全 文 :·药理与临床·
甲基莲心碱对有机磷酸酯抑制的小鼠脑胆碱酯酶的重活化作用
李新华1 ,张 红2,徐文炜2,熊玉卿2
( 1. 江西医学院 卫生科, 江西 南昌 330006; 2. 江西医学院临床药理研究所,江西 南昌 330006)
摘 要: 目的 研究甲基莲心碱 ( Nef) 对有机磷酸酯中毒小鼠脑胆碱酯酶 ( ChE) 的重活化效应。方法 采用微量
二巯基双硝基苯甲酸 ( DTNB) 法测定敌敌畏 ( DDVP) 体内、体外抑制小鼠脑 ChE 活力,观察 0. 001~0. 03 mg / L
DDVP 在体外对小鼠脑 ChE 活力的抑制作用,比较 Nef 和氯磷定体内、体外给药对 DDVP 中毒小鼠脑 ChE 的重
活化效应。结果 不同浓度的 DDVP 显著地抑制试管内小鼠脑 ChE 活力,呈现明确的量效关系, IC50为 0. 003 mg /
L。Nef ( 2. 4, 4. 8 mg / L ) 与氯磷定 ( 5, 12. 5 mg/ L ) 对 0. 02 mg / L DDVP 体外抑制的小鼠脑 ChE 重活化效应随着
浓度增高而加大。对 sc DDVP ( 10 mg / kg ) 的小鼠分别 ip Nef 或氯磷定,其脑 ChE 活率分别为 ( 41. 6±10. 9) %、
( 56. 5±12. 4) % ( Nef 15, 30 mg / kg ) 和 ( 24. 1±17. 4) %、( 28. 4±11. 9) % (氯磷定 25, 50 mg / kg ) , 两者相比差
异显著 (P < 0. 01)。结论 Nef 比氯磷定有更为显著的重活化 ChE 的作用,这与 Nef 能进入中枢复活脑中毒酶有关。
关键词: 甲基莲心碱; 有机磷酸酯; 胆碱酯酶; 酶重活化剂
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2004) 06 0651 03
Reactivation of neferine on mice brain cholinesterase inhibited by organophosphate
LI Xin-hua1 , ZHANG Hong2 , XU Wen-w ei2 , XIONG Yu-qing2
( 1. Depar tment o f Health; 2. Inst itute o f Clinical Pharmacolog y , Jiangx i M edical Colleg e, Nanchang 330006, China)
Abstract: Object T o study the react ivation of neferine ( Nef ) and pralido xime chlo ride ( 2-PAM·Cl)
on mice brain cholinest rase ( ChE ) inhibited by o rganophosphate. Methods M icr o-DT NB method w as
used to determine the ChE act ivity of m ice brain inhibited by DDV P in vi tro and in vivo, then the inhibitor y
effect o f DDVP ( 0. 001—0. 03 mg/ L ) on m ice brain ChE in vit ro was observed. T he react ivative ef fect of
Nef and 2-PAM·Cl on brain ChE of po isoned mice w ith DDVP in v ivo and in v itro was compared. Results
I n vit ro, the inhibitor y ef fect of DDVP at differ ent concentrat ions on mice brain ChE show ed a concen-
tr ation-effect relat ionship. The IC50 was 0. 003 mg / L . T he r eactivat ive effect of Nef ( 2. 4, 4. 8 mg / L ) and
2-PAM·Cl ( 5, 12. 5 mg / L ) on brain ChE inhibited by DDVP ( 0. 02 mg/ L ) enhanced w ith increasing
their concentrat ions. I n viv o, after 30 min of t reated w ith DDVP ( 10 mg / L , sc) , the mice w ere g iv en
( ip) w ith Nef ( 15, 30 mg/ kg ) o r 2-PAM·Cl ( 25, 50 mg/ kg ) , r espect ively. The ChE act iv ity rate in
these tw o t reated g roups w ere ( 41. 6±10. 9) % , ( 56. 5±12. 4) % and ( 24. 1±14. 3) % , ( 28. 4±11. 9)
% , respect ively. The dif ference betw een poisoned g roup ( sc DDVP) and Nef t reated g roup was significant
( P< 0. 01) , w her eas that betw een poisoned gr oup and 2-PAM·Cl t reated group w as not signif icant ( P>
0. 05) . Conclusion The results suggest that Nef have a mo re remarkable react ivat ive ef fect on inhibited
brain ChE in vitr o and in vivo than 2-PAM·Cl. T his may be contributed to that Nef can penet rate the
blood-brain barrier .
