全 文 ：后的共有峰。 该峰是原儿茶醛 ,对应的保留时间为
33. 71 min ( RSD= 1. 5% )。因此 ,宜将丹参水溶性
成分 HPLC指纹图谱分为两个区:从开始到保留时
间 33. 71 min的区域称为非指纹区 ; 33. 17～ 80 min
之间的区域称为指纹区。指纹区具有鉴别功能和半
定量功能 ,而非指纹区主要用于半定量。这一分区的
重要性在于简化繁杂的指纹图谱识别程式 ,同时利
于中药材有效成分的特征鉴别。
利用上述技术对从四川中江 GAP丹参基地所
取的 246个样品进行了研究。结果表明:对 46个不
同部位样品识别准确率为 99% ,对 200个不同等级
丹参识别准确率为 98. 5% 。 而对 38个不同来源的
丹参及伪品能全部鉴别出来。而条形码中指纹区和
非指纹区的划分可简化图谱识别程式 ,从而为丹参
的真伪优劣和品质评价提供特征性方法。 但本文只
是初步的结果 ,特别是对于不同等级样品间的比较
结果还有待大量样品的实践验证。
3　结论
3. 1　本实验所建立的丹参水溶性成分 HPLC指纹
图谱有较高的稳定性、精密度和良好的重现性。
290～ 300 nm波长的指纹图谱能反映较多的指标成
分信息量。其中含量 18个共有指纹峰 ,其相对保留
时间的 RSD < 1. 18% ,主要峰面积 RSD < 25%。能
用于直接评价不同产地丹参的质量。
3. 2　用归一化数学法处理 HPLC指纹图谱得到不
同类别丹参的典型指纹条形码图。该图简单明了 ,能
直观快捷地对不同等级和质量的丹参做出评价 ,并
对不同来源及真伪丹参做出准确鉴别。
3. 3　指纹条形码中指纹区和非指纹区的划分可简
划图谱识别程式 ,从而为丹参的真伪优劣和品质评
价提供特征性方法。
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野葛幼叶细胞悬浮培养生产葛根素等异黄酮类化合物的研究
张春荣 1, 2 ,李　玲 1
( 1. 华南师范大学生命科学学院 ,广东 广州　 510631;　 2. 中山大学生命科学学院 ,广东 广州　 510275)
摘　要: 目的　建立野葛幼叶细胞悬浮培养体系。方法　将由野葛幼叶外植体诱导的愈伤组织进行悬浮培养 ,研究
了悬浮培养物生长的动态和葛根素及总异黄酮类化合物产量积累的动态。 结果　细胞在培养的第 1～ 5天为对数
生长期 ,第 8天时细胞干重达最大值。 葛根素的合成与细胞生长呈紧密偶联型 ,在第 8天时葛根素产量达最大值。
总异黄酮类化合物的积累与葛根素积累存在一定差异 ,异黄酮类化合物的总产量在第 10天最大值。结论　野葛幼
叶细胞悬浮培养体系中总异黄酮类化合物的产量高于野生原植株 ,葛根素产量低于野生原植株。
关键词: 野葛 ;悬浮培养 ;葛根素 ;异黄酮类化合物
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0653 05
·653·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-11-18基金项目: 1999年教育部优秀青年教师项目 ( 003062) ;广东省科技计划项目 ( C11703)作者简介:张春荣 ( 1976- ) ,男 ,山东淄博人 ,中山大学在读博士研究生 ,研究方向为植物发育及分子生物学。
E-mai l: zhangchun r@ eyou. com
* 通讯作者　 Tel: ( 020) 85211378　 E-mai l: bioliling@ eyou. com
Production of puerarin and other isoflavones in cell suspension cultures
in leaves of Pueraria lobata seedling
ZHANG Chun-rong1, 2 , L I Ling1
( 1. Co llege o f Life Science, South China Normal Univ e rsity , Guang zhou 510631, China;
2. Co lleg e of Life Science, Sun Ya t-sen Univ ersity , Guang zhou 510275, China)
Abstract: Object　 To establish cell suspension culture system in leaves o f seedling of Pueraria lobata
( Willd. ) Ohw i. Methods　 The cal lus induced from leaf explants of P . lobata seedling w ere suspended in
liquid medium. The time courses o f cel l g row th and yields of puerarin and isof lav ones w ere studied. Re-
sults　 The log phase of the cell cultures g row th w as f rom 1st d through 5th d. The dry w eigh t accumula-
tion reached highest on 8th d. The production of puera rin w as highly coupled wi th the cell g row th. The
yield of puera rin reached highest on 8th d. How ever, the accumulation of total i sof lav ones w as dif ferent
f rom that of puerarin. The yield of total isoflaones reached the highest on 10th d. Conclusion　 The yield
o f tota l iso flavones in cell suspension cul ture system is higher than that in wild plants, while the yield of
puera rin is low er than tha t in wild plants.
