全 文 ：研究报告
Research Report
假定蛋白基因 XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关
蒋国凤 1,2 吴秋菊 3 韩路芬 3 姜伯乐 2,3*
1广西大学林学院,南宁, 530004; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530004; 3广西大学生命科学与技术学院,南宁,
530004
*通讯作者, jbl1971@gxu.edu.cn
摘 要 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是研究植物病原细菌和寄主互作
的模式细菌，鉴定其致病相关基因对于控制作物病害有重要的意义。XC2038在 Xcc 8004中注释为功能未
知的假定蛋白基因。本研究利用实验室前期构建的 XC2038基因的 Tn5gusA5插入突变体 164H09，并构建
了该突变体的互补菌株 C164H09，随后对各菌株的致病性及相关表型进行了检测。结果表明，164H09影响
Xcc 8004胞外多糖、泳动性及生物被膜的形成，影响在寄主满身红萝卜上的致病性，而突变体的互补菌株
能将以上表型恢复至野生型水平。综上可知，假定蛋白基因 XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关。
关键词 十字花科黑腐病菌,假定蛋白, XC2038,致病性
Hypothetical Protein Gene XC2038 is Involved in the Pathogenicity of
Xanthomonas campestris pv. campestris
Jiang Guofeng 1,2 Wu Qiuju 3 Han Lufen 3 Jiang Bole 2,3*
1 College of Forestry, Guangxi University, Nanning, 530004; 2 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-biore-
sources, Nanning, 530004; 3 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530004
* Corresponding author, jbl1971@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.033.000530
Abstract Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is a model bacterium for studying the interaction between
phytopathogen and hosts. Identification of virulent genes in Xcc has important significance of plant diseases
control. The gene XC2038 from Xcc 8004 was annotated to encode a hypothetical protein of unknown function. To
investigate the function of XC2038, the Tn5gusA5 insertion mutant 164H09 was employed, and the complementary
strain C164H09 was constructed as well in this study. The virulence and relative phenotype assay were tested. The
results demonstrated that mutant strain 164H09 affected the productivity of extracellular polysaccharide (EPS),
mobility, formation of biofilm, and pathogenicity on the host plant Chinese radish (Raphanus sativus var. radicula)
cv. Manshenhong; while the complementary strain C164H09 could restore to the wild type level. Altogether, these
data showed that XC2038 is a virulence gene of Xcc.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, Hypothetical protein, XC2038, Pathogenicity
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31260443)、广西创新研究团队项目(2014GXNSFFA118005)、广西自然科学基金
项目(2013GXNSFAA019097, 2013GXNSFBA019088)共同资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 33卷，第 3期，第 530-534页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.33, No.3, 530-534
植物病害会导致农作物大量减产和品质严重降
