全 文 ：基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 5期，第 1007-1012页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.5, 1007-1012
研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因 hpaS的 XC_2486基因鉴定
叶玉云 1,2* 朱艳宁 1,2 杨国奎 1,2
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, 437170796@qq.com
摘 要 十字花科黑腐病菌 hpaS影响致病性、HR，其编码产物分别与 HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了
深入了解 hapS的表达调控机制，本研究将 hpaS的启动子与蔗糖敏感基因 sacB融合，构建了 hpaS的表达报
告质粒 pL6sacB3670，并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株 8004中，获得了报告菌株 8004/pL6sacB3670。然
后利用转座子 EZ:Tn5对该报告菌株进行诱变，筛选到一株转座子 EZ:Tn5插入基因组的克隆。通过测序定
位分析发现该克隆是由转座子 EZ:Tn5插入到编号为 XC_2486的 ORF所产生的。然后将 hpaS启动子与报
告基因 gusA 融合的报告质粒 pL6GUS3670分别导入野生型 8004和 XC_2486的突变体 239C02中，测定比
较 pL6GUS3670的 GUS表达水平，结果显示在突变体背景下 GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这
表明 XC_2486正调控 hpaS的表达。对 XC_2486突变体 239C02进行致病性和过敏反应检测发现，XC_2486
与致病性相关，与 HR无关。
关键词 十字花科黑腐病菌, hpaS, 调控
Identification of Regulation Gene of Pathgennicity-related Gene hpaS in
Xanthomonas campestris pv. campestris
Ye Yuyun 1,2* Zhu Yanning 1,2 Yang Guokui 1,2
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresource Conservation
and Utilization, Nanning, 530005
* Corresponding author, 437170796@qq.com
DOI: 10.13417/j.gab.033.001007
Abstract Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is the causal agent which cause the black rot disease in
cruciferous plants worldwide. In the previous work, we had found hpaS is involved in virulence, HR. In this work,
the reporter plasmid pL6sacB3670 was constructed with the promoter region of hpaS fused to the coding region of
sacB, and transferred into Xcc wild-type strain 8004. The reporter strain 8004/pL6sacB was mutagenized randomly
by the transposon EZ:Tn5 and one clone was identified to be inserted in the Xcc genome by transposon EZ:Tn5.
Then we identified that the clone was discruption of in the open reading frame XC_2486, which was annoated as
galactose-binding protein regulator. To futher confirm the regulation of XC_2486, the reporter plasmid
pL6GUS3670 was constructed with hpaS fused to the coding region of gusA and was introduced into the wild-srain
8004 and XC_2486 mutant srain 239C02 respectively. The GUS activity of pL6GUS3670 in the XC_2486 mutant
