全 文 ：收稿日期：2012—02—21
基金项目：兴义民族师范学院一般项目“欠发达地区社区教育理论模式研究——以黔西南州发展社
区教育为例”（项目编号：11XYYRO8）。
作者简介：伍燕（1974— ），女，贵州兴义人，兴义民族师范学院化生系副教授，主要从事微生物学
教育与研究工作。
十字花科黑腐病菌，学名为野油菜黄单胞菌
野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv.
campestris，Xcc)，它引起受感染植物叶斑、叶枯和
萎蔫，进而腐烂减产，在全球范围内给农业生产造
成重大损失。
在完成了对 Xcc 8004菌株全基因组序列测
十字花科黑腐病菌基因 XC0596 的突变体构建及
其致病性研究
伍 燕
（兴义民族师范学院， 贵州 兴义 562400）
摘 要：十字花科黑腐病菌 (Xantyomonas campestris pv .campestris，简称 Xcc)，能引起十字花科植
物产生黑腐病。本研究采用自杀质粒 pK18Mob介导的整合突变体办法构建了十字花科黑腐病菌 Xcc
8004菌株中编码假设蛋白的基因 XC0596的极性突变体 pK0596。对突变体的致病力检测发现这一研究
表明，XC0596与十字花科黑腐病菌生长有关，并在致病中发挥重要作用。
关键词：十字花科黑腐病；XC0596；假定蛋白；致病力；过敏反应
文章编号：1009—0673（2012）02—0120—05 中图分类号：S432.4 文献标识码：A
Construction of XC0596 Gene Mutant in Xanthomonas Campestris Pv.campestris and
Research of Its Pathogenicity
WU Yan
( Xingyi Normal University for Nationalities，Xingyi，Guizhou 562400，China)
Abstract：Xanthomonas campestris pv.campestris（Xcc）is the causal agent of black rot disease of crucifers plant, resulting sig-
nificant reduction in yield and quality. A polar mutant pK0596 of coding the conserved hypothetical protein gene XC0596 of the Xcc
8004 wild strain was constructed by homologous integration with a suicide plasmid pK18mob.The mutant pK0596 showed signifi-
cantly reduced in virulence compared to wild- type strain, delayed the ability to induce a hypersensitive response (HR) in the nonhost
pepper plant (EWC- 10R).In addition, the growth of the mutant pK0596 in the minimal medium showed that its became smaller and
slowly than the wild- type Xcc 8004. This study suggests that the conserved hypothetical gene XC0596 is required for the growth of
Xcc 8004 in the minimal medium and plays an important role in virulence of this pathogen.
Keywords：Xanthomonas campestris pv.campestris；XC0596；hypothetical protein；virulence；HR
2012年 4月 兴义民族师范学院学报 Apr. 2012
第 2期 Journal of Xingyi Normal University for Nationalities No.2
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菌株和质粒
Strain or plasmid
Xcc 8004
PK0596
C0596PK
大肠杆菌 Escherichia
coli JM109
质粒 Plasmid
pRK2073
pK18mob
pLAFR3
相关特征
Relevant characteristics
十字花科黑腐病菌，野生型，Rif抗性菌株，Rifr
Xcc 8004中基因 XC0596发生整合突变，Kanr、Rifr
As Xcc 8004,but XC0596:: pK18mob, Kanr、Rifr
XC0596突变体的互补菌；Kanr、Rifr 、Tcr
PK0596 harboring C0596PK, Kanr、Rifr 、Tcr
RecA1,endA1,gyrA96,thi,supE44,relA1,
△（lac- proAB）/F[traD36,lacIq,lacZ△M15]
帮助质粒，Tra+,Mob+,ColE1, Spcr
Helper plasmid, Tra+,Mob+,ColE1, Spcr
黄单胞菌属中的自杀质粒，Kmr
