15g／kg是使兴奋性氨基酸水平变化较敏感的
剂量组，为迸一步开展时效试验提供了最佳给药剂
量。见表2。
衰2 HED不同给药剂量对氯基酸类神经递质的影响(i士s，n=6)
Table2 EffectsofHEDindifferentdosesonaminoacidneurotransmltters(；土s，／t--6)
与HED0g／kg组(对照)比较：6P<0．05l与HEDl5g／kg组比较：。P
衰3 HED不同给药时间对氨基酸类神经递质的影响“士j，n一6)
Tahie3 EffectsofHEDatdlfferentadministrationtimeonamllloacidneurotransmltters(；土，，=6)
与相同时间对照组比较{Ap<0·05}与给药5d时HED组比较：’P<0·05aP<0⋯05controlgroupatsametime；。P
3．1本实验首次从氨基酸神经递质这个层面上研 的机制之一。其机制是由于促进氨基酸的合成、释
究了HED对中枢神经系统的影响。4种氨基酸衍生放，还是抑制了神经末梢的胶质细胞上高亲和性摄
化产物的分离，采用等度洗脱，无法使Gly和GA一取系统的重要摄取功能，有待进一步研究。
BA与前后干扰色谱峰达到基线分离，本实验的梯 3．3量效关系表明，HED使健康大鼠兴奋性神经
度洗脱能使4种氨基酸快速达到基线分离。 递质升高是有限度的；其中抑制性氨基酸升高可能
3．2分离结果表明，在一定的剂量范围内HED能是健康动物一种自我调节、自我保护的应激反应。
显著升高大鼠额叶兴奋性氨基酸的水平；结合以前 3．4从药效学角度研究方剂的配伍给药量和给药
的实验：即HED能增加小鼠自主活动的作用，推测 时间是非常关键的环节，如果选择不当可能易导致
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
假阳性或假阴性结果的产生。尤其在量效关系中应
该选取呈现线性关系剂量范围内敏感度最大的剂量
(即减少或增加给药都会使效应指标有统计学改
变)。本实验为下一步研究HED配伍应选用的给药
时间和给药剂量提供了参考。
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抗癫痫肽重组腺伴病毒载体的构建及鉴定
王宗仁1，邵中军2“，李晶华1，行利1，马静1，龙锢1，张磊2，赵艳玲1
(1．第四军医大学附属西京医院中医科，陕西西安710032；2．第四军医大学流行病学教研室
陕西西安7]0032；3．复旦大学公共卫生学院流行病教研室，上海200023)
摘要：目的为了研究蝎毒癫痈肽对癫痈模型的治疗作用，构建并产生重组腺伴病毒(AAV)载体。方法将
AEP外源性核酸片段插人AAV—shufer质粒pSSHG—Neo的KpnI—BamHI位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒
pFGl40、包装质粒pAAV／Ad及构建的pSSHG—AEP三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎293细胞系中同源重组包
装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果成功构建了重组病毒质粒pSSHG／AEP，经
蔗糖梯度离心法获得rAAV组分。梯度稀释测得滴度为1．46×10”PFU／mL。结论成功地制备了AEP重组腺伴
随病毒(rAAV／AEP)载体，为癫痈基因治疗实验奠定了基础。
关键词：抗癫痫肽；腺伴病毒载体；构建
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12—1844—03
Constructionandide tificationofrecombinantadeno—associatedvirus
transducingantiepi|epsypeptidegene
WANGZong—renl，SHAOZhong—jun2，LIJing—hual，HANGLil，MAJin91，
LONGYinl．ZHANGLei2．ZHAOYan—lin91
(1．DepartmentofTraditionalChineseMedicine，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032
China；2．DepartmentofEpidemiology，theFourMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，Chinal3．Department
ofEpidemiology，SchoolofPublicHea th，FudanUniversity，Shanghai200023，China)
Keywords：antiepilepsypeptide；adeno—associatedvirus(AAV)；construction
中医采用全蝎治疗脑病已有近千年的历史E“。
本草记载全蝎具有镇痉、熄风的作用。抗癫痈肽
(antiepilepsypeptide，AEP)是从东亚钳蝎Buthus
martensilKarsch中分离出的一种多肽，由61个氨
基酸残基组成，相对分子质量为8300，属于蝎毒长
链神经毒素。近年研究显示其能降低实验动物癫痫
的发生率、延长癫痫发作的潜伏期、缩短癫痫发作的
持续时间‘“⋯，而且能抑制癫痫的反复发作‘“⋯。本研
究拟利用其生物学作用，为进一步尝试癫痫的基因
治疗奠定基础。
收稿日期：20050322
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30671764)
作者简介：王宗仁(1954)，男，河南灵宝人，主任医师，教授，博士生导师，发表文章60余篇．获陕西省科技进步二等奖和军队科技进步
二等奖各一项，主要研究方向为分子中药学和心血管疾病的中药防治。
Tel{(029)82376992Email：zoagren@fmmu．edu．ca
万方数据
麻黄汤对大鼠大脑额叶皮层氨基酸类神经递质水平的影响
作者： 魏凤环， 罗佳波， 谭晓梅， 贺丰， WEI Feng-huan， LUO Jia-bo， TAN Xiao-mei，
HE Feng
作者单位： 南方医科大学,中医药学院,广东,广州,510515
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 8次
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