Key words: Pueraria lobata (Willd. ) Ohwi; suspension cul ture; puerarin; isof lav ones
　　野葛 Pueraria lobata ( Willd. ) Ohw i为葛属
Pueraria DC.多年生草质藤本植物 ,是我国及东亚国
家传统的药食两用资源。其有效成分主要是葛根素、
大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物 ,在临床上广泛
用于治疗高血压、冠心病、心绞痛、心率不齐、视网膜
血管阻塞、突发性耳聋以及伤寒、温热头痛、烦热消
渴、泄泻、痢疾、癍疹不透等疾病 [1 ]。 植物细胞工程是
可持续性开发利用植物资源的重要措施。本实验室已
经建立了野葛愈伤组织诱导 [2 ]和子叶细胞悬浮培养
体系 ,结果表明 ,培养物中葛根素等异黄酮类化合物
的含量低于野生原植物株 [ 3]。本实验以野葛幼叶为材
料建立了细胞悬浮培养体系 ,研究了葛根素及总异黄
酮类化合物积累的动力学过程 ,旨在为野葛细胞工程
生产葛根素等异黄酮类化合物奠定基础。
1　材料和方法
1. 1　材料:刚成熟的野葛绿色荚果 ,采自华南师范大学
生物园 ,经常规表面消毒 ,取出种子进行萌发。无菌苗去
除根部 ,接入 MS固体培养基 ,于温度 ( 25± 2)℃、光照
度 2 000～ 2 500 lx、光照 12 h /d条件下培养。
1. 2　悬浮细胞培养体系的建立: 无菌苗长出 4～ 5
片真叶后 ,剪取幼叶 ,接入含 1 mg /L N AA, 2 mg /L
BA, 30 g /L蔗糖的 MS固体培养基 (简写为 MS+
NAA1+ BA2 )上诱导愈伤组织。愈伤组织在含 0. 5
mg /L 4-PU, 30 g /L蔗糖的 MS固体培养基上培养
(简写为 MS+ 4-PU0. 5 )。每 15 d继代一次。继代培
养若干次后 ( 6次以上 ) ,选取结构疏松、生长迅速的
淡黄色愈伤组织 ,接入含 1 mg /L 2, 4-D 1 mg /L
N AA 0. 5mg /L KT和 0. 2%水解酪蛋白 (casin hy-
dro lysa tes, CH) , 20 g /L蔗糖的 B5液体培养基 (简
写为 B5+ 2, 4-D1+ N AA1+ K T0. 5+ 0. 2% CH)中振
荡培养。每 250 mL三角瓶中装 45 mL培养液 ,接种
量约为 5. 0 g /L (条件培养液与新鲜培养液的比例
约为 1∶ 1) ,继代周期为 3 d。继代培养 4次后 ,接种
量改为 3. 5 g /L (条件培养液与新鲜培养液的比例
约为 1∶ 2) ,继代周期改为 5 d。悬浮培养条件:温度
( 25± 2) ℃、全天光照 ,光照度 500 lx ,转速 110～
130 r /min,振幅 2 cm。
1. 3　悬浮细胞生长的测定:细胞培养物继代后 ,每天
收集悬浮培养物 ,烘干后称量其干重 ( DW )。每次实
验取 4瓶 ,连续测定 12 d,试验重复 2次。细胞生长过
程的参数处理参照应佩清等 [5 ]和梅乐和等 [6 ]的方法:
细胞干重表示为 X ,生物浓度表示为CX= X /V,细胞
产率= (CXmax - CX0 ) /CXmax× 100% ,对数生长期内 ,
直线 ln (X /X 0 ) = μt的斜率表示细胞的比生长速度
μ,细胞的倍增时间 t ( d)= ( ln2) /μ。
1. 4　总异黄酮类化合物和葛根素含量的测定:参照
刘慧丽 [4 ]的方法。总异黄酮类化合物用 95%乙醇提
取 ,紫外分光光度法测定其含量。葛根素用无水乙醇
提取 ,高效液相色谱法测定其含量。
色谱条件: Beckman System Go ld高效液相色谱
仪 ( 125型 Solvent Module泵 , 168型 System Gold
M odel紫外检测器 ) ;大连 Elite Hypersil BDS C18色
谱柱 ( 5μm, 4. 6 mm× 250 mm);柱温: 25℃ ;柱压:
15. 2～ 19. 3 M Pa;流动相: 甲醇-水 ( 85∶ 15) ;流速
·654· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
1. 0 mL /min;检测波长: 248 nm;进样量: 20μL。
细胞培养物及培养液中葛根素或异黄酮类化合