低，研究并揭示植物病原菌的致病分子机制，从而为
新型防病、治病策略的开发提供依据，是目前植物病
理学研究的热点。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas
campestris pv. campestris,简称 Xcc)是革兰氏阴性细
菌，能大范围侵染重要经济作物，导致黑腐病(Ryan
et al., 2011)。鉴定与十字花科黑腐病菌致病相关的基
因，对植物的防病、治病等具有极其重要的意义。
病原菌侵染寄主植物的致病过程是一个复杂的
过程，涉及接触、识别、侵染、繁殖、扩展最后显示症
状等过程(Katzen et al., 2000)。在这一过程中，需要病
原菌多个致病因子如效应物、毒素、脂多糖、胞外多
糖、胞外酶类、泳动性及病原菌的生物聚膜形成等的
协调作用。近年来在 Xcc中，鉴定了大量的致病相关
基因和致病生化因子(He et al., 2007)。在已知的致病
因子中，胞外酶以及胞外多糖等对于 Xcc 的致病都
是必须的，胞外多糖是许多植物病原菌的致病因子
之一(Katzen et al., 2000)。
目前，十字花科黑腐病菌致病变种 Xcc 8004基
因组测序、注释已完成(Qian et al., 2005)，在此基础上
发现编号为 XC2038的基因的开放阅读框(open read-
ing frame, ORF)所编码的蛋白注释为假定蛋白(hypo-
thetical protein)。假定蛋白是指因功能未知而未被鉴
定的新基因编码的蛋白。在 Xcc 8004的基因组中发
现注释为假定蛋白的 ORF较多，本实验室已鉴定到
被注释为假定蛋白且与十字花科黑腐病菌致病相关
的新基因，如 XC0241基因，即被鉴定为致病相关的
芋型效应物基因(Jiang et al., 2008; 2012)等。XC2038
基因在基因组上相邻的几十个基因都注释为假定蛋
白，对于 XC2038基因的功能目前鲜有报道。
本研究利用实验室前期构建的全基因组
Tn5gusA5转座子随机插入突变体库，选取 XC2038
基因的 Tn5gusA5转座子插入突变体，其插入突变体
编号为 164H09 (该编号为自命名编号,即十字花科黑
腐病菌突变体库的 XC2038 基因的 Tn5gusA5 插入
突变体的编号 )。构建突变体 164H09 互补菌株
C164H09进行致病等表型检测，确定 XC2038基因
与致病之间的关系。
1结果与分析
1.1 XC2038基因突变体 164H09的验证及互补菌株
的构建
对Tn5gusA5转座子插入突变体 164H09 (表 1)进
行 PCR验证。用转座子 Tn5上一条引物及上游基因
XC2037一条引物 SP1-F/XC2037-R (表 2)配对进行
PCR验证，产物预期大小 837 bp，结果见图 1A。
根据 XC2038的基因序列，设计互补引物XC203
8F/XC2038R (表 2)，以十字花科黑腐病菌 Xcc 8004
菌株总 DNA为模板，PCR扩增 XC2038的基因全长
序列，限制性内切酶 EcoR玉/BamH玉双酶切后将其克
隆至载体 pGEM-T (表 1)，测序。测序正确后 EcoR玉/
BamH玉消化，回收后连接至 pLARF6 (表 1)，互补
阳性克隆命名为 pCXC2038 (表 1)。接着将含有重
组质粒 pCXC2038的大肠杆菌与突变体 164H09三
亲本接合，得到互补阳性克隆命名为 C164H09 (表 1)。
C164H09阳性克隆菌株通过提取重组质粒 pCXC2038
进行 EcoR玉/BamH玉酶切验证，其质粒酶切验证产
物预期为约 22 kb的载体 pLARF6条带外，还有一个
960 bp的外源片段，见图 1B。
图 1 XC2038基因突变体 164H09及互补菌株 C164H09 的质
粒 pCXC2038酶切验证
注: A: M1: 100 bp DNA分子量标准; 1: PCR鉴定 164H09,用
SP1-F/XC2037-R引物(837bp); B: M2: 姿/Hind芋 DNA分子量
标准; M1: 100 bp DNA 分子量标准; 1: 重组质粒 pCXC2038
EcoR玉/BamH玉酶切验证(960 bp)
Figure 1 Verification of the mutant strain 164H09 of XC2038 (A)
and restriction map of plasmid pCXC2038 of the complementary
strain C164H09 (B)
Note: A: M1: 100 bp DNA ladder; 1: PCR identification of
164H09with primers SP1-F/XC2037-R (837bp);B:M2:姿/Hind芋
DNA Ladder; M1: 100 bp DNA Ladder; 1: plasmid pCXC2038
digested with EcoR玉/BamH玉 (960 bp)
表 1本研究的菌株和质粒
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study
菌株或质粒
Strains or plasmids
菌株
Strains
Xcc 8004
164H09
C164H09
质粒
Plasmids
pGEM-T
pLAFR6
pCXC2038
相关特征
Relevant characteristics
野生型菌株
Wild type strain, Rifr
Xcc 8004 的 Tn5gusA5
转座子插入突变体
Xcc 8004Tn5gusA5 ins-
ertionmutant, Rifr, Kanr
互补菌株, 164H09 含有
pCXC2038质粒