Key words : neferine ( Nef ) ; org anophosphate; cholinesterase ( ChE) ; enzyme react ivato rs
寻找重活化有机磷酸酯中毒的胆碱酯酶
( ChE) 的药物的工作是很有成效的。早在 20 世纪
50 年代就发现了含肟基的化合物能确切有效地重
活化中毒酶。几十年来,临床上常用的重活化药仍为
季胺吡啶醛肟类化合物[ 1] ,它们均不易穿透血脑屏
障,对脑 ChE 无明显重活化作用 [ 2] ,使中枢 ChE 严
重抑制的患者难以救治。甲基莲心碱 ( nefer ine,
Nef ) 是中药莲子心的有效成分, 属双苄基异喹啉类
生物碱, 研究发现 Nef 具有较强的重活化有机磷抑
制的 ChE 的作用[ 3]。本实验采用微量二巯基双硝基
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收稿日期: 2003-09-04基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30060092)作者简介:李新华( 1957—) ,男,江西省人,医学学士,副教授,副主任医师,主要研究方向为呼吸内科疾病的预防治疗与中枢药物作用及其机制。Tel: ( 0791) 6361537 Fax: ( 0791) 6360654 E-mail: LiXH@ pub lic. n c. jx. cn
苯甲酸 ( DT NB) 法, 分别于体外、体内用敌敌畏
( DDV P) 抑制小鼠脑 ChE 活性, 比较 Nef 和氯磷
定 ( 2-PAM·Cl) 对 DDVP 抑制的小鼠脑 ChE 的
复活作用,探求 Nef 对脑内中毒 ChE 的确切效应。
1 材料与方法
1. 1 实验动物: 昆明种健康小鼠, 雌雄兼用, 体重
( 20. 0±2. 0) g ,由江西医学院实验动物中心提供。
1. 2 仪器: 96 孔酶标板 (丹麦 NUNC ) , 550 型酶
标仪 (美国 Bio-Red Labor ator ies) , 高速冷冻离心
机 (美国 Beckman)。
1. 3 试剂与药品: DDVP (浙江兰溪农药厂,批号:
960306, 取 1. 5 mL 加 2. 0 mL 聚山梨醇酯 80 搅
匀,蒸馏水配成 10% 母液) ; Nef (含量: 92. 6% ,同
济医科大学药理教研室提供, 0. 1 mol / L 盐酸溶解
为 3% 溶液) ;毒扁豆碱 (美国 Fluka, 用 0. 1 mol / L
盐 酸溶解 ) ; 氯磷定 ( 上海淮海制药厂, 批号:
9990115) ; 以上母液均用生理盐水稀释。DT NB
( 0. 01 mol/ L 溶液)、碘化硫代乙酰胆碱 ( AT Ch,
0. 05 mol/ L 溶液) ,均为 Sigma 公司产品。
1. 4 脑 ChE 制备: 小鼠断头, 去头骨、脑膜和小脑。
取大脑并称质量, 以 10% 蔗糖液 ( 1∶9) 混合匀浆。
3 000 r/ m in 冷冻离心 10 min,取上清液冷藏备用。
1. 5 ChE 活性测定:微量 DTNB 法参照文献[ 4]进
行,在 96 孔酶标板内加入 0. 067 mol/ L 磷酸缓冲
液和 0. 05 mol / L AT Ch 各 30 L, 加入脑 ChE 备
用液 30 L, 37 ℃ 温箱中孵温 30 min, 加 1 mol / L
盐酸 10 L 终止反应, 加 0. 01 mo l/ L DT NB
200 L 显色,于 405 nm 波长测吸光度 ( A ) 值。
1. 6 体外实验: 取 0. 001, 0. 002, 0. 003, 0. 005,
0. 01, 0. 02, 0. 03 mg/ L DDVP 分别作用于小鼠脑
ChE ,每份设双管,重复测定 2 次。另取小鼠脑组织
直接测定 ChE 活力为正常酶活力。所得实验数据作