物总产量 (Y总 )的计算: Y总 = Y胞×CX+ Y液。其中 ,Y胞
为细胞中次生代谢物的产量 ,单位为 mg /g ,CX为细
胞培养物的生物量 ,单位为 g /L, Y液 为培养液中次
生代谢物的产量 ,单位为 mg /L。
2　结果与分析
2. 1　野葛种子萌发及幼叶愈伤组织的诱导:刚成熟
的野葛种子萌发速度很快 ,培养至第 2天 , 18. 71%
的种子的下胚轴突破种皮 ,至第 12天 ,萌发率达
66. 08%并趋于恒定 (图 1)。
图 1　不同培养天数野葛种子的萌发率
　　 Fig. 1　 Germinat ion rate of P . lobata seeds
cultivated for diff erent days
野葛无菌苗幼叶外植体经 M S+ NAA1+ BA2
固体培养 , 7 d左右开始形成愈伤组织 ,愈伤组织在
黑暗或弱散光下培养呈淡黄色 ,结构疏松 ,生长较为
迅速 ,但用同种培养基继代时 ,愈伤组织表面易褐
化 ,转入 MS+ 4-PU0. 5培养基继代几天后 ,重新呈现
正常的淡黄色。
2. 2　野葛幼叶细胞悬浮培养体系的建立: 将结构疏
松、生长迅速的淡黄色愈伤组织接入液体培养基中 ,
经振荡培养 ,愈伤组织极易分散成较小的细胞团块。
植物悬浮细胞之间存在着协同作用 ,较大的起始接种
量 ( 5. 0 g /L)有利于愈伤组织适应液体悬浮培养条件
和保持细胞活力。 继代 4次后 ,愈伤组织逐渐成为较
小的细胞团块 ,并且适应了液体培养环境 ,这时就可
减少接种量 ( 3. 5 g /L ) ,并延长继代周期 ,以提高细胞
产率。 反复继代 8～ 10次以后 ,愈伤组织逐渐成为颗
粒均一、分散良好、生长迅速的悬浮培养体系。
细胞悬浮培养初期 ,培养物较少 ,较低的转速
( 110 r /min)即可使培养物全部悬浮起来 ,转速过高
( 140 r /min)反而增大了剪切力 ,容易伤害细胞 ;随
着培养时间的延长 ,细胞培养密度和培养液粘度增
大 ,培养液中氧的传输能力降低 ,这时 ,增加转速才
能使培养物全部悬浮 ,否则 ,细胞将因缺氧而过早进
入衰亡期。摇床转速的设定以刚好能将培养物全部
悬浮起来为宜。
2. 3　野葛悬浮细胞生长动态:野葛幼叶细胞悬浮培
养的生长曲线近为“ S”形 (图 2)。接种量为 3. 5 g /L
时 ,细胞生长的延滞期较短 ,约为 1 d。培养的第 1～
5天为对数生长期 ,细胞迅速增殖 ,比生长速度μ为
0. 27,细胞倍增时间 t ( d)= 2. 57 d- 1。第 5天后 ,细
胞生长速度减慢 ,但细胞干重仍在增加 ,至第 8天 ,
细胞干重达最大值 ,CXmax= 12. 58 mg /L ,细胞产率
为 72. 18% 。第 8天后 ,细胞生长进入稳定期 ,细胞
干重停止增加。
图 2　野葛幼叶细胞悬浮培养生长动力学曲线
　 Fig. 2　 Dynamic curve of dry weight accumulation
of cell suspension cultrues in leaves
of P . lobata seedling
2. 4　野葛悬浮细胞及培养液中总异黄酮和葛根素的
积累:图 3表明 ,野葛细胞接入新鲜培养液后 ,培养物
中葛根素含量随细胞生长增殖而不断积累 ,第 8天达
最大值 ,之后 ,细胞生长进入稳定期 ,葛根素含量逐渐
降低。培养液中葛根素含量的变化趋势与细胞中葛根
素的积累趋势相同 ,在第 8天达最大值。 8 d以后 ,随
着细胞中葛根素合成的停止 ,细胞和培养液中的葛根
素含量均下降。细胞和培养液中葛根素的总产量在第
8天时达最大值 ,为 103. 85 mg /L(图 4)。
图 3　野葛幼叶悬浮细胞及培养液中
葛根素积累的动力学曲线
Fig. 3　 Dynamic curve of puerarin contents
in cell suspension cultures or medium
in leaves of P . lobata seedling
　　野葛细胞接入新鲜培养液后 ,细胞内总异黄酮
类化合物随培养物生长量的增加而不断积累 ,细胞
进入稳定期后 ,总异黄酮类化合物的积累速度加快 ,
第 10天达到最大值 ( 129. 05 mg /g ) (图 5)。 10 d以
·655·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