background was significantly slower than in the wild-type background. These results show that XC_2486 regulate
the expression of hpaS positively. The pathogenicity and hypersensitive response (HR) of XC_2486 mutant 239C02
were determined and the result show that XC_2486 is involved in pathogenicity but not involved in HR.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, hpaS, Regulation
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31171206)项目资助
十字花科黑腐病菌，学名野油菜黄单胞菌野油
菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris ,
Xcc)，是研究植物病原菌与植物分子互作的模式菌
之一。该病原菌能在全球范围内导致十字花科植物
产生黑腐病，危害农业生产。人们对 Xcc致病的分子
机理作了较深入系统的研究，试图为发展控制植物病
害的新方法提供理论依据。Xcc 中的三个菌株
AT33913 (da Silva et al., 2001)、8004 (Qian et al., 2005)、
B100 (Vorh觟elter et al., 2008)已经完成了全基因组测
序，这为人们在基因组水平上研究 Xcc 的致病机理
提供坚实的基础。同时，一些致病基因、致病相关基
因的的鉴定及其作用机理的研究使人们对 Xcc 致病
机理有了进一步的认识。
在前期工作中，本课题组从 Xcc8004中鉴定了
一个双组分系统 HpaR2/HpaS与致病相关。HpaR2
(XC_3669)和 HpaS (XC_3670)分别编码一个反应调
控蛋白和一个组氨酸激酶感受蛋白。HpaR2和 hpaS
在基因组中的位置相邻，转录方向相同，组成一个操
纵子，但 hpaS 还另有一个自身的启动子，可能存在
自己独立的表达方式。而 HpaS基因突变后，对寄主
的致病性以及对非寄主的过敏反应几乎丧失，且
hpaS调控致病关键基因 hrpG及芋型效应物基因的
表达，其编码产物与 HrpG形成了另一个双组分系统
(Li et al., 2014)。
为了深入了解 hpaS的表达调控机制，本研究通
过将包含有 hpaS 的启动子 DNA片段与报告基因
sacB融合，构建表达报告质粒，并将报告质粒导入
8004菌株，通过对 8004报告菌株的诱变，筛选到一
个编号为 XC_2486的基因可能调控 hpaS的表达。然
后将包含有 hpaS 的启动子 DNA片段与报告基因
gusA 融合，构建了 hpaS的报告质粒，通过比较 hpaS
报告质粒的表达，进一步证实了 XC_2486正调控
hpaS的表达。
1结果与分析
1.1 EZ:Tn5转座子诱变法筛选 hpaS的调控基因
由于 sacB基因的表达，产生的高分子果聚糖对
细胞具有毒害作用，因而当携带有 sacB基因的 Xcc
菌株在 sacB基因表达时在含蔗糖的培养基中生长
会受到抑制，而在 sacB 基因不表达或表达量极低
时，Xcc 才能在含蔗糖的培养基中生长繁殖。本研究
是根据 sacB基因的这一特性来筛选调控 hpaS表达
的基因。
将 PCR扩增的 hpaS 上游 514 bp同源片段(包括
ATG)与 sacB融合，克隆到质粒 pLAFR6上，获得的
报告质粒 pL6sacB3670 导入 Xcc 野生型菌株 8004
中，获得报告菌株 8004/pL6sacB3670。经检测，由于
sacB的表达，使报告菌株 8004/pL6sacB3670不能在
含蔗糖的培养基中生长。然后采用转座子 EZ:Tn5对
该菌株进行诱变，并在含 5%的蔗糖培养基中筛选，
获得了一个转座子 EZ:Tn5可能插入基因组的克隆。
为了鉴定这一克隆中转座子 EZ:Tn5 的插入
位点，我们将突变体的总 DNA酶切后，让 DNA片
段自身连接，并转化到 E. coli 中，利用 EZ:Tn5 转
座子携带 Kmr抗性基因这一特点，分离到 EZ:Tn5
转座子及其在 Xcc 中插入位点的旁侧 DNA片段。
通过对 EZ:Tn5旁侧片段的测序，发现 EZ:Tn5转
座子插入在基因组中 3 015 972 bp至 3 015 973 bp
之间。根据 Xcc8004 基因组注释，3 015 932 bp 至
3 016 903 bp 之间的 DNA 序列组成一个编号为
XC_2486 (NCBI-GeneID: 3381020)的 ORF。XC_2486
可能调控 hpaS的表达。XC_2486的编码产物为半乳
糖结合蛋白调控子。
1.2 XC_2486正调控 hpaS的表达
为了进一步证实 XC_2486 是否参与调控 hpaS
的表达，本研究将含有 hpaS启动子的 514 bp DNA
片段与 gusA 的 ORF融合，并克隆到 pLAFR6上，获
得了报告质粒 pL6GUS3670。将 pL6GUS3670通过