量效曲线图, 得出 DDVP 对脑 ChE 的 IC50及脑
ChE 抑制率 80% 以上的 DDVP 浓度。
在试管内加入脑 ChE 抑制率 80% 以上浓度的
DDVP, 作用于小鼠脑组织 10 min 后, 再分别加入
不同浓度的 Nef ( 2. 4, 4. 8 mg / L ) 或氯磷定 ( 5,
12. 5 mg / L ) , 重活化 30 min,测定 ChE 活力,并设
生理盐水 ( NS) 对照组(以生理盐水代替 DDVP)及
DDVP 对照组 (以生理盐水代替 Nef 或氯磷定)。
1. 7 体内实验:将小鼠随机分 6 组, 每组 8 只。其
中 4组小鼠 sc DDVP ( 1. 0 mg / kg) 中毒后,分别 ip
Nef ( 15, 30 mg / kg ) 或氯磷定 ( 25, 50 mg/ kg ) , 30
min 后处死,取脑制备脑 ChE,测定酶活力。另一组
sc DDVP 后 ip 等容的 NS 作为模型对照,余下一组
sc 和 ip 等容的 NS 作正常对照。
ChE 活率= 实验组酶活力/正常酶活力×100%
ChE 抑制率= (正常酶活力- 实验组酶活力) /正常酶
活力×100%
1. 8 数据处理:数据用 x±s 表示, 采用 t检验进行
统计分析。
2 结果
2. 1 DDVP 体外对小鼠脑组织 ChE 的抑制作用:
0. 001~0. 03 mg / L 的 DDVP 在试管内作用于小鼠
脑组织 ChE, 可显著抑制脑 ChE 活性,且呈量效关
系,见图 1。以 DDVP 浓度对数与 ChE 抑制百分率
作直线回归, 得出 DDVP 对 ChE 的 IC50为 0. 003
mg/ L。由图 1可得出 DDVP 抑制小鼠脑组织 ChE
80% 以上的浓度为 0. 02 mg / L。
图 1 DDVP 体外抑制小鼠脑 ChE 作用的量效曲线
Fig. 1 Curve of concentration-eff ect on mice brain
ChE inhibited by DDVP in vitro
2. 2 Nef 体外对 DDVP 抑制的脑 ChE 活性的影
响: 由图 2可见 2. 4, 4. 8 mg / L N ef 对 0. 02 mg/ L
DDVP 抑制的脑 ChE 有明显的重活化作用。Nef 与
氯磷定在复活效应相当时, Nef 浓度比氯磷定低。
2. 3 Nef体内对DDVP抑制的小鼠脑ChE的作
A-生理盐水 B-DDVP C, D-Nef ( 2. 4, 4. 8 m g/ L)
E , F-氯磷定 ( 5, 12. 5 mg/ L)
A-NS B-DDVP C , D-Nef ( 2. 4, 4. 8 mg/ L)
E, F-2-PAM·Cl ( 5, 12. 5 mg/ L)
与 DDVP 组比较: * * P < 0. 01
* * P < 0. 01 vs DDVP gr ou p
图 2 Nef 体外对 DDVP 抑制的小鼠脑 ChE 的重活化效应
Fig. 2 Reactivation of Nef on mice brain ChE
activity inhibited by DDVP in vitro
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用:结果见表 1。小鼠 sc DDVP 后脑 ChE 活力均显
著被抑制,但 Nef 能重活化被 DDVP 抑制的中毒小
鼠脑 ChE, 与模型组比较差异显著 ( P< 0. 01)。而
氯磷定对 DDVP 中毒的小鼠脑 ChE 未呈现复活效
应,即使加大其用量仍未出现激活现象,与模型组比
较差异无显著性 ( P> 0. 05) ,但与 Nef 低剂量组比
较差异显著 ( P< 0. 05)。
表 1 Nef 体内对 DDVP 抑制的小鼠脑
ChE 的重活化作用 ( x±s, n= 8)
Table 1 Reactivation of Nef on mice brain ChE activity