后 ,细胞内总异黄酮类化合物的含量迅速降低。细胞
接入后 ,培养液中的总异黄酮类化合物的含量也逐
渐上升 ,这可能是细胞受新环境刺激的结果 ,直到第
5天细胞生长速度减慢后 ,培养液中总异黄酮类化
合物的含量才逐渐降低 (图 5)。 细胞及培养液中异
黄酮类化合物的总产量在第 10天时达最大值 ,为
1. 59 g /L (图 6)。
图 4　野葛幼叶悬浮细胞和培养液中葛根素总产量积累
的动力学曲线
　 Fig. 4　 Dynanmic curve of total yield of uerarin
in cell suspension cultures and medium
in leaves of P . lobata seedling
　图 5　野葛幼叶悬浮细胞及培养液中总异黄酮类
化合物积累的动力学曲线
　 Fig. 5　 Dynamic curve of total isof lavonces contents
in cell suspension cultures or medium
in leaves of P . lobata seedling
图 6　野葛幼叶悬浮细胞和培养液中异黄酮类
化合物总产量积累的动力学曲线
Fig. 6　 Dynamic curve of total yield of isoflavonces
in cell suspension cultures and medium
in leaves of P . lobata seedling
3　讨论
在自然条件下 ,完全成熟的野葛种子存在生理
性休眠现象 ,萌发率仅为 11% ,在人工气候箱中萌
发率也仅为 6% ～ 17% [7 ]。 本实验发现刚成熟的野
葛种子萌发率可达 66. 08% 。可以推测 ,野葛种子在
完熟过程中可能产生了抑制萌发的物质。
植物细胞次生代谢物的生产和细胞生长之间存
在偶联型、半偶联型和非偶联型 3种关系 [5 ]。比较图
2和图 3, 4可知 ,野葛幼叶悬浮细胞中葛根素的合
成与细胞的生长呈紧密偶联型 ,这与野葛子叶细胞
中葛根素的合成与细胞生长的关系相同 [3 ] ,因此 ,这
两个体系均不需要进行二步培养 (即根据细胞生长
和次生代谢物合成的不同需求 ,先将细胞在适于细
胞生长的培养基和环境条件下培养一段时间 ,再转
入适于次生代谢物生产的培养基中培养 [6 ] )。
在野葛幼叶细胞悬浮培养体系中 ,细胞培养物
和培养液中葛根素含量均在第 8天达最大值 ,此时
细胞和培养液中葛根素总产量为 103. 85 mg /L。野
葛悬浮细胞及培养液中总异黄酮类化合物积累的动
力学曲线与葛根素积累的动力学曲线存在一定差异
(图 5, 6)。细胞进入稳定期后 ,总异黄酮类化合物仍
在积累 ,第 10天时达最大值。 培养液中的总异黄酮
类化合物的含量则在第 5天既逐渐降低。细胞和培
养液中异黄酮类化合物的总产量在第 10天达最大
值 ,为 1. 59 g /L。 与刘慧丽 [ 3]所建立的野葛子叶细
胞悬浮培养体系相比较 ,野葛幼叶悬浮细胞中葛根
素和总异黄酮类化合物的含量均大大高于野葛子叶
悬浮细胞 ,后者的最高含量分别为 1. 34和 52. 4
mg /g;野葛幼叶悬浮细胞中葛根素和总异黄酮类化
合物的分泌能力也高于野葛子叶悬浮细胞 ,后者培
养液中的总异黄酮类化合物最高含量为 4. 8 mg /L,
葛根素则几乎测不到。与野生葛根相比 [3 ] ,野葛幼叶
悬浮细胞中总异黄酮类化合物的含量 ( 129. 05 mg /
g )已超过野生葛根中的总异黄酮类化合物的含量
( 68. 7 mg /g ) ,而葛根素含量 ( 7. 98 mg /g )则低于野
生葛根中的葛根素含量 ( 12. 6 mg /g )。 野葛幼叶悬
浮细胞及培养液中葛根素的总含量占异酮类化合物
总含量的 9. 22% ,子叶悬浮细胞中葛根素含量占总
异黄酮类化合物含量的 2. 55% ,而在野生植株中 ,
葛根素含量最高 ,占总异黄酮类化合物含量的
18. 34% [ 3]。由此可见 ,随着细胞类型和培养条件的
不同 ,细胞悬浮培养体系中异黄酮类化合物的种类
和比例与野生植株不同。
根据本实验结果 ,野葛幼叶细胞悬浮培养体系
优于子叶细胞悬浮培养体系 ,但该体系中葛根素含
量仍低于野生植株 ,由于葛根素是野葛的主要药用
成分 ,因此有必要从改进培养方式和代谢调控等方
面 [8, 9 ]对野葛幼叶细胞悬浮培养体系进行深入研究 ,