三亲本接合分别导入 XC_2486的 Tn5gusA突变体
239C02和野生型菌株 8004，获得菌株 239C02/pL6-
GUS3670 和 8004/pL6GUS3670。将报告菌株在
NYGB过夜培养后，调 OD600为 0.1，接种在含 X-gluc
(5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚葡萄糖苷)的 MMX平板上，
培养 3d观察发现，菌株 239C02/pL6GUS3670形成
的菌落淡蓝色，菌株 8004/pL6GUS3670形成的菌落蓝
色较深(图 1A)。为了进一步定量比较 pL6GUS3670
在野生型和突变体 239C02背景下的GUS表达水平，
将菌株接种在MMX中培养到 36 h、48 h时，测定两
菌株的 GUS活性(图 1B)。报告质粒 pL6GUS3670的
GUS在 36 h、48 h的表达水平在 XC_2486的突变体
背景下与在野生型背景下相比，分别降低了 59.1%、
63.3%。XC_2486的突变降低了 hpaS的表达水平表明
XC_2486正调控 hpaS的表达。
1.3 XC_2486与 Xcc致病性有关
将 Xcc 菌株的过夜培养物稀释后，剪叶接种于
满身红萝卜叶片上，10 d后，测定叶片病斑长度，结
果如图 2所示。XC_2486突变体 239C02致病引起的
病斑长度为 3.99 mm，与野生型 8004相比，降低了
59.1%。这表明 XC_2486与 Xcc的致病性相关。
十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因 hpaS的 XC_2486基因鉴定
Identification of Regulation Gene of Pathgennicity-related Gene hpaS in Xanthomonas campestris pv. campestris 1008
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
1.4 XC_2486与 HR 无关
将 Xcc的过夜培养物稀释后，压渗接种于辣椒
ECW-10R叶背面，光照 8 h后观察，结果如图 3所
示。XC_2486突变体 239C02与野生型 8004都在 8 h
左右出现 HR。这表明 XC_2486不影响 HR。
图 1 pL6GUS3670报告质粒在不同背景下的表达
注: A: 菌株 8004/pL6GUS3670, 239C02/pL6GUS3670 分别接
种在含 X-gluc的MMX平板上,培养 3 d; B:菌株 8004/pL6G-
US3670, 239C02/pL6GUS3670 分别接种在 MMX培养基, 摇
床培养 36 h, 48 h时测定 GUS活性
Figure 1 GUS activity of pL6GUS reporter plasmid in Xcc8004
and mutant
Note: A: Reporter strain 8004/pL6GUS3670 and 239C02/pL6G-
US3670 was respectively innocated in MMX medium plus
X-gluc and obseved three days later; B reporter strain 8004/pL6-
GUS3670 and 239C02/pL6GUS3670 was respectively innocated
in MMX medium and measure GUS activity in the 36 hours and
48 hours
2讨论
实验室前期工作中对 hpaS进行了一系列研究，
发现 hpaS 影响致病性、HR，其编码产物分别与
HpaR2、HrpG 形成了双组分系统。为了深入了解
hpaS的表达调控机制，本研究通过将 hpaS的启动子
与蔗糖敏感性基因 sacB融合构建表达报告质粒，并
导入 Xcc 野生型菌株 8004，然后利用 EZ:Tn5转座
子对报告菌株进行诱变，鉴定了 Xcc 基因组中编号
为 XC_2486的基因调控 hpaS的表达。
根据 KEGG基因组(http://www.genome.jp/dbget-
bin/)注释，XC_2486编码半乳糖结合蛋白调控子，是
LysR家族调控因子。LysR家族调控子可受代谢物阻
遏或诱导，激活或阻遏基因的表达。XC_2486编码
323个氨基酸，其蛋白质预测分子量为 35 431.1，等
电点为 9.04 (http://web.expasy.org/protparam/)。此外，
分析 XC_2486的蛋白结构域发现其含有能与 DNA
结合的保守的 HTH 基序、Peptidase 基序以及能与
底物作用 LysR 底物结合结构域(图 4)。我们推测
XC_2486的底物结合结构域可能通过与某种物质结
合，促使 XC_2486蛋白通过 HTH基序与 hpaS的启
动子作用，激活 hpaS的表达。通过对 XC_2486突变
体的致病性、HR检测，我们发现 XC_2486与致病性
相关，与 HR无关。XC_2486可能不参与芋型分泌系
统的调控，可能通过调控 hpaS表达进而调控相关致
病基因而影响致病性。
3材料与方法