Suicide plasmid in Xanthomonas,Kmr
广泛宿主载体，IncP,COS site,Mob,Tra,Tc
Broad host vector IncP,COS site,Mob,Tra,Tc
来源或参考文献
Source or reference
Turner et al.(1984)
本研究
This study
本研究
This study
Yanisch- Perron et al.(1985)
广西大学生科院基因功能
实验室
广西大学生科院基因功能
实验室
广西大学生科院基因功能
实验室
表 1 本研究中使用的菌株和质粒
定后，该菌被作为模式生物菌株来研究分子植物
病理学中植物与病原菌互作的致病过程。Xcc
8004 菌株全基因组中假定蛋白质基因占全部
ORF编码序列的 1/4，这些基因的功能研究是该
菌功能基因组研究的重要任务之一。为了确认这
些假定蛋白基因与病菌致病力的关系，本工作从
Xcc 8004菌株的构建了 XC0596的极性突变体，
基因组注释表明 XC0596编码一个假定蛋白，其
突变后显示可能与生长有关。其突变体在基本培
养基上生长稍有变化，致病力与野生型相比有所
降低，而胞外多糖产量，胞外酶活性、运动性均未
受影响。对比以往研究，本文选取了用带有全长
XC0596 基因序列的 pLAFR3 对 PK0596 进行功
能互补，其致病力和在基本培养基上生长均得到
恢复。这一研究表明，XC0596基因与野油菜黄单
胞菌生长有关，并在致病中发挥作用。
一、材料与方法
1.菌株和质粒
本研究中所用到的供试植物材料由广西大学
生命科学与技术学院何勇强教授实验室提供。本
研究中使用的菌株和质粒列于表 1（见表 1）。
2.酶和试剂
细菌总 DNA提取按 Chen and Kuo (1993)，质
粒 DNA的提取用碱裂解法提取，限制性内切酶、
T4DNA连接酶、转化及 PCR技术等操作方法参
照产品使用手册进行，上述产品购自 Promega公
司(中国上海)；质粒试剂盒、胶回收盒购自上海生
工生物工程有限公司；引物合成及 PCR产物测序
由上海捷瑞生物有限公司完成，本研究所用引物
列于表 2，其它试剂均为国产。
3.目的基因的整合突变构建及功能互补
根据广西大学生科院基因功能实验室的相关
基因操作实验指导手册，采用自杀质粒 pK18mob
来构建 XC0596基因的整合突变体。首先 PCR扩
增 XC0596基因内部 565bp的 DNA片段，将该片
段连接到 pK18mob自杀质粒上，将获得的重组质
粒电转入 JM109大肠杆菌中，经 PCR验证和酶切
验证，测序正确后挑阳性菌落用三亲本结合
（Sambrook and Russell,2001）的方法导入野生型
Xcc 8004中，然后筛选具有 Rif和 Km抗性的接
合子，对所获得的接合子采用 PCR加以验证，得
到非极性突变体 pK0596。
以野生型 Xcc 8004总 DNA为模板，设计相
应引物(见表 2)，PCR扩增 0596号基因 ORF包括
2012年 伍 燕 十字花科黑腐病菌基因 XC0596的突变体构建及其致病性研究 第 2期
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Xcc致病性检测使用中国满身红萝卜，通过
剪叶法给叶片进行接种。将待测菌株培养 16 h
后，用 NYGB(或无菌水)稀释到 OD600=0.001 或
0.1，用灭过菌的剪刀蘸取菌液，在距叶尖约 1 cm
处垂直于中脉将叶片剪断，停留约 3秒。每株萝卜
剪 2- 3片叶，保证每一待测菌至少剪 60片叶子
以上。黑暗保湿 24小时后，将萝卜放置于温度为
26℃左右，相对湿度约为 70%左右，光照时间为
24小时 /天(用荧光灯光源)的温室中。10天后量
取病斑长度并记录。
6.过敏性检测
本实验中过敏反应使用辣椒叶，将待测菌株
培养 16 h后，测定 OD600值，用无菌水将菌液稀
释到 OD600=0.001或 0.1，用无针头的注射器吸
取适量已调好浓度的菌液，在辣椒叶片背面的叶
肉中压渗，力度适中形成一个可见的浸润斑。接种
后的辣椒放在以荧光灯为光源的温室中不间断光
照，每 8小时观察并照相记录，24小时观察 3次，
即可观察到突变体 HR反应是否延时或无 HR反
应。
二、结果与分析
1. XC0596基因的生物学信息分析
根据基因组注释，Xcc 8004基因组中编号为
XC0596 的 ORF 是 位 于 基 因 组 713308 －
714579bp，全长 1272bp，注释为编码假设蛋白基
因。利用 SMART服务器 ( http://smart.embl- hei-
delberg.de)进行结构预测。根据预测结果，XC0596
衍生的蛋白序列是一个假设蛋白，对此进行的相
关研究几乎没有。
2. XC0596基因的突变体与互补菌株的构建
为研究 XC0596基因的功能，本研究构建了
XC0596的整合突变体(图 1)。
图 1自杀质粒构建 XC0596基因整合突变体示意
对整合突变体的表型及致病性进行检测，
与野生型 Xcc 8004相比较后，为了判断这些变化
是否由该目的基因造成的，可以对整合突变体进
行功能互补。验证正确的菌株即为互补菌株，可命
名为 C0596。互补实验结果表明，PK0596表型变
化是由 XC0596基因所致。
3.XC0596基因的突变体致病力降低
为了明确 XC0596基因是否与 Xcc的致病相
关，本研究将野生型菌株 Xcc 8004、C0596PK与
PK0596接种在含相应抗生素的 NYGB中，摇床
上游 200bp和下游 50bp总长度为 1305bpDNA片
段，测序正确后将其连接到广谱宿主质粒