·656· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
以期提高其葛根素含量 ,为野葛细胞培养生产葛根
素的工业化提供技术支持。
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化橘红黄酮类成分的 HPLC指纹图谱研究
陈志霞 1 ,林　励 2 ,孙冬梅 3
( 1. 广东省药品检验所 ,广东 广州　 510180;　 2. 广州中医药大学 ,广东 广州　 510405;　 3. 广东省中医研究所 ,广东 广州
510095)
摘　要: 目的　研究不同品种和产地化橘红药材黄酮类成分的色谱指纹图谱分析方法。 方法　应用 HPLC法以柚
皮苷为参比 ,以相对保留时间和峰面积百分比为参数 ,建立 10个样品的 HPLC指纹图谱。 结果　标示出 30多个
峰 ,且不同品种化橘红 (毛橘红和光橘红 )的图谱存在较大的差异。 结论　该方法准确、重现性好 ,适用于化橘红药
材的质量控制与鉴定。
关键词: 化橘红 ;黄酮类成分 ;高效液相色谱 ;指纹图谱
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0657 05
HPLC fingerprint of flavonoids inExocarpium Citr iGrand is
CHEN Zhi-xia
1
, LIN Li
2
, SUN Dong-mei
3
( 1. Guangdong Institute fo r Drug Contro l, Guang zhou 510180, China;　 2. Guang zhou Univ ersity o f TCM ,
Guang zhou 510405, China;　 3. Guangdong Institute of Chinese Medicine, Guang zh ou 510095, China)
Abstract: Object　 To establish the HPLC fingerprint of f lav onoids in Exocarpium Citri Grandis
( ECG) . Methods　 HPLC fingerprint o f ten samples w ere established. The na ringin w as used as standard.
The relative mig ration time and the percentag e o f peak area were used as parameters. Results　 More than
30 peaks occurred on the HPLC fingerprint of f lav onoids of ECG. The fingerprints of C . grandis `Tomen-
tosa’ and C. grands had obivous dif ferences. Conclusion　 The method is simple and accura te w ith a good
reproducibility. It could be used fo r quali ty cont rol and identification of ECG.
Key words: Exocarpium Citri Grandis ( ECG) ; f lav onoids; HPLC; fing erprint
　　化橘红是芸香科植物化州柚 Citrus grandis
` Tomentosa’或柚 C. grandis ( L. ) Osbeck的未成
熟或近成熟的干燥外层果皮。具散寒、燥湿、利气、消
痰作用 ,临床用于治疗风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤
酒、呕恶痞闷等症 [ 1]。是广东名贵特产药材。来源于
植物化州柚的又名毛橘红 ,来源于植物柚的又名光
·657·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-11-19基金项目:广东省科技计划项目 ( A301020101)作者简介:陈志霞 ( 1975- ) ,女 ,湖北省武汉市人 ,硕士 ,研究方向为中药质量标准研究。 Tel: ( 020) 81863096