3.1本研究所用菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒见表 1。
图 2致病性检测
Figure 2 Test of virulence
图 3过敏反应检测
Figure 3 Test of HR
图 4 XC_2486结构域分析
Figure 4 Pfam of XC_2486 from SMART
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十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因 hpaS的 XC_2486基因鉴定
Identification of Regulation Gene of Pathgennicity-related Gene hpaS in Xanthomonas campestris pv. campestris
3.2菌株培养
Xcc 液体培养用 NYGB培养基(1 L中含蛋白胨
5.0 g,酵母粉 3.0 g,甘油 20.0 g, pH=7.0)，28℃ 200 r/min
摇床培养 16~20h;固体培养用NYGA培养基(NYGB+
1%琼脂粉)，28℃倒置培养。E. coli液体培养用 LB培
养基(1 L中含胰蛋白 10.0 g,酵母粉 5.0 g, NaCl 10.0 g,
葡萄糖 1 g, pH=7.0) 37℃ 200 r/min摇床培养 12 h；
固体培养用 LA培养基(LB+1%琼脂粉)。
MMX培养基(1 L中葡萄糖 5.0 g, 柠檬酸三钠
1.0 g, 硫酸铵 2.0 g, 磷酸氢二钾 4.0 g, 磷酸二氢钾
6.0,七水硫酸镁 0.2 g)。
抗生素用量参考文献(陆光涛等, 2008)。
3.3分子操作
质粒 DNA的碱裂解法提取、总 DNA快速提取
等参考文献(Chen and Kuo, 1993)进行，限制性内切
酶酶切、连接、DNA纯化按试剂盒说明书进行操作。
所用引物由华大基因公司合成。DNA测序由华大基
表 1本研究所用菌株及质粒
Table 1 Strains and plasmids of this work
菌株及质粒
Strains and plasmids
E. coli
JM109
DH5琢
Xcc
Xcc8004
8004/pL6sacB3670
239C02
8004/pL6GUS3670
239C02/ pL6GUS3670
Plasmid
PRK2073
pL6GUS
pL6sacB
pL6sacB3670
pL6GUS3670
相关特征
Characteristics
RecAl, endAl, gyrA96, thi, supE44, relA1,△(lac-proAB)/F
[traD36, lacIq, IacZ△M15]
渍80吟lacZM15 deoR, recA1, endA1, hsdR17
十字花科黑腐病菌野生型菌株 Rifr
Xanthomonas campestris pv. campestris, Rifr
8004中含有 pL6sacB3670, Rifr, Tetr
8004 harboring pL6sacB3670, Rifr, Tetr
8004中 XC_2486::Tn5gusA5, Rifr, Kmr
As 8004 but XC_2486::Tn5gusA5, Rifr, Kmr
8004中含有 pL6GUS3670, Rifr, Tetr
8004 harboring pL6GUS3670, Rifr, Tetr
239C02中含有 pL6GUS3670, Rifr, Kmr, Tetr
239C02 harboring pL6GUS3670, Rifr, Kmr, Tetr
帮助质粒, Tra+, Mo+, CoLE1, Spcr
Helper plasmid, Tra+, Mo+, CoLE1, Spcr
无启动子的 pLAFR6上克隆有 gusA片段 Tetr
Promoteless plasmid pLAFR6 congtaining gusA, ORF fragment, Tetr
pLAFR6的 Kpn玉/Pst玉位点克隆有 1 463 bp sacB片段, Tetr
Promoteless plasmid pLAFR6 congtaining 1 463 bp sacB ORF fragment, Tetr
pL6sacB上克隆有 514 bp的 hpaS启动子去片段, Tetr
pL6sacB congtaining 514 bp promoter fragment of hpaS, Tetr
pL6GUS上克隆有 514 bp的 hpaS启动子区片段
pL6GUS congtaining 514 bp promoter fragment of hpaS, Tetr
来源
Resources
Yanisch-Perron et al., 1985
Gibco BRL company
实验室
Laboratory
本工作
This work
实验室
Laboratory
本工作
This work
本工作
This work
Leong et al., 1982
实验室
Laboratory
姜伯乐等, 2008
本工作
This work
本工作
This work