pLAFR3，将获得的重组质粒化转入 JM109大肠
杆菌中，通过三亲本接合的方法导入突变体
pK0596，实现基因的功能互补。
4.突变体营养缺陷型检测
挑取适量菌体接入含有相应抗生素的培养基
中（Xcc用 NYGB），28℃摇床培养过夜后，测定
OD600值，将菌体浓度调节至 OD600=1.0，离心收
集菌体，用 MMX培养基重悬菌体，各取 2 μl点
在MMX平板上，28℃倒置培养 3 d后，观察突变
体是否可以正常生长，用野生型 8004作对照，实
验重复三次。
5.致病性检测
引物名称
Primer name
0596F
0596R
pK18mob18
C0596F
C0596R
引物序列（5＇－3＇）
Primer sequence（5＇－3＇）
CCCGAATTCGATCCTGTGCGAGTCAAGACTA
CCCGAATTCCAAGCTTCTCCCATGCCTTT
GCCAGTGCCAAGCTTGCATGCATGCC
CCCGAATTCGCTGAAAGGACAATGCTCTTC
CCCCTGCAGTTGCTACTGCATCGGTATAA
目的
Purpose
用于构建 PK0596
Used for constructing PK0596
特异引物 Specific primer
扩增 XC0596完整 CDS
For amplifying XC0596 intact CDS
表 2 本研究所用引物
2012年 兴义民族师范学院学报 第 2期
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培养 16 h左右，测定 OD600，将 OD600用 NYGB
调为 0.001。通过剪叶法接种到满身红萝卜，10 d
后测量病斑长度。
实验结果如图所示(图 2)，互补菌株 C0596形
成的病斑可以分别恢复至野生型菌株的 75.92%，
而 PK0596为 8004的 65.21%。表明 XC0596基因
与 Xcc 8004的致病相关。
A B
图 2 XC0596致病性检测
注：A为 Xcc菌株致病性检测；B为平均病斑
长度分析；误差棒表示标准偏差值；数据为 3次重
复结果
4.XC0596基因突变体在基本培养基上的生
长降低
为了检测 XC0596整合突变体与反式功能互
补菌在基本培养基（MMX）上的生长情况，以野生
型 Xcc 8004为对照进行检测。挑取适量菌体接入
含有相应抗生素的培养基中，28℃摇床培养过夜
后，测定 OD600值，将菌体浓度调节至 OD600=1.
0，离心收集菌体，用 MMX培养基重悬菌体，各取
2μl接种在无抗生素的 MMX平板上，28℃倒置
培养 3 d后，观察突变体是否可以正常生长，用野
生型 8004作对照，实验重复三次。
实验结果（图 3），XC0596突变体在MMX平
板上延后生长，表明 XC0596突变体有可能与营
养缺陷型相关。
图 3 XC0596突变体MMX培养基平板检测
将重悬菌液浓度调到 OD600=1.0，按 10%的
比例转接至含 100 mL无抗生素的 MMX培养液
中，28℃摇床培养 5 d。每隔 12小时测定 OD600
值，以时间为横坐标，OD600值为纵坐标作图，每
一待测菌体设三个重复，实验重复三次。实验结果
(图 4 )显示突变体的生长情况与野生型相比略有
下降，而互补菌与野生型相比基本一致。表明
XC0596突变后对菌群的正常生长繁殖有一定影
响。
图 4 XC0596 突变体在 MMX培养基中的生
长曲线
5.XC0596引发的过敏反应
野生型 Xcc 8004能在寄主植物上引起致病，
而在非寄主植物辣椒 ECW- 10R上则诱导产生过
敏反应，过敏反应常被用于检测 III型分泌系统的
功能或者 III型效应物的合成是否受到影响。将突
变体 XC0596与各互补菌与野生型通过压渗的方
法接种在辣椒叶片背面上，接种后 8- 24h观察比
较引发的 HR反应是否有差异。实验结果表明，过
敏反应延时，说明 XC0596突变对效应物分子的
分泌是有影响的。（图 5）
图 5 XC0596 的过敏反应试验 1：ddH2O；2：
8004；3：C0596PK；4：PK0596
三、讨论
根据基因组注释，Xcc 8004基因组中编号为
XC0596 的 ORF 是位于基因组 713308－714579
bp，全长 1272 bp，注释为编码假设蛋白基因，经检
测发现其在胞外多糖、胞外淀粉酶、蛋白酶、胞外
纤维素酶合成上无变化，但在基本培养基上生长
延迟并稍有变小，其突变体致病力与野生型 8004
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相比下降至 65.21%。本研究用 pLAFR3去互补了
这个菌，发现其在致病力和在基本培养基上和检
测均有恢复，反式互补说明这个 ORF突变后与致
病力降低是有关的。
将其突变体在基本培养基上检测，实验结果
显示与野生型和互补菌相比，其菌落生长变缓并
稍显小，进一步检测了在基本培养液中的生长曲
线，结果也显示突变生长有变化，推测 XC0596也
可能与营养缺陷有关。
通过对突变体 PK0596在非寄主辣椒叶片上
的过敏检测，结果显示过敏反应延时，说明该基因
突变可能与 III型效应物的分泌有关。
上述结果表明，假定蛋白质基因 XC0596与
十字花科黑腐病菌生长有关，并在致病中发挥重
要作用。
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责任编辑：周丽
2012年 兴义民族师范学院学报 第 2期
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