Complementary strain,
164H09 harboring pCX-
C2038, Rifr, Kanr, Tcr
克隆载体
Cloning vector, Amp
广寄主克隆载体
Broad-host-range cloning
vector, Tcr
pLAFR6质粒携带 XC2-
038基因
pLAFR6 plasmid harbo-
ring XC2038, Tcr
来源或参考文献
Source or reference
Daniels et al., 1984
本工作
This work
本工作
This work
Invitrogen公司
本实验室
Lab collection
本工作
This work
假定蛋白基因 XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关
Hypothetical Protein Gene XC2038 is Involved in the Pathogenicity of Xanthomonas campestris pv. campestris 531
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表 2本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物
Primers
SP1-F
XC2037-R
XC2038F
XC2038R
引物序列(5-3)
Primers sequence (5-3)
ccgccgaagagaacacagattta
agttcggaggaatcacgcgg
ggggaattc gcgccaagcaacggacagacg
gggggatcc aacacgacgccgaccagcacg
用途
Purpose
验证突变体 164
H09 (837bp)
Verify themutant
164H09 (837bp)
PCR扩增序列
(960 bp)
PCR amplificati-
on (960 bp)
1.2 XC2038影响十字花科黑腐病菌的胞外多糖尧泳
动性及生物聚膜形成
在获得突变体和互补菌株后，本研究随即检测
了 XC2038与相关致病生化因子的表型。结果表明，
XC2038 突变体菌株 164H09 影响胞外多糖的产量
(图 2A)、菌株的泳动性 (图 2B)及生物聚膜的形成
(图 2C)，而不影响胞外纤维素酶和淀粉酶的形成(数据
未列出)，而插入突变体的互补株 C164H09能很好的
恢复至野生型的水平。由于胞外多糖的产量、菌株的
泳动性及生物聚膜的形成都是病原菌重要的致病生
化因子(He et al., 2007)，这说明 XC2038与致病相关。
1.3 XC2038与致病性相关
致病生化因子的实验证实 XC2038与致病相关，
为了进一步证实这一结果，本研究进行了寄主植物的
致病性实验。将野生型菌株 Xcc 8004、XC2038基因插
入突变体 164H09和互补菌株 C164H09接种于新鲜
图 2胞外多糖,泳动性及生物聚膜表型检测
注: A:胞外多糖; B:泳动性; C:生物聚膜; 1:野生型菌株 Xcc
8004; 2:突变体菌株 164H09; 3:互补菌株 C164H09
Figure 2 Phenotype assay of EPS, mobility, and biofilm
Note: A: EPS; B: Mobility; C: Biofilm; 1: Wild type strain Xcc
8004; 2:Mutant strain 164H09; 3: Complementary strain C164H09
图 3致病性检测
Figure 3 Pathogenicity assay
NYG培养基，28℃下进行液体培养 15~18 h。用OD600=
0.001浓度菌液接种满身红萝卜，以 NYG培养基为负
对照，正对照选用十字花科黑腐病菌 Xcc 8004。
上述致病试验结果表明，XC2038基因的插入突
变体 164H09的致病性为零(图 3A)，而突变体的互
补株 C164H09能将降低的致病性很好的恢复到野
生型的水平。这说明 XC2038 基因是一个重要的致
病相关基因。
2讨论
十字花科黑腐病菌能在全球范围内侵染所有十
字花科植物，引起黑腐病(Ryan et al., 2011)。Mans-
field等(2012)列出植物病理学领域研究最为重要的
10种植物病原细菌，黄单胞菌占了 3种(X. oryzae pv.
oryzae; X. campestris pathovars; X. axonopodis patho
vars)。因此，鉴定病原菌致病相关基因及揭示致病
分子机理具有重要的意义。本研究发现 XC2038基因
与致病生化因子胞外多糖、细菌的泳动性及生物聚膜
的形成相关(图 2)，进一步研究发现 XC2038基因突变
体在寄主满身红萝卜上的致病性丧失(图 3)，说明
XC2038基因是一个 Xcc 8004重要的致病相关基因。
XC2038基因注释为保守假定蛋白(Heet al., 2007)。
生物信息学分析发现，XC2038 基因有一个 Plas-
mid_RAQPRD (plasmid protein of unknown function)
的功能域，仍属于功能未知的蛋白。XC2038位于十
字花科黑腐病菌基因组上的 XVR13基因岛上(He et
al., 2007)，该基因岛包含了 XC2002-XC2089共 81个
编码序列，左翼是 3个 tRNA基因和 1个整合酶基
因。该基因岛在十字花科黑腐病菌 ATCC 33913菌
株中是完全缺失的(Qian et al., 2005)。该基因岛上基
因的功能鲜有报道，仅有 XC2004和 XC2081被鉴定