因公司完成。所用限制内切酶、T4 连接酶等购自
Promega公司。DNA纯化试剂盒购自天根公司。
3.4报告质粒的构建
以 Xcc8004 总 DNA 为模板，PCR 扩增一段
514 bp的 hpaS的上游同源片段(包含 ATG)。所用引
物是根据 Xcc 8004基因组注释，用 Vector NTI 10.0
设计，在引物两端选择合适的酶切位点 EcoR玉 /
BamH玉。引物为(3670PF: 5-CCGGAATTCAAGG
TGCGCGTCATCAGC-3; 3670PR: 5-ACAGTTGGA
TCCCATCGGCCTAGTCCTGGC-3)。将 PCR 扩增
所获得的 DNA片段经 EcoR玉/BamH玉酶切后，分别
克隆到 pL6sacB和 pL6gus质粒 EcoR玉/BamH玉位
点上，获得报告质粒 pL6sacB3670和 pL6GUS3670。
pL6sacB 和 pL6GUS 分别是将不含起始密码子的
1 463 bp的报告基因 sacB 和 1 832 bp 的报告基因
gusA 分别克隆在 pLAFR6上所产生的重组质粒。报
告基因 sacB和 gusA 分别编码果聚糖蔗糖转移酶和
茁- 葡糖苷酸酶。
1010
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
3.5 EZ:Tn5转座子诱变法
将报告质粒 pL6sacB3670通过三亲本接合的方
法导入 Xcc 野生型菌株 8004 中，获得报告菌株
8004/pL6sacB3670。而报告菌株中 sacB基因的表达，
使其不能在含蔗糖的培养基中生长。将报告菌株
8004/pL6sacB3670制备成感受态细胞，然后用转座
子 EZ:Tn5通过电脉冲转化对报告菌株进行诱变，并
在含 5%的蔗糖以及含 Rifr、Kmr、Tetr的 NYGA培养
基中筛选，经引物 sacBF/R (sacBF: 5-ATCAAAAAGT
TTGCAAAACAAG-3; sacBR: 5-AAATAAAAGAA
AATGCCAATAG-3)、3670PF/PR PCR验证，筛选转
座子 EZ:Tn5可能插入基因组的克隆。
将转座子 EZ:Tn5可能插入基因组的突变体的
总 DNA经 EcoR玉酶切后，让 DNA片段自身连接，
转化到 E. coli 中，在含 Kmr的 LA培养基中筛选，经
引物 Tn5-F/Tn5-R (Tn5-F: 5-ACGAAACACGGAA
ACCGAAGAC-3; Tn5-R: 5-AACATCATTGGCAA
CGCTACCT-3)PCR验证后，获得含 EZ:Tn5转座子
及其在 Xcc中插入位点的旁侧 DNA片段，然后用转
座子两端互补的寡核苷酸引物对转座子旁侧序列进
行测定(引物由 Epicentre公司 EZ-Tn5TM
TnpTransposomeTM Kit提供)。将所获得的两段核苷酸
序列与 NCBI (http://www.nibi.nlm.gov/)中的 Xcc8004
全基因组序列进行相似性比较，以确定转座子 EZ:
Tn5的插入位点。
3.6 茁-葡糖苷酸酶(GUS)活性检测
带有重组报告质粒的 Xcc 菌株在 NYGB 培养
基中培养 16 h后，调 OD600为 1.0，按 10%接种量转
接至 100 mL MMX培养基中，摇瓶培养至一定的时
间点，取 1 mL菌液，按 Henderson等(1985)所描述的
方法，以对硝基苯基 -茁-D- 葡萄糖醛酸苷(PNPG)为
反应底物，测定 GUS活性。用 1010个活菌数(cfu)所
显示的酶活性来比较菌株间的 GUS活性差异。
3.7致病性试验
供试植物为满身红萝卜苗(Raphanus sativus L.
var. radiculus Pers)。将 Xcc 菌株在 NYGB培养基中
培养过夜后，将菌液浓度调 OD600为 0.001，用灭菌的
手术剪蘸取少量菌液，选择健康叶片，在距离叶尖约
1 cm处垂直于中轴叶脉处缓慢地剪断叶尖。每个菌
株需接种 30片叶以上，接种后保湿 24 h，然后每天
25~32℃光照 12 h。10 d后，摘取叶片，测量病斑长度
(危广宁等, 2008)。
3.8 HR试验
供试植物为非寄主植物辣椒 ECW-10R。将 Xcc
菌株在 NYGB培养基中培养过夜后，将菌液浓度调
OD600为 0.1，用灭菌的无针头的注射器吸取适量菌
液压渗接种于辣椒 ECW-10R的叶背面，形成一个可
见的浸润斑。接种后保持相对湿度 80%，并置于荧光
灯下(8h/16h)照射(危广宁等, 2008)。
3.9序列的生物信息学分析
用 KEGG (http://www.genome.jp/dbget-bin/)、NCBI
(http://www.nibi.nlm.gov/)、SMART (http://smart.embl-
heidelherg.de/)等网站进行序列比对以及结构域分析。
作者贡献
叶玉云主要完成实验设计、操作及论文的撰写；
朱艳宁和杨国奎参与部分实验及论文修改。
致谢
本研究是在国家自然科学基金(31171206)项目
的支持下完成。感谢陆光涛研究员对论文的修改，
并衷心感谢所有给本研究提供帮助与支持的老师
和同学们。
参考文献
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