inhibited by DDVP in vivo ( x±s, n= 8)
组别 剂量/ (m g·kg- 1) C hE 活性/ %
正常 - 100. 0± 8. 0
模型 - 25. 7± 4. 6* *
Nef 15 41. 6±10. 9* * ▲▲
30 56. 5±12. 4* * ▲▲
氯磷定 25 24. 1±14. 7* * # #
50 28. 4±11. 9* * # #
与正常组比较: * * P < 0. 01; 与模型组比较: ▲▲P < 0. 01;
与 Nef ( 15 mg/ kg ) 组比较: # # P < 0. 01
* * P < 0. 01 vs normal g rou p; ▲▲P < 0. 01 vs model group ;
# # P< 0. 01 v s Nef ( 15 m g/ kg) group
2. 4 体外、体内实验结果比较: 由图 2和表 1结果
可见, Nef 与氯磷定体外均明显重活化脑 ChE, 两者
之间差异不显著 ( P> 0. 05) ,而在体内 Nef 与氯磷
定重活化脑 ChE 的作用却存在显著差异 ( P <
0. 01) , Nef 具有明显重活化作用。
3 讨论
呼吸衰竭导致窒息是有机磷酸酯中毒致死的第
一要素[ 5]。有机磷酸酯中毒时, 脑内 ChE 被严重控
制,中枢的乙酰胆碱 ( ACh) 积聚,激动呼吸中枢的
背侧呼吸细胞群 ( DRG) 和腹侧呼吸细胞群 VRG
的 M 受体, M 受体过度激动引起两细胞群节律性
传出冲动紊乱甚至停止,膈肌和肋间外肌就停止节
律性收缩,无法实现有效的吸气动作,出现窒息和呼
吸衰竭[ 6]。能进入中枢的 ChE 重活化药可纠正脑
ChE 抑制所造成的呼吸衰竭, 使被有机磷抑制的脑
内 ChE 恢复其水解 ACh 的活力,清除呼吸、循环中
枢突触间隙中蓄积的 ACh [ 7]。而临床上有确切疗效
的肟类重活化药均为季胺或双季胺吡啶醛肟基化合
物,季胺盐结构特性决定它们难以通过血脑屏障,不
进入中枢中进入脑内甚少,故对呼吸和循环中枢的
磷酰化 ChE 没有重活化作用[ 8]。本实验表明, ip Nef
对 DDVP 中毒小鼠脑 ChE 有重活化效应, 且随着
剂量的增加, 对脑磷酰化 ChE 重活化作用明显增
强。而 ip 50 mg/ kg 氯磷定解救中毒小鼠时, 其脑
ChE 活率仅为 28. 4%, 与模型组相比差异不显著
( P> 0. 05) ,与其体外重活化作用差异显著。这种差
异性的存在可能是由于氯磷定分子结构中具有季胺
基团,不易穿过血脑屏障而进入中枢所致。Nef 在解
救有机磷中毒过程中显现出比经典的氯磷定更强的
重活化 ChE 作用, 其原因可能与 Nef 能进入中枢重
活化脑内 ChE、迅速清除或改善呼吸和循环中枢内
积聚的 A Ch、恢复中枢正常的生理功能密切相关。
重活化药作用于磷酰化酶使之脱磷酰基的作用
是符合质量作用定律,有效的重活化基团愈多,则单
位时间内可重活化更多的中毒酶分子, 复活作用就
愈强[ 9]。本研究结果表明 DDVP 对小鼠脑 ChE 的
抑制作用是随着剂量的增大而显著加强的, Nef 与
氯磷定在体外对 DDVP 抑制 80% 以上的脑中毒酶
呈现显著地重活化作用。两者等效应时, Nef 剂量约
为氯磷定的 1/ 2, 可见 N ef 重活化脑中毒酶的作用
比氯磷定强,与前期研究结果也相吻合[ 3] ,依据质量
作用定律,这提示 Nef 结构上可能具有比氯磷定更
多的效应基团, 值得进一步研究。
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更 正:本刊 2004年第 5期第 529页刊“HPLC 法测定复方五味子软胶囊中五味子甲素
的含量”一文的作者单位应为“深圳市宝安区人民医院”, 特此更正。
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