为芋型效应物(He et al., 2007)。在氧化木糖无色杆
菌(Achromobacter xylosoxidans) NH44784-1996 菌株
(Jakobsen et al., 2013)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas
532
假定蛋白基因 XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关
Hypothetical Protein Gene XC2038 is Involved in the Pathogenicity of Xanthomonas campestris pv. campestris
aeruginosa) SCV20265菌株(Eckweiler et al., 2014)中，
XC2038 的同源基因被注释为假定芋型效应物 Hop
蛋白(putative type芋 effector hop protein)。XC2038是
否为芋型效应物及其致病分子机理需要做更深一步
的研究。
3材料与方法
3.1菌株及培养条件
本研究所使用的菌株、质粒见表 1。大肠杆菌
(Escherichia coli)所用培养基及培养条件参照文献(唐
菲菲等, 2011)，十字花科黑腐病菌的培养基为 NYG
(nutrient yeast glycerol) (Daniels et al., 1984)。抗生素用
量如下：利福平(rifampicin, Rif) 50 mg/L，卡那霉素
(kanamycin, Kan) 25 滋g/mL，四环素(tetracycline, Tc)
大肠杆菌用量为 15 mg/L，Xcc用量为 5 mg/L，氨苄青
霉素(Ampicillin, Amp) 100滋g/mL。
3.2引物、试剂与分子克隆
分子克隆及相关试剂如下：Taq DNA聚合酶(购
自 TaKaRa公司)、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(购
自 Promega公司)、PCR产物、质粒纯化及胶回收试
剂盒(购自 Omega公司)。根据网站 DBGET (http://
www.genome.jp/dbget-bin/)上提供核苷酸序列，按照
实验需要设计引物序列如下(表 2)。
互补菌株的构建：以十字花科黑腐病菌 Xcc 8004
菌株总DNA为模板，用互补引物 XC2038F/XC2038R
(表 2)对 X2038基因全长序列进行 PCR扩增，经 EcoR
玉/BamH玉双酶切，将其克隆至载体 pGEM-T (表 1)
中，挑选 1~3个克隆测序。测序后，选取序列正确的
克隆提取质粒，用内切酶 EcoR玉/BamH玉消化，回
收后连接至 pLARF6 (表 1)，互补阳性克隆命名为
pCXC2038 (表 1)。接着将含有重组质粒 pCXC2038
的大肠杆菌与 Xcc 8004三亲本接合，得到互补阳
性克隆为 8004/pCXC2038，命名为 C164H09 (表 1)。
C164H09阳性克隆菌株经 PCR验证后，提取重组质
粒 pCXC2038进行 EcoR I/BamH I酶切验证。
3.3表型检测
胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)检测：
将菌株接种到 10 mL 的 NYG 中，28℃摇床培养
16~18 h，分光光度计确定 OD600后，用 NYG培养基
调整各菌株 OD600一致。取 2 滋L的培养物，分别悬滴
于含 2%葡萄糖的 NYG平板上，28℃培养黑暗培养
3 d，将平板放置于培养箱外，室温放置培养 3 d，比较
菌落的形态大小对 EPS的产量进行比较；
游动性(mobility)检测：将菌株接种到 10 mL的
NYG中，28℃摇床培养 16~18 h，分光光度计确定
OD600后，用 NYG培养基调整各菌株 OD600一致。各
菌体取 5 滋L，点在 0.3%琼脂糖的 NYG平板上，28℃
静置培养 48 h后观察并照相记录。
生物被膜(Biofilm)检测：将菌株接种到 10 mL
的 NYG中，28℃摇床培养 16~18 h，分光光度计确定
OD600后，用 NYG培养基调整各菌株 OD600一致。按
照 10%的比例转接至 LB液体培养基内(国产指形瓶
培养)，28℃静置培养 5 d后，观察并记录结果。
3.4植株的致病性检测
本研究植株试验所采用的材料为满身红萝卜
(Raphanus sativus L. var. radiculus Pers.)。将待测 Xcc
菌株 28℃摇床培养 16~18 h后，用加有相应抗生素
的 NYG培养基作为空白对照，且以 NYG稀释菌液
至 OD600=0.001。选取 5叶期、苗龄一致的苗，用灭菌
的剪刀蘸取菌液，在距叶尖 1 cm处垂直中脉剪断，
剪断过程中停留约 5 s。接种后置于 25~30℃温室保
湿 24 h，然后 28℃常规培养。9~10 d后测量病班长
度，量取中脉“V”字形病斑的长度。致病性试验以野
生型 Xcc 8004作为对照菌株。试验至少重复 3次。
作者贡献
姜伯乐是项目的构思者及负责人，并负责论文
的修改和校对；蒋国凤完成数据分析和论文写作；吴
秋菊和韩路芬完成实验设计、实验研究。全体作者都
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31260443)、广
西创新研究团队项目(2014GXNSFFA118005)和广西
自然科学基金项目(2013GXNSFAA019097, 2013GX-
NSFBA019088)共同